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    新型冠狀病毒核酸檢測實(shí)驗(yàn)室污染的監(jiān)測與分析

    2021-12-08 21:51:27黃日昇李軼春陳文雄鄧家慶彭云娟
    中國典型病例大全 2021年13期
    關(guān)鍵詞:環(huán)境監(jiān)測

    黃日昇 李軼春 陳文雄 鄧家慶 彭云娟

    摘要:目的 通過對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)核酸檢測實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境SARS-CoV-2核酸監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)潛在污染源并采取相應(yīng)有效措施,消除或避免核酸檢測實(shí)驗(yàn)室污染。方法 在2020年5月20日至2020年5月23日北海市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科SARS-CoV-2核酸檢測假陽性結(jié)果突發(fā)增多期間,對該實(shí)驗(yàn)室實(shí)行去污染源和環(huán)境SARS-CoV-2監(jiān)測。結(jié)果 試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備處理區(qū)環(huán)境監(jiān)測點(diǎn)SARS-CoV-2核酸檢測陰性;擴(kuò)增及產(chǎn)物分析一區(qū)為產(chǎn)物污染,環(huán)境監(jiān)測點(diǎn)均檢測出SARS-CoV-2核酸陽性,對操作臺面、PA7600熒光定量基因擴(kuò)增儀擴(kuò)增倉、分析區(qū)空氣進(jìn)行14天SARS-CoV-2核酸監(jiān)測,污染物清除期其CT值分別為37.0±1.41,36.8±2.03和37.0±2.16,污染物清除后觀察期CT值分別為45.8±0.38,45.7±0.75和45.8±0.38,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.75,10.28,11.53 均P<0.05)。結(jié)論 SARS-CoV-2核酸檢測實(shí)驗(yàn)室制定并落實(shí)環(huán)境監(jiān)測制度,行之有效的預(yù)防或清除污染措施和應(yīng)急預(yù)案對病原微生物安全防護(hù)極其重要。

    關(guān)鍵詞:新型冠狀病毒核酸檢測;實(shí)驗(yàn)室污染 ;環(huán)境監(jiān)測

    【中圖分類號】G644.5?【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A?【文章編號】1673-9026(2021)13-02

    新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是一種新型β屬冠狀病毒,單鏈 RNA病毒,是引發(fā)新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)主要病原微生物,基因組序列約由29kb構(gòu)成,擁有10個基因,可有效編碼10個蛋白[1]。據(jù)國家衛(wèi)健委公布的《新型冠狀病毒的肺炎診療方案(試行第七版)》[2],實(shí)時熒光RT-PCR是SARS-CoV-2確診病例的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一,因其具有高敏感性,特異性好,操作簡單等特點(diǎn),成為了疫情暴發(fā)期間最主要的實(shí)驗(yàn)室檢測手段,廣范應(yīng)用于各種病原學(xué)檢測領(lǐng)域[3-6],但實(shí)驗(yàn)室也極容易引起污染。依據(jù)《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》[7]、《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》(GB19489)[8]、《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南(第二版)》[9] 和《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南(第四版)》[10] 等要求,SARS-CoV-2核酸檢測必須確保生物安全。本文旨在通過對SARS-CoV-2核酸檢測實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境SARS-CoV-2核酸監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)潛在污染源并采取相應(yīng)有效措施,消除或避免核酸檢測實(shí)驗(yàn)室污染,為SARS-CoV-2核酸檢測提供建設(shè)性意見。

    1材料與方法

    1.1采樣對象 于2020年5月20日至2020年5月23日北海市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科SARS-CoV-2核酸檢測假陽性結(jié)果突發(fā)增多期間,對實(shí)驗(yàn)室試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備處理區(qū)和擴(kuò)增及產(chǎn)物分析一區(qū)環(huán)境監(jiān)測點(diǎn)進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測分析。

    1.2儀器與試劑?中山達(dá)安DA7600、天隆GENTIER 96熒光定量基因擴(kuò)增儀、Auto-pure32A型全自動核酸提取儀、鑫貝西生物安全柜、上??岛蘃-1微型混合器、LX-300微型離心機(jī);中山達(dá)安新型冠狀病毒核酸檢測試劑、廣州賽百純核酸提取試劑、H3-1采樣管、帶過濾芯吸頭。

    1.3方法

    1.3.1 采樣方法 于SARS-CoV-2核酸檢測假陽性結(jié)果突發(fā)增多期間,實(shí)驗(yàn)活動與環(huán)境消毒前,物表監(jiān)測點(diǎn)使用病毒采樣拭子蘸取H3-1采樣液,對操作臺面、移液器表面及吸嘴、儲存冰箱、傳遞窗把手、核酸提取儀、熒光定量基因擴(kuò)增儀擴(kuò)增倉、生物安全柜內(nèi)壁反復(fù)涂抹,然后采樣拭子回收洗脫至H3-1采樣管;空氣監(jiān)測則使用空氣沉降法,打開H3-1采樣管蓋子使采樣液暴露于固定監(jiān)測位置30Min。

    1.3.2檢測方法 按照SARS-CoV-2核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)程序,對核酸實(shí)驗(yàn)室所有工作區(qū)環(huán)境監(jiān)測點(diǎn)進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測,結(jié)合CT值和熒光曲線判定結(jié)果,內(nèi)源性檢測系統(tǒng)(內(nèi)標(biāo),IC)曲線S型擴(kuò)增,ORF1ab和N基因同時擴(kuò)增(CT≤40),結(jié)果為SARS-CoV-2核酸陽性;ORF1ab和N基因無擴(kuò)增(CT≥45),結(jié)果為SARS-CoV-2核酸陰性;ORF1ab和N基因無明顯擴(kuò)增(CT40-45),結(jié)果為檢測灰區(qū),需要重測復(fù)查;ORF1ab或N基因單通道擴(kuò)增(CT≤40),重新采集標(biāo)本復(fù)查,復(fù)查結(jié)果一致時,報告SARS-CoV-2 ORF1ab或N單基因核酸陽性,復(fù)查結(jié)果為雙基因均陰性時,報告SARS-CoV-2核酸陰性;IC 曲線無S型擴(kuò)增,需要重測或者重采標(biāo)本測定[11]。所有該實(shí)驗(yàn)室SARS-CoV-2核酸檢測陽性標(biāo)本均按要求轉(zhuǎn)送至北海市疾病預(yù)防控制中心核酸實(shí)驗(yàn)室再次復(fù)核。

    1.3.3污染源清除方法?每天3次,連續(xù)7天清洗空調(diào)過濾網(wǎng),對儀器設(shè)備(如基因擴(kuò)增儀擴(kuò)增倉與外表、生物安全柜內(nèi)壁、核酸提取儀、移液器等)75%酒精擦拭,500 -1000mg/L的84消毒液擦拭工作臺面、冰箱、傳遞窗把手,拖擦地面,作用10 min后用清水擦拭工作臺面等物表,打開實(shí)驗(yàn)室紫外燈照射≥1 h[12-13],保持開窗通風(fēng)排氣。

    1.3.4污染源清除驗(yàn)證方法 對實(shí)驗(yàn)室污染區(qū)環(huán)境監(jiān)測點(diǎn)連續(xù)14天SARS-CoV-2核酸監(jiān)測,連續(xù)7天檢測SARS-CoV-2核酸陰性,判定為污染源清除成功,實(shí)驗(yàn)室可正常使用運(yùn)行。

    1.3.5應(yīng)急預(yù)案的啟動?實(shí)驗(yàn)室生物安全領(lǐng)導(dǎo)小組通過環(huán)境監(jiān)測結(jié)果分析污染源并進(jìn)行生物安全自查,根據(jù)污染類型、范圍及危害程度上報醫(yī)院生物安全管理委員會,由其決定封閉污染區(qū)域,選擇清除污染的方法與清除驗(yàn)證方法,啟用備用實(shí)驗(yàn)用房和儀器設(shè)備,進(jìn)行生物安全評估等。

    1.3.6質(zhì)量控制?使用中山達(dá)安試劑盒配套質(zhì)控品(批號2020056)、陰性和陽性對照一同與樣本檢測,使用常規(guī)質(zhì)量控制規(guī)則,確??煽康膶?shí)驗(yàn)檢測質(zhì)量。

    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析?統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0軟件,計(jì)數(shù)資料以百分比(%)表示,其比較采用卡方檢驗(yàn),計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,其比較采用T檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1 實(shí)驗(yàn)區(qū)域環(huán)境監(jiān)測點(diǎn)SARS-CoV-2核酸檢測?試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備處理區(qū)環(huán)境監(jiān)測點(diǎn)SARS-CoV-2核酸檢測均為陰性,擴(kuò)增及產(chǎn)物分析一區(qū)為產(chǎn)物污染,環(huán)境監(jiān)測點(diǎn)均檢測出SARS-CoV-2核酸陽性,具體見表1至表3。

    2.2 污染源清除驗(yàn)證監(jiān)測?對擴(kuò)增及產(chǎn)物分析一區(qū)使用污染源清除和驗(yàn)證方法,啟動SARS-CoV-2核酸檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急預(yù)案,連續(xù)14天SARS-CoV-2核酸監(jiān)測,污染物清除后監(jiān)測期比污染物清除監(jiān)測期,CT值均值明顯升高,連續(xù)7天SARS-CoV-2核酸陰性(CT≥45),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.75,10.28,11.53 均P<0.05),見表4。

    3討論

    據(jù)中新網(wǎng)報道,新冠疫情發(fā)生以來,SARS-CoV-2核酸檢測實(shí)驗(yàn)室由原來的2081家增加至4804家,其中1350家為新準(zhǔn)入二級醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室,提高了核酸檢測能力,但同時發(fā)現(xiàn)部分臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)布局不合理,未能達(dá)到相應(yīng)生物安全防護(hù)要求;部分實(shí)驗(yàn)室人員生物安全防護(hù)意識嚴(yán)重弱化,個人防護(hù)用品不足[14];檢測人員資質(zhì)不符合要求;實(shí)驗(yàn)人員體力及心理負(fù)擔(dān)過重;生物安全手冊、風(fēng)險評估程序、標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)指導(dǎo)書不全或缺失等問題,使SARS-CoV-2核酸檢測實(shí)驗(yàn)室污染風(fēng)險增加。

    目前核酸實(shí)驗(yàn)室污染的主要類型有:①標(biāo)本污染;②試劑污染;③產(chǎn)物污染。污染處理過程耗時且繁瑣,所以采取有效的預(yù)防污染措施極為重要。常見預(yù)防實(shí)驗(yàn)室污染措施有:①實(shí)驗(yàn)室布局設(shè)置合理。設(shè)計(jì)有門禁系統(tǒng)并粘貼生物安全警示標(biāo)識,至少應(yīng)設(shè)置3個獨(dú)立工作區(qū)域: 試劑儲存區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)和擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。各區(qū)在空間上相互獨(dú)立,實(shí)驗(yàn)用品實(shí)行專區(qū)專用,處于物理分隔狀態(tài),分別設(shè)有緩沖區(qū)域。②實(shí)驗(yàn)室人員和物品應(yīng)按照從一區(qū)→二區(qū)→三區(qū)的單向工作流向制度,不得逆向流動。③嚴(yán)格的人員準(zhǔn)入進(jìn)入制度。④核酸檢測實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本制備區(qū)設(shè)置專用SARS-CoV-2核酸提取間(負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室,氣壓符合要求)進(jìn)行病毒核酸提取,避免與其他核酸檢測項(xiàng)目混用,確保生物安全。標(biāo)本的開蓋、取樣、震蕩等操作必須在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行,再轉(zhuǎn)移到全自動核酸提取儀進(jìn)行核酸提取。該區(qū)域操作者需三級生物安全防護(hù),嚴(yán)格執(zhí)行防護(hù)用品穿戴程序和互相糾正程序及制度[15-17]。⑤每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后執(zhí)行消毒程序,即使用75%酒精噴灑生物安全柜或其他儀器,然后用一次性紙巾擦拭;實(shí)驗(yàn)室臺面使用1000mg/L有效氯消毒液擦拭,實(shí)驗(yàn)室地面采用500-1000mg/L有效氯消毒液拖地消毒(拖把分區(qū)放置,不可以共用),打開生物安全柜及實(shí)驗(yàn)室紫外燈消毒>2h,實(shí)驗(yàn)室所有垃圾均視為有傳染性醫(yī)療垃圾,均需高壓滅菌消毒處理。⑥重視實(shí)驗(yàn)室人員的身體和心理健康,適當(dāng)減少輪流排班次數(shù),注重心理輔導(dǎo)。⑦健全實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系文件,特別是生物安全管理制度。⑧制定并落實(shí)環(huán)境監(jiān)測制度,包括監(jiān)測頻率(間隔)、取樣方法、取樣主要范圍,任一方法/部位環(huán)境監(jiān)測結(jié)果不合格,均應(yīng)采取相應(yīng)措施加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室清潔消毒,直至環(huán)境監(jiān)測結(jié)果全部合格。

    本文通過實(shí)驗(yàn)室環(huán)境監(jiān)測點(diǎn)SARS-CoV-2核酸檢測發(fā)現(xiàn)為擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物污染,通過實(shí)驗(yàn)跟蹤分析發(fā)現(xiàn),某廠商八聯(lián)管加蓋后,在重復(fù)高溫變性、低溫退火和延伸三個循環(huán)中蓋子變形導(dǎo)致產(chǎn)物片段泄露引起產(chǎn)物污染,采取更換新批次八聯(lián)管和使用污染源清除方法后,只用了14天就成功清除了污染源,因此環(huán)境SARS-CoV-2核酸監(jiān)測為污染源的查找分析、污染類型判斷提供了依據(jù),而行之有效的預(yù)防或清除污染措施為污染源的清除提供了保障,贏得了時間。

    本次SARS-CoV-2核酸檢測實(shí)驗(yàn)室污染處置過程中,實(shí)驗(yàn)室生物安全領(lǐng)導(dǎo)小組迅速自查并把污染類型、范圍及危害程度上報醫(yī)院生物安全管理委員會,由其啟用了應(yīng)急預(yù)案,迅速啟用了備用實(shí)驗(yàn)用房和儀器設(shè)備(天隆GENTIER 96熒光定量基因擴(kuò)增儀),為后期SARS-CoV-2污染源清除驗(yàn)證和臨床標(biāo)本檢測的正常運(yùn)行提供了可靠的保障。由此可見在新核酸檢測實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃時,實(shí)驗(yàn)預(yù)備用房尤為重要,我們不單著眼于滿足行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備處理區(qū)和擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)這三個工作區(qū),而應(yīng)該放眼于未來實(shí)驗(yàn)室發(fā)展擴(kuò)大與應(yīng)急需求,設(shè)計(jì)有SARS-CoV-2專用核酸提取間和擴(kuò)增及產(chǎn)物分析備用區(qū)對病原微生物防護(hù)十分重要。另外制定應(yīng)急預(yù)案時不單要考慮職業(yè)暴露、運(yùn)輸泄漏、火災(zāi)、水災(zāi)、地震等緊急情況,更要考慮實(shí)驗(yàn)室污染、核酸實(shí)驗(yàn)室人員工作突發(fā)休克等突發(fā)情況的緊急處置能力等。

    值得提出的是,COVID-19為當(dāng)下新發(fā)疫情,SARS-CoV-2核酸檢測也是應(yīng)對疫情新開展項(xiàng)目,本次環(huán)境環(huán)境監(jiān)測點(diǎn)采集的樣本數(shù)量有限,并不能全部反映整個實(shí)驗(yàn)的污染情況,對于低污染狀態(tài)下評價準(zhǔn)確性降低,未檢出不代表沒有污染,由此可見制定并落實(shí)SARS-CoV-2核酸檢測實(shí)驗(yàn)室預(yù)防實(shí)驗(yàn)室污染措施就更顯得重要。

    綜上所述!新型冠狀病毒核酸檢測實(shí)驗(yàn)室制定并落實(shí)環(huán)境監(jiān)測制度、行之有效的預(yù)防或清除污染措施和應(yīng)急預(yù)案對微生物安全防護(hù)極其重要。

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    作者簡介:黃日昇(1981-),男,本科學(xué)士,副主任技師,研究方向:微生物及免疫學(xué),E-mail:HRS_9919@163.com。

    通訊作者:李軼春(1974-),男,研究生學(xué)歷,副主任技師,E-mail:782383597@qq.com。

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