SRAP標(biāo)記在秋石斛雜交后代鑒定中的應(yīng)用

林榕燕 陳藝荃 鐘淮欽 林兵 葉秀仙

摘要：基于序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）分子標(biāo)記對秋石斛四面佛與水芙蓉的雜交后代進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行遺傳多樣性和聚類分析。結(jié)果顯示，共篩選出5對SRAP引物組合用于雜交后代真實(shí)性的鑒定，供試17個雜交后代新株系均鑒定為真雜種;5對SRAP引物組合共擴(kuò)增到23個多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為88.46%。從聚類結(jié)果可以看出，絕大多數(shù)雜交后代在親緣關(guān)系上先傾向于母本后傾向于父本;遺傳相似系數(shù)分析結(jié)果表明，雜交后代與母本間的遺傳相似系數(shù)大于父本，說明供試雜交后代在遺傳上更偏向于母本，與聚類結(jié)果吻合。由研究結(jié)果可以看出，所篩選的5對SRAP引物組合用于秋石斛雜交后代鑒定是可行的。

關(guān)鍵詞：秋石斛;SRAP標(biāo)記;雜交后代鑒定;聚類分析;遺傳相似性分析

中圖分類號： S682.310.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0055-04

收稿日期：2021-04-16

基金項(xiàng)目：福建省省屬公益類科研院所專項(xiàng)（編號：2019R1031-6）;福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自由探索項(xiàng)目（編號：ZYTS2019003）;福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（編號：CXTD2021010-2）。

作者簡介：林榕燕（1990—），女，福建平潭人，碩士，助理研究員，主要從事花卉生物技術(shù)研究。E-mail：lryyan@163.com。

通信作者：葉秀仙，副研究員，主要從事花卉育種與組織培養(yǎng)技術(shù)研究。E-mail：yxx7861@163.com。

秋石斛（Dendrobium spp.），別稱蝴蝶石斛，為蘭科石斛屬植物，其花朵鮮艷、花期長，是一種重要的切花和盆花種類[1]。秋石斛喜溫暖、濕潤的生長環(huán)境，對溫度的要求高，低溫被普遍認(rèn)為是秋石斛在我國推廣應(yīng)用的瓶頸[2]。因此，培育出性狀優(yōu)異、抗寒性強(qiáng)、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的秋石斛新品種已成為秋石斛育種的重要方向。目前，雜交育種仍然是獲得秋石斛新品種最為常用的方法，筆者所在課題組前期采用表型性狀、序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）分子標(biāo)記、種質(zhì)適應(yīng)性及抗寒性生理分析等評價方法，建立了石斛蘭綜合評價體系，篩選出多個綜合性狀優(yōu)異的親本，并對其開展雜交結(jié)實(shí)性研究，其中以四面佛為母本、水芙蓉為父本的這一雜交組合的結(jié)實(shí)率達(dá)100%，雜交種子經(jīng)無菌播種繁殖后獲得了一批后代群體。但是由于石斛蘭新品種的選育周期較長，為加快育種進(jìn)程，對其雜交后代真實(shí)性的早期鑒定顯得尤為必要。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)因其眾多優(yōu)點(diǎn)而成為目前國內(nèi)外植物雜交鑒定的高效技術(shù)手段之一。SRAP標(biāo)記是一種基于PCR的新型分子標(biāo)記[3]，具有重復(fù)性好、共顯性高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于菊花[4]、百合[5]、大豆[6]、枇杷[7]等多種植物雜交后代的鑒定研究中，但目前尚未有基于SRAP分子標(biāo)記的秋石斛雜交后代鑒定的相關(guān)報道。因此，本研究基于SRAP分子標(biāo)記手段，對秋石斛四面佛與水芙蓉雜交后代新株系進(jìn)行鑒定，以期為秋石斛雜種后代的早期選擇及新品種（系）的快速鑒定提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以秋石斛四面佛、水芙蓉及其17個雜交后代新株系（編號：1～17）為試驗(yàn)材料，供試材料均取自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所特色蘭花工程化實(shí)驗(yàn)室育種圃。試驗(yàn)于2020年11月在福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心花卉分子實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉片總DNA的提取 采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法進(jìn)行秋石斛親本及其雜交后代新株系葉片總DNA的提取，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測其完整性和純度后，將DNA產(chǎn)物于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 秋石斛SRAP-PCR擴(kuò)增的體系和程序 基于筆者所在課題組前期的研究結(jié)果[8]，利用篩選出的能在48份石斛蘭中擴(kuò)增出清晰條帶的14對引物組合對供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系的總體積為50 μL，包括5.0 μL含Mg2+的Buffer，4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.5 μL 5 U/μL Taq聚合酶，2.0 μL 50 ng/μL模板DNA，各2.0 μL上游、下游引物，34.5 μL ddH2O。采用變溫復(fù)性反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物，獲得電泳圖譜后拍照保存。

1.2.3 秋石斛雜交后代真實(shí)性的鑒定 從14對SRAP引物組合中篩選出具有父本特征條帶的引物組合，利用篩選出的引物組合對雜交后代群體進(jìn)行鑒別，將具有父本特征條帶的雜種鑒定為真雜種。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 觀察分析電泳圖譜，對其中的DNA條帶數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，在同一遷移位置上有擴(kuò)增條帶的記作1，無條帶的則記作0，在Excel中構(gòu)建1、0原始數(shù)據(jù)矩陣。基于數(shù)據(jù)矩陣，利用Excel計算引物的多態(tài)性比率，利用NTSYS-pc2.10e軟件繪制親本與雜交后代間的遺傳距離矩陣與遺傳相似系數(shù)矩陣。而后根據(jù)遺傳距離矩陣進(jìn)行聚類分析，獲得聚類圖;根據(jù)相似系數(shù)矩陣，在Excel中繪制親本與雜種間的遺傳相似系數(shù)箱式圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋石斛SRAP引物的初篩選

將19份供試材料的DNA濃度稀釋至同一水平后，隨機(jī)選擇2個雜交后代的新株系樣本進(jìn)行14對SRAP引物組合的初步篩選，篩選出8對能夠擴(kuò)增出明顯條帶的引物。隨后，利用這8對引物組合對供試的19個樣品進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)有5對SRAP引物組合（Me1+Em2、Me1+Em3、Me1+Em8、Me4+Em2及Me6+Em6）能擴(kuò)增出清晰條帶，且父本能擴(kuò)增出母本沒有的特異性條帶（表1）。

2.2 雜交后代的真實(shí)性鑒定

利用篩選出的5對SRAP引物組合對17個雜交后代新株系進(jìn)行真實(shí)性鑒定（表2），其中能擴(kuò)增出具有父本特異性條帶的新株系便是真雜種，否則為假雜種。結(jié)果表明，在Me1+Em8和Me6+Em6引物組合的擴(kuò)增結(jié)果中，鑒定出有16個雜交后代新株系為真雜種，鑒定效率達(dá)94.12;而Me1+Em2、Me1+Em3、Me4+Em2引物組合檢測到10、12、11個雜交后代新株系具有父本特異條帶，鑒定效率分別為58.82%、70.59%和64.71%。此外，在Me1+Em8引物組合中未檢測到5號雜交后代新株系具有父本特異條帶;而在Me1+Em2引物組合的擴(kuò)增結(jié)果中（圖1），發(fā)現(xiàn)5號雜交后代新株系具有父本特征條帶，鑒定其為真雜種;Me1+Em3、Me4+Em2及Me6+Em6引物組合中同樣鑒定出5號雜交后代新株系，為真雜種。綜合5對引物組合的擴(kuò)增結(jié)果，供試的17個秋石斛雜交后代新株系均具有父本特異性條帶，鑒定為真雜種，鑒定效率達(dá)到100%。

2.3 SRAP引物的多態(tài)性分析

從圖1可以看出，秋石斛不同雜交后代株系間的SRAP存在多態(tài)性，因此對篩選出的5對SRAP引物組合進(jìn)行多態(tài)性分析。由表3可以看出，5對引物組合共擴(kuò)增出26個條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)有23個，平均每對引物組合擴(kuò)增到4.6個多態(tài)性條帶，多態(tài)性位點(diǎn)比例為88.46%。Me1+Em2、Me1+Em8及Me4+Em2引物組合的多態(tài)性比例均為100.00%，Me6+Em6引物組合的多態(tài)性比例僅為71.43%。

2.4 親本與雜交后代的聚類分析

根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果建立0，1型數(shù)據(jù)，利用NTSYS-pc2.10e軟件構(gòu)建秋石斛親本與雜交后代的聚類圖。從圖2可以看出，19個供試材料間的遺傳距離為0.05～0.27，其中2號雜交后代新株系與4號雜交后代新株系間的遺傳距離最近。在遺傳距離0.23處，19個供試秋石斛材料被分為3大聚類群：第Ⅰ類，包含母本四面佛、17號雜交后代新株系;第Ⅱ類，包含15個雜交后代新株系，有1～5號雜交后代新株系及7～16號雜交后代新株系，占供試雜交后代新株系的88.24%;第Ⅲ類，包含父本水芙蓉和6號雜交后代新株系。

2.5 雜交親本與后代的遺傳相似系分析

根據(jù)NTSYS-pc2.10e軟件構(gòu)建的秋石斛親本與雜交后代的遺傳相似系數(shù)矩陣，其中母本四面佛與父本水芙蓉間的遺傳相似系數(shù)僅為0.46，為遺傳相似系數(shù)矩陣中的最低值?；谶z傳相似系數(shù)矩陣，繪制親本與雜交后代的遺傳相似系數(shù)箱式圖。由圖3可以看出，母本四面佛與雜交后代新株系間的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.85，其中母本四面佛與3號雜交后代新株系間的遺傳相似系數(shù)最高，與6

號雜交后代新株系間的遺傳相似系數(shù)最低，母本四面佛與雜交后代新株系間的平均遺傳相似系數(shù)為0.72。父本水芙蓉與雜交后代新株系間的遺傳相似系數(shù)為0.54～0.85，其中父本水芙蓉與6號雜交后代新株系間的遺傳相似系數(shù)最高，與3號雜交后代新株系間的遺傳相似系數(shù)最低，父本水芙蓉與雜交后代新株系間的平均遺傳相似系數(shù)為0.66。雜交后代與母本的遺傳相似系數(shù)較父本的大，說明雜交后代與母本的親緣關(guān)系更近，表現(xiàn)為偏母性遺傳，這與聚類分析中絕大多數(shù)雜交后代新株系在遺傳上先傾向于母本后傾向于父本的結(jié)果相吻合。

對17個雜交后代新株系間的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，5號雜交后代新株系與15號雜交后代新株系間、5號雜交后代新株系與17號雜交后代新株系間、14號雜交后代新株系與15號雜交后代新株系間的遺傳相似系數(shù)最低，為0.62;2號雜交后代新株系與4號雜交后代新株系間、4號雜交后代新株系與11號雜交后代新株系間、7號雜交后代新株系與10號雜交后代新株系間、9號雜交后代新株系與12號雜交后代新株系間、12號雜交后代新株系與14號雜交后代新株系間的遺傳相似系數(shù)最高，為0.92。17個雜交后代新株系間的平均遺傳相似系數(shù)為0.79，高于雜交后代與父母本間的遺傳相似系數(shù)。

3 結(jié)論與討論

SRAP分子標(biāo)記技術(shù)因具有較高的重復(fù)性和共顯性，且引物開發(fā)成本較低，目前已被成功應(yīng)用于多種植物雜交后代真實(shí)性鑒定和遺傳多樣性分析中[9-12]。本研究共篩選出5對SRAP引物組合用于秋石斛雜交后代的真實(shí)性鑒定研究。結(jié)果表明，供試的17個雜交后代新株系均鑒定為真雜種，鑒定效率為100%，說明SRAP分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于秋石斛雜交后代真實(shí)性鑒定研究中是可行的。李玉萍等利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對春蘭與大花蕙蘭雜種株系進(jìn)行早期鑒定，證實(shí)了SRAP分子標(biāo)記作為蘭花育種中早期雜交種篩選鑒定的有效性[13]。在雜交后代真實(shí)性鑒定的過程中，發(fā)現(xiàn)引物組合Me1+Em2鑒定出的真雜種數(shù)量為10個，未鑒定出1號、3號、8號、13號、15號、16號及17號雜交后代新株系，引物組合Me1+Em8鑒定出16個真雜種，鑒定出7個未在Me1+Em2引物組合鑒定出的雜交后代新株系，但未鑒定出5號雜交后代新株系，說明用不同引物組合鑒定的結(jié)果存在差異，因此，利用多對引物組合的互補(bǔ)作用進(jìn)行鑒定，結(jié)果更為可靠[14]。

本研究利用篩選出的5對SRAP引物組合對秋石斛親本及其雜交后代進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對其多態(tài)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性條帶占比為88.46%，與洋蔥的87%[15]和蘋果的89.77%[16]相當(dāng)，說明供試19個秋石斛樣本具有較高的遺傳多樣性。聚類分析結(jié)果顯示，17號雜交后代新株系與母本四面佛間的親緣關(guān)系較近，對其表型性狀進(jìn)行觀測發(fā)現(xiàn)，二者均為紫色系花;6號雜交后代新株系與父本水芙蓉間的親緣關(guān)系較近，表型性狀觀測結(jié)果顯示，二者在花型上具有較大相似性，萼片均為橢圓形;其余15個雜交后代新株系在親緣關(guān)系上先傾向于母本后傾向于父本。對秋石斛親本與雜交后代的遺傳相似系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，雜交后代新株系間的遺傳相似系數(shù)高于雜交后代與親本間的遺傳相似系數(shù)，且雜交后代與母本的遺傳相似系數(shù)較父本的大，說明該組合雜交后代的遺傳基礎(chǔ)趨向于變窄[17]，且表現(xiàn)為偏母性遺傳，與聚類結(jié)果相印證。上述結(jié)果表明，SRAP分子標(biāo)記可較準(zhǔn)確地反映秋石斛17個雜交后代新株系與秋石斛親本間的差異，且聚類結(jié)果與花色、花型等有較大相關(guān)性。

雜種鑒定是育種的基礎(chǔ)工作之一，對雜種后代群體進(jìn)行及時有效的鑒定可提高育種效率，對秋石斛新品種選育具有重要作用。本研究利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對秋石斛雜交后代新株系的真實(shí)性進(jìn)行鑒定，并從分子水平探討了不同雜交后代新株系間及雜交后代新株系與親本間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，取得了較好的效果，為秋石斛雜交后代真實(shí)性的鑒定、種質(zhì)資源評價提供了技術(shù)支撐。鑒定出的真雜種后代加快了秋石斛新品種的選育進(jìn)程，可為秋石斛品種的進(jìn)一步開發(fā)利用提供優(yōu)良種質(zhì)。

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