青蒿提取物對(duì)泌乳奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物區(qū)系的影響

余詩(shī)強(qiáng) 熊安然 潘予琮 汪 悅 張亞靜 蔣林樹* 熊本海*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3.河北省高碑店市職教中心，保定 074000)

奶牛瘤胃是一個(gè)大型生物反應(yīng)器，瘤胃中的微生物能夠幫助奶牛將大量不能被宿主直接利用的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成能被利用的高質(zhì)量的營(yíng)養(yǎng)素，如消化宿主動(dòng)物不能消化的纖維素、半纖維素等物質(zhì)，顯著增加飼糧中總能的可利用程度；同時(shí)宿主-瘤胃-微生物相互作用參與機(jī)體許多重要的生理過程，因此瘤胃微生物區(qū)系的組成與結(jié)構(gòu)影響宿主對(duì)飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收[1-2]。長(zhǎng)期以來(lái)，大量研究一直致力于改善飼糧配方和使用飼料添加劑來(lái)優(yōu)化、調(diào)節(jié)瘤胃的菌群結(jié)構(gòu)，以此促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，提高飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率[3]。植物提取物作為新型飼料添加劑，具有綠色、無(wú)毒、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，能解決抗生素帶來(lái)的藥物殘留等問題，是替代抗生素優(yōu)選物質(zhì)[4]，同時(shí)，植物提取物可以調(diào)節(jié)反芻動(dòng)物瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，改善瘤胃發(fā)酵、減少甲烷排放、提高動(dòng)物的飼糧利用率和生產(chǎn)性能[5]。

青蒿(ArtemisiaannuaL.)，又名草蒿、香蒿等，是菊科艾屬一年生草本植物，其富含植物營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)，例如單萜、倍半萜和酚類等化合物，生物學(xué)功能廣泛[6]。青蒿在世界各地分布廣泛，可以被動(dòng)物食用，具有改善畜產(chǎn)品品質(zhì)，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體抗菌、抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)能力[7-8]。青蒿是一種非常規(guī)飼料，其無(wú)毒無(wú)害、無(wú)耐藥性，在畜牧生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛，是營(yíng)造動(dòng)物安全養(yǎng)殖環(huán)境的理想飼料資源[9]，飼糧中添加適量青蒿提取物能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，提高腸道消化酶活性，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能[10]。在奶牛飼糧中添加120 g/d的青蒿提取物能顯著改善奶牛機(jī)體的脂質(zhì)代謝途徑，提高乳腺上皮細(xì)胞活性，激活腺苷酸活化蛋白激酶-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(AMPK-mTOR)信號(hào)通路，促進(jìn)奶牛乳汁中乳脂合成[11]，其能提高奶牛體外發(fā)酵試驗(yàn)中瘤胃液氨態(tài)氮(NH3-N)濃度和干物質(zhì)消化率，降低中性洗滌纖維含量和乙丙比，并抑制甲烷產(chǎn)生[12]。青蒿提取物能改善反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵，促進(jìn)短鏈脂肪酸(SCFA)生成，提高代謝能(ME)、泌乳凈能(NEL)和有機(jī)物消化率，在抑制甲烷產(chǎn)生方面具有積極作用[13]。但目前青蒿提取物對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵的影響尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬通過飼養(yǎng)試驗(yàn)深入研究青蒿提取物對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物區(qū)系的影響，以期為青蒿提取物在奶牛生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的青蒿提取物為棕黃色粉末，選購(gòu)自陜西某天然制品有限公司，其主要成分和含量如下：青蒿素39.0%，粗灰分13.0%，粗纖維27.9%，粗蛋白質(zhì)6.3%，水分5.0%，多糖8.3%，揮發(fā)油0.5%。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

選取健康、泌乳中期、體況相似、胎次為2～4胎、日產(chǎn)奶量為(33.0±3.9)kg/d的荷斯坦奶牛20頭為試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)牛采用散欄帶臥床式飼養(yǎng)，每天07:00、13:00和18:00對(duì)奶牛進(jìn)行投料，09:30、15:30、21:30進(jìn)行擠奶。試驗(yàn)期間奶牛自由采食，自由飲水，牛舍每天清掃、清糞?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2001)奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，以全混合日糧(TMR)形式飼喂，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究于2019年5—7月在奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室延慶基地進(jìn)行。試驗(yàn)牛隨機(jī)分為4組(1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組)，每組5頭，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.25%[50 g/(d·頭)]、0.50% [100 g/(d·頭)]、0.75% [150 g/(d·頭)]青蒿提取物的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)期45 d，其中預(yù)試期10 d，正試期35 d。

1.4 樣品采集與測(cè)定

1.4.1 瘤胃液的采集

在正試期的第35天，于晨飼前1 h經(jīng)口腔采集瘤胃液，使用滅菌的4層紗布進(jìn)行過濾分裝于15 mL離心管和5 mL凍存管中，保存于-80 ℃?zhèn)溆?，用于NH3-N、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度和瘤胃菌群的測(cè)定。

1.4.2 樣品測(cè)定

pH：使用PHS-10型便捷式pH計(jì)測(cè)定。

NH3-N濃度：參照王加啟[14]的比色法測(cè)定。

VFA濃度：采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定。使用安捷倫7890B型號(hào)氣相色譜儀測(cè)定。色譜條件為FID檢測(cè)器，流速為30 mL/min的N2作為載氣，空氣發(fā)生器提供流速為40 mL/min的氫氣，空氣流速400 mL/min，總流量為54 mL/min，吹掃流量3 mL/min，分流比50∶1，線速度為27.8 cm/s，DB-FFAP(15 m×0.32 mm×0.25 μm)填充柱，柱溫180 ℃，檢測(cè)溫度280 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

1.4.3 瘤胃菌群多樣性

1)將-80 ℃下保存的瘤胃液樣品置于無(wú)菌操作臺(tái)，并放入冰水混合物中解凍后，根據(jù)Power Soil DNA Isolation Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行總DNA提取。

2)使用細(xì)菌V3～V4區(qū)域引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)、806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表2。為避免試驗(yàn)誤差，檢測(cè)的瘤胃液樣本均設(shè)3個(gè)重復(fù)，并將重復(fù)樣本的PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物混勻，進(jìn)行凝膠電泳定量質(zhì)檢。

表2 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件Table 2 PCR reaction system and reaction conditions

3)構(gòu)建瘤胃細(xì)菌區(qū)系16S rRNA基因文庫(kù)，為目的DNA片段兩端加上特定的接頭序列。

4)基于Illumina平臺(tái)的Hiseq雙端測(cè)序，Illumina HiSeq測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識(shí)別(base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(sequenced reads)，結(jié)果以FASTQ(fq)文件格式存儲(chǔ)，其中包含測(cè)序序列(reads)的序列信息以及其對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息。

5)根據(jù)PE reads之間的Overlap關(guān)系，將Hiseq測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接(merge)成1條序列Tags，同時(shí)對(duì)reads的質(zhì)量和merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾。主要有3個(gè)步驟：第1步，PE reads拼接，使用FLASH v1.2.7軟件，通過overlap對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列即原始Tags數(shù)據(jù)(raw Tags)；第2步，Tags過濾，使用Trimmomatic v0.33軟件，對(duì)拼接得到的raw Tag進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(clean Tags)；第3步，去除嵌合體，使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)(effective Tags)。質(zhì)控過濾后，利用QIIME(version 1.8.0)軟件中UCLUST對(duì)Tags按照97%相似性水平進(jìn)行聚類，得到每個(gè)樣品的操作分類單元(OTU)。通過OTU的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，進(jìn)行物種注釋，分析α-多樣性，利用R語(yǔ)言工具繪制稀釋性曲線和Venn圖。使用QIIME軟件進(jìn)行β-多樣性分析，繪制主坐標(biāo)分析(PCoA)圖。不同組差異性利用CAA和Heatmap圖進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016進(jìn)行初步整理后，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，組間比較采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，并以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂青蒿提取物對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，添加0.25%青蒿提取物，瘤胃液NH3-N和丙酸濃度顯著升高(P<0.05)，乙丙比顯著降低(P<0.05)，瘤胃液pH、總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸濃度無(wú)顯著變化(P>0.05)；添加0.50%青蒿提取物，瘤胃液丙酸、異丁酸和戊酸濃度顯著升高(P<0.05)，乙丙比顯著降低(P<0.05)，瘤胃液pH、NH3-N、總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、異戊酸和丁酸濃度無(wú)顯著變化(P>0.05)；添加0.75%青蒿提取物，瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度顯著升高(P<0.05)，乙酸、異丁酸濃度和乙丙比顯著降低(P<0.05)，瘤胃液pH、異戊酸和NH3-N濃度無(wú)顯著變化(P>0.05)。

表3 青蒿提取物對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effect of Artemisia annua L.extract on rumen fermentation parameters of dairy cows

2.2 飼喂青蒿提取物對(duì)奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

2.2.1 青蒿提取物對(duì)奶牛瘤胃細(xì)菌群落多樣性的影響

2.2.1.1 凝膠電泳分析

由凝膠電泳結(jié)果(圖1)可知，對(duì)24個(gè)瘤胃液樣品(根據(jù)飼喂青蒿提取物對(duì)奶牛瘤胃常規(guī)發(fā)酵參數(shù)的影響進(jìn)行劑量篩選，最終以添加水平0.75%為試驗(yàn)組進(jìn)行高通量測(cè)序，共24個(gè)瘤胃液樣品)進(jìn)行16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物條帶正確清晰、濃度合適，質(zhì)量滿足建庫(kù)要求。

M：標(biāo)記；1～24：24個(gè)樣品；CK：以純水為空白。M:marker；1 to 24:24 samples；CK:pure water was used as blank.圖1 PCR擴(kuò)增樣品瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified samples

2.2.1.2 細(xì)菌群落多樣性分析

基于16S rRNA基因測(cè)序數(shù)據(jù)，繪制瘤胃液菌群樣本的稀釋曲線和物種積累曲線，圖2中各樣本曲線均達(dá)到平臺(tái)期，說(shuō)明測(cè)序數(shù)量已經(jīng)足夠包含樣本中絕大部分微生物信息。由Coverage指數(shù)可知，各樣本的覆蓋率達(dá)到99%以上(表4)，故可以準(zhǔn)確地反映瘤胃中微生物群落的種類和結(jié)構(gòu)多樣性。本試驗(yàn)測(cè)序以97%的相似性閾值將序列劃分為不同的OTU，在瘤胃液菌群中獲得969個(gè)有效OTU，對(duì)照組與試驗(yàn)組(0.75%青蒿提取物組)共享969個(gè)OTU，對(duì)照組獨(dú)享0個(gè)OTU，試驗(yàn)組獨(dú)享5個(gè)OTU。由表4可知，與對(duì)照組相比，添加0.75%青蒿提取物顯著提高了Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)(P<0.05)，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)無(wú)顯著變化(P>0.05)。

表4 瘤胃液細(xì)菌α-多樣性指數(shù)Table 4 Rumen bacterial alpha-diversity index

C：對(duì)照組；T：試驗(yàn)組(0.75%青蒿提取物組)。下圖同。C:control group;T:experimental group (0.75% Artemisia annua L.extract group).The same as below.圖2 樣品稀釋曲線Fig.2 Sample dilution curve

圖3 OTU Venn圖Fig.3 OTU Venn diagram

2.2.2 青蒿提取物對(duì)瘤胃液菌群相對(duì)豐度的影響

分析瘤胃液菌群在門水平的組成比例及變化，檢測(cè)到14個(gè)菌門，其中不同組瘤胃液細(xì)菌區(qū)系中相對(duì)豐度在0.01%以上的門均有10個(gè)。由表5和圖4可知，在門水平上，不同組奶牛瘤胃液細(xì)菌區(qū)系的優(yōu)勢(shì)菌群一致，但在2組間相對(duì)豐度不同，相對(duì)豐度在1%以上的菌門均有4個(gè)，分別為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和SR_[Absconditabacteria]。其在試驗(yàn)組中的相對(duì)豐度分別為52.37%、32.94%、10.48%、1.38%，在對(duì)照組中的相對(duì)豐度分別為56.12%、31.22%、6.91%、2.30%。泌乳期荷斯坦奶牛瘤胃液的優(yōu)勢(shì)菌門主要有擬桿菌門、厚壁菌門。對(duì)照組中擬桿菌門、厚壁菌門的相對(duì)豐度分別為56.12%、31.22%，試驗(yàn)組中擬桿菌門、厚壁菌門的相對(duì)豐度分別為52.37%、32.94%。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組擬桿菌門相對(duì)豐度顯著下降3.7%(P<0.05)，厚壁菌門相對(duì)豐度上升1.72%(P>0.05)，變形菌門相對(duì)豐度顯著上升3.57%(P<0.05)，SR_[Absconditabacteria]相對(duì)豐度顯著下降0.92%(P<0.05)，疣微菌門相對(duì)豐度顯著下降0.26%，其他菌門相對(duì)豐度無(wú)顯著變化(P>0.05)。

圖4 門水平上青蒿提取物對(duì)奶牛瘤胃液細(xì)菌區(qū)系組成的影響Fig.4 Effects of Artemisia annua L.extract on bacterial flora composition in rumen fluid of dairy cows at phylum level

表5 青蒿提取物對(duì)瘤胃菌群相對(duì)豐度的影響(門水平)Table 5 Effects of Artemisia annua L.extracts on relative abundance of rumen microflora (phylum level) %

分析2組瘤胃液菌群在屬水平的組成和變化，共檢測(cè)到相對(duì)豐度大于0.01%的屬共有128個(gè)。由表6和圖5可知，在屬水平上，不同組奶牛瘤胃液細(xì)菌區(qū)系的優(yōu)勢(shì)菌群一致，但在2組間相對(duì)豐度不同，主要的屬有10個(gè)(大于1%)分別為普雷沃氏菌屬1、uncultured_rumen_bacterium、琥珀酸弧菌科UCG-002、理研菌科RC9群、丁酸弧菌屬2、月形單胞菌屬1、解琥珀酸菌科、瘤胃球菌科NK4A214群、瘤胃球菌屬2、克里斯滕森菌科R-7。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組普雷沃氏菌屬1、理研菌科RC9群和解琥珀酸菌屬相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)，丁酸弧菌屬2、瘤胃球菌科NK4A214群和瘤胃球菌屬2相對(duì)豐度顯著下降(P>0.05)。

表6 青蒿提取物對(duì)瘤胃菌群相對(duì)豐度的影響(屬水平)Table 6 Effects of Artemisia annua L.extract on relative abundance of rumen microflora (genus level) %

2.2.3 青蒿提取物對(duì)奶牛瘤胃液細(xì)菌組成影響相似性分析

通過β-多樣性分析，評(píng)估2組之間菌群結(jié)構(gòu)的差異性。圖6為基于非加權(quán)距離算法的PCoA，坐標(biāo)軸1和坐標(biāo)軸2分別占總變異量的50.07%和14.21%。ANOSIM的R值為0.57，說(shuō)明對(duì)照組與試驗(yàn)組之間的菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異(P<0.05)。

圖6 PCoA聚類分析Fig.6 PCoA cluster analysis

2.2.4 青蒿提取物對(duì)奶牛瘤胃細(xì)菌組成與發(fā)酵參數(shù)的相關(guān)性分析

圖7展示了奶牛瘤胃細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度(排名前15的菌屬)與發(fā)酵參數(shù)的相關(guān)關(guān)系。其中琥珀酸弧菌科UCG-002相對(duì)豐度與乙酸(R=0.655，P<0.01)、總揮發(fā)性脂肪酸(R=0.627，P<0.01)和丙酸(R=0.508，P<0.01)濃度呈極顯著正相關(guān)；瘤胃球菌科UCG-014相對(duì)豐度與總揮發(fā)性脂肪酸濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.345，P<0.05)，與丁酸濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.415，P<0.01)，與產(chǎn)奶量呈顯著正相關(guān)(R=0.504，P<0.05)；瘤胃球菌屬1相對(duì)豐度與乙酸濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.433，P<0.05)，與總揮發(fā)性脂肪酸(R=-0.345，P<0.05)、丙酸(R=-0.120，P<0.05)濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，與產(chǎn)奶量呈顯著正相關(guān)(R=0.504，P<0.05)；普雷沃氏菌科1與乙酸(R=-0.896，P<0.01)、總揮發(fā)性脂肪酸(R=-0.585，P<0.01)、NH3-N(R=-0.656，P<0.01)和戊酸(R=-0.449，P<0.01)濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與乙丙比呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.193，P<0.05)；普雷沃氏菌科UCG-001相對(duì)豐度與乙酸濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.789，P<0.01)，與總揮發(fā)性脂肪酸(R=0.480，P<0.05)和異戊酸濃度(R=0.338，P<0.05)呈顯著負(fù)相關(guān)；理研菌科RC9群相對(duì)豐度與乙酸(R=-0.531，P<0.01)和總揮發(fā)性脂肪酸(R=-0.448，P<0.01)濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與NH3-N(R=-0.372，P<0.05)和丙酸(R=-0.423，P<0.05)濃度呈顯著負(fù)相關(guān)；琥珀酸菌屬相對(duì)豐度與乙酸濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.486，P<0.01)；毛螺菌科NK3A20群相對(duì)豐度與乙酸濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.462，P<0.05)；瘤胃球菌科NK4A214群相對(duì)豐度與丙酸濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.368，P<0.05)。

3 討 論

3.1 飼喂青蒿提取物對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃液pH是反映瘤胃健康的直接指標(biāo)，其與飼糧組成和添加劑類型的關(guān)聯(lián)密切，反映瘤胃內(nèi)各種有機(jī)酸和代謝物產(chǎn)生與吸收的情況[15]。奶牛瘤胃液正常pH在5.5～6.8[16]，本試驗(yàn)中各組瘤胃液pH均處于正常生理范圍內(nèi)，這與蘇漢書等[12]在奶牛瘤胃體外發(fā)酵的研究結(jié)果一致。此外，在山羊的基礎(chǔ)飼糧中添加青蒿提取物，發(fā)現(xiàn)青蒿提取物對(duì)山羊瘤胃液pH無(wú)顯著影響[17]，這也印證了奶牛飼糧中添加青蒿提取物不會(huì)改變瘤胃內(nèi)的酸堿平衡。

瘤胃中NH3-N是微生物菌體蛋白(MCP)合成的原料，是反映瘤胃微生物生長(zhǎng)情況的指標(biāo)，NH3-N濃度在10～50 mg/dL最適宜瘤胃微生物生長(zhǎng)[18]。本試驗(yàn)中，瘤胃中NH3-N濃度在此范圍內(nèi)，并且在青蒿提取物0.25%和0.50%的添加水平下NH3-N濃度相對(duì)于對(duì)照組顯著提高，而在0.75%的添加水平下無(wú)顯著變化，說(shuō)明青蒿提取物在一定程度上可以促進(jìn)瘤胃NH3-N的合成，這與秦韜等[19]的研究結(jié)果一致。瘤胃內(nèi)NH3-N濃度與MCP的含量密切相關(guān)，可以推測(cè)青蒿提取物能提高瘤胃微生物的活性，促進(jìn)蛋白分解菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)MCP和NH3-N的生成。

瘤胃內(nèi)碳水化合物發(fā)酵后生成VFA，其主要包括丙酸、丁酸、乙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸等，均是奶牛主要的能量來(lái)源[20]，乙酸、丙酸和丁酸約占總揮發(fā)性脂肪酸濃度95%以上，乙酸是反芻動(dòng)物合成脂肪的前體，是動(dòng)物合成乳脂的主要成分，丁酸也可作為乳腺和脂肪組織合成脂肪酸的原料，丙酸經(jīng)肝臟糖原異生作用生成葡萄糖為機(jī)體供能，丙酸比例越高，其可為機(jī)體提供的能量就越高[21]。有研究報(bào)道，在反芻動(dòng)物飼糧中添加青蒿提取物可以提高瘤胃內(nèi)乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度[22]，在本試驗(yàn)中，添加0.75%的青蒿提取物顯著降低了瘤胃內(nèi)乙酸濃度和乙丙比，總揮發(fā)性脂肪酸、丙酸和丁酸濃度顯著增加，這與王小晶等[23]的研究結(jié)果一致。這說(shuō)明在奶牛飼糧中添加青蒿提取物可以促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，改變瘤胃內(nèi)VFA的比例。

3.2 飼喂青蒿提取物對(duì)奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

研究表明，當(dāng)樣本覆蓋率達(dá)到97%以上時(shí)，說(shuō)明測(cè)序樣本取樣充分[24]，本試驗(yàn)中樣本覆蓋率高于99%，證明本次測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)地反映奶牛瘤胃微生物種類和結(jié)構(gòu)多樣性。報(bào)道指出，奶牛瘤胃微生物區(qū)系的種類和數(shù)量與奶牛種類、飼糧及添加劑種類有關(guān)[3]。研究表明，采用ITS高通量測(cè)序和16S rRNA高通量測(cè)序?qū)α鑫肝⑸镞M(jìn)行分析能得到612～1 797個(gè)OTU[25-26]，本試驗(yàn)測(cè)得試驗(yàn)?zāi)膛Ａ鑫肝⑸飬^(qū)系共969個(gè)，處于兩者之間，這說(shuō)明添加青蒿提取物改變了奶牛的瘤胃細(xì)菌區(qū)系的種類和數(shù)量，試驗(yàn)中2組共有964個(gè)OTU，青蒿提取物組獨(dú)有5個(gè)OTU。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映瘤胃微生物區(qū)系的多樣性，Shannon指數(shù)越大或Simpson指數(shù)越小時(shí)微生物區(qū)系越高；Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)反映瘤胃微生物區(qū)系的豐富度，Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)越大，微生物區(qū)系越豐富[27]。本試驗(yàn)中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)無(wú)顯著變化，Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著提高，說(shuō)明青蒿提取物不影響瘤胃微生物的多樣性，但會(huì)增加其豐富度。

奶牛瘤胃微生物中優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門和厚壁菌門[28-29]，本試驗(yàn)中奶牛瘤胃優(yōu)勢(shì)菌門也為擬桿菌門和厚壁菌門。飼糧中的非纖維性碳水化合物主要依靠擬桿菌門細(xì)菌降解[30]，而纖維降解主要依靠厚壁菌門細(xì)菌[31]，如溶纖維丁酸弧菌和解纖維梭菌等。Zened等[32]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛瘤胃內(nèi)細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門不會(huì)因飼糧改變而改變，始終為擬桿菌門和厚壁菌門。本試驗(yàn)中，添加青蒿提取物后擬桿菌門相對(duì)豐度顯著下降，厚壁菌門相對(duì)豐度無(wú)顯著變化，說(shuō)明青蒿提取物抑制了擬桿菌門微生物的生長(zhǎng)與增殖。研究表明，變形菌門可降解可溶性碳水化合物[33]，本試驗(yàn)添加青蒿提取物后變形菌門相對(duì)豐度顯著增加，說(shuō)明青蒿提取物能促進(jìn)奶牛瘤胃可溶性碳水化合物的降解，這也解釋了總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著升高的原因。SR_[Absconditabacteria]和疣微菌門相對(duì)豐度與哺乳動(dòng)物胃腸道免疫有顯著關(guān)系[34-35]，本試驗(yàn)中SR_[Absconditabacteria]和疣微菌門相對(duì)豐度在添加青蒿提取物后顯著下降，這表明在飼糧中添加青蒿提取物可能與增強(qiáng)機(jī)體免疫力有關(guān)，這也印證了前期本試驗(yàn)中青蒿提取物可以提高奶牛免疫能力的試驗(yàn)結(jié)果。

每2個(gè)變量之間的相關(guān)強(qiáng)度用顏色和*表示，紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)，*表示0.01

在屬水平上，奶牛瘤胃內(nèi)微生物優(yōu)勢(shì)菌屬為普雷沃氏菌屬、琥珀酸菌屬和理研菌屬[36-37]，這與本研究結(jié)果一致，普雷沃氏菌屬于擬桿菌門，在瘤胃中分布廣泛，數(shù)量多，包括半纖維素分解菌和蛋白分解菌，如棲瘤胃普雷沃菌、布氏普雷沃氏菌和短普雷沃氏菌等，其可降解植物性半纖維素、蛋白質(zhì)、非纖維多糖、參與多種微生物代謝[38]，本試驗(yàn)添加青蒿提取物后，奶牛瘤胃液中普雷沃氏菌屬相對(duì)豐度顯著提高，說(shuō)明添加青蒿提取物在一定程度上促進(jìn)了奶牛瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)的分解利用，影響瘤胃內(nèi)NH3-N和總揮發(fā)性脂肪酸濃度，這與瘤胃發(fā)酵常規(guī)指標(biāo)的結(jié)果相一致。理研菌科與自身免疫有關(guān)[39]，本試驗(yàn)中添加青蒿提取物后瘤胃液中理研菌科RC9群相對(duì)豐度顯著增加，這可能與青蒿提取物改變奶牛免疫性能有關(guān)。丁酸弧菌屬也是瘤胃中分解利用纖維素的菌屬[40]，飼喂青蒿提取物后瘤胃液中丁酸弧菌屬2相對(duì)豐度顯著下降可能是由于其他降解纖維素菌的增加，導(dǎo)致丁酸弧菌屬2的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)降低，進(jìn)而比例下降。解琥珀酸菌屬可以將瘤胃微生物分解碳水化合物后產(chǎn)生的琥珀酸代謝成丙酸鹽，進(jìn)而生成丙酸[41]，添加青蒿提取物后瘤胃液中解琥珀酸菌屬相對(duì)豐度顯著上升，這可能是導(dǎo)致瘤胃液中丙酸濃度顯著上升的主要原因。瘤胃球菌屬在瘤胃中可以降解粗飼料中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，產(chǎn)生大量的纖維素酶和木聚糖酶，通過酶作用生成乙酸[42]。添加青蒿提取物后瘤胃球菌科NK4A214群和瘤胃球菌屬2相對(duì)豐度顯著下降，導(dǎo)致瘤胃液中乙酸濃度下降，這與前人研究結(jié)果[27]相同。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，普雷沃氏菌屬1和理研菌科RC9群相對(duì)豐度與總揮發(fā)性脂肪酸濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明這2種菌可能參與總揮發(fā)性脂肪酸的代謝，這與程冠文[43]研究結(jié)果相一致。同時(shí)，瘤胃球菌屬1、普雷沃氏菌屬1、普雷沃氏菌科UCG-001、理研菌科RC9群和琥珀酸菌屬相對(duì)豐度與乙酸濃度呈負(fù)相關(guān)，這些菌屬促進(jìn)了乙酸的代謝，影響了乙丙比，這也揭示了本研究中瘤胃液中乙酸濃度顯著降低的原因。瘤胃球菌科UCG-014和瘤胃球菌屬1與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫有關(guān)[44-45]，在本試驗(yàn)中2種菌屬相對(duì)豐度與產(chǎn)奶量呈顯著正相關(guān)，表明這2種菌屬可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力以促進(jìn)奶牛產(chǎn)奶。綜上可知，青蒿提取物可以通過改善瘤胃微生物相對(duì)豐度，調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵，進(jìn)而提高奶牛機(jī)體免疫能力和產(chǎn)奶量。

4 結(jié) 論

在奶牛飼糧中添加0.75%青蒿提取物顯著提高Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)，使變形菌門、普雷沃氏菌屬1、理研菌科RC9群等相對(duì)豐度顯著提高，擬桿菌門、丁酸弧菌屬2等相對(duì)豐度顯著降低；降低瘤胃中乙酸濃度和乙丙比，提高總揮發(fā)性脂肪酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度，對(duì)瘤胃發(fā)酵和微生物結(jié)構(gòu)變化有積極作用。

Prevotella1：普雷沃氏菌屬1；Uncultured rumen_bacterium：未分類瘤胃細(xì)菌；Succinivibrionaceae_UCG-002：琥珀酸球菌科UCG-002；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9群；Succiniclasticum：解琥珀酸菌屬；Selenomonas1：月形單胞菌屬1；Butyrivibrio2：丁酸弧菌屬2；Ruminococcus2：瘤胃球菌屬2；Christensenellaceac_R-7_group：克里斯滕森菌科R-7群；Ruminococcaceae_NK4A214_group：瘤胃球菌科NK4A214群；Others：其他；Unclassified：未分類。
圖5 屬水平上青蒿提取物對(duì)奶牛瘤胃液細(xì)菌區(qū)系組成的影響
Fig.5 Effects ofArtemisiaannuaL.extract on bacterial flora composition in rumen fluid of dairy cows at genus level

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