柴胡皂苷對熱誘導的奶牛乳腺上皮細胞抗氧化能力和熱休克蛋白基因表達的影響

胡海濤 孫先枝 黃 峰 王青峰 李晶晶 卓 釗 范彩云 蘇衍菁 程建波**

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036；2.上海城建職業(yè)學院，上海 201415；3.光明牧業(yè)有限公司，上海 200436)

熱應激(HS)一直是困擾我國奶牛生產(chǎn)的主要問題，闡明熱應激對奶牛機體影響的機制并找出相應的緩解措施是當前研究的熱點。研究表明，夏季熱應激可能通過改變奶牛乳腺組織物質(zhì)代謝而影響泌乳量和乳成分[1]。Li等[2]在體外建立奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)熱應激模型，運用微陣列分析鑒定出2 716個基因在熱應激和正常BMECs中差異表達，這些差異表達基因參與調(diào)控細胞骨架、細胞周期和應激反應等。熱應激可誘導氧化應激，機體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化而使組織和細胞受到損傷[3-4]。權素玉等[5]發(fā)現(xiàn)熱應激可顯著降低BMECs的存活率，引起細胞氧化應激。胡菡等[6]研究發(fā)現(xiàn)，42 ℃熱處理0.5 h后BMECs中熱休克轉(zhuǎn)錄因子-1(HSF-1)、熱休克蛋白27(HSP27)、熱休克蛋白70(HSP70)mRNA表達上調(diào)，其中HSP70 mRNA表達量在短時間內(nèi)迅速升高。熱應激引起的ROS水平升高導致母畜乳腺組織發(fā)生氧化損傷，乳腺功能下降是影響泌乳量的重要因素[7]。因此，如何緩解熱應激對奶牛乳腺造成的氧化應激以提高乳腺功能，已成為畜牧工作者急需解決的問題。

近年來，國內(nèi)外關于中草藥和植物提取物緩解奶牛熱應激的報道眾多。Wang等[8]研究表明，黃芪甲苷預處理牛乳腺上皮細胞(MAC-T)能有效抑制細胞內(nèi)ROS水平的升高和細胞凋亡率。在人醫(yī)臨床上，柴胡是一種普遍使用的解熱藥，已被證明具有很好的解熱療效[9]。柴胡中的主要活性成分包括柴胡皂苷類、揮發(fā)油和多糖等[10]，柴胡皂苷及水解后的皂苷元是主要的解熱物質(zhì)[11]。金國泰等[12]發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷對大鼠的發(fā)熱反應可起到明顯降溫作用。有大量研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷能夠發(fā)揮抗炎抗腫瘤活性，可通過降低過氧化氫(H2O2)誘導的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、應激活化蛋白激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化而有效降低氧化應激損傷，提高細胞在應激狀態(tài)下的存活率[13-14]。柴胡皂苷具有較強的抗氧化功能，可顯著抑制ROS和丙二醛(MDA)的產(chǎn)生，增強超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的活性[15]。在本課題組的前期研究中，在飼糧中添加柴胡提取物飼養(yǎng)熱應激奶牛，發(fā)現(xiàn)適當劑量的柴胡提取物可降低奶牛直腸溫度，提高熱應激奶牛的舒適度，增加奶牛干物質(zhì)采食量，進而提高泌乳性能，改善乳品質(zhì)[16-17]。然而，柴胡提取物中是哪種物質(zhì)發(fā)揮有效作用尚不清楚。因此，為進一步明確柴胡提取物中具有緩解奶牛熱應激的有效物質(zhì)是否為柴胡皂苷a(SSa)和柴胡皂苷d(SSd)及深入探究其作用機制，本試驗建立體外熱應激BMECs模型，探討SSa和SSd對熱誘導的BMECs氧化應激的保護作用及對熱休克蛋白基因表達的影響，為研制抗氧化及緩解奶牛熱應激的飼料添加劑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及試驗設計

以含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮BMECs，置于38 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞長到80%～90%時，用0.25%胰酶消化細胞，并以1×104個/cm2的數(shù)量接種于6孔板中。陰性對照組：在接種BMECs的6孔板中加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，于38 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。陽性對照組：在接種BMECs的6孔板中加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，于42 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、4、8、12和24 h。處理組：BMECs在含0.1、1.0 μmol/L SSa或0.01、0.10 μmol/L SSd的誘導培養(yǎng)基中38 ℃培養(yǎng)4 h(SSa和SSd作用細胞時間)后，42 ℃分別處理1、4、8、12和24 h，每個處理3個重復。

1.2.2 細胞中抗氧化物酶活性的測定

收集細胞和培養(yǎng)液，采用比色法測定陰性對照組、陽性對照組和各處理組BMECs中SOD、GSH-Px、CAT活性和培養(yǎng)液中MDA含量，分別在560、420、405和532 nm處檢測吸光度(OD)值。

1.2.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測BMECs中熱休克蛋白基因表達

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用2-△△Ct法對BMECs熱休克蛋白基因表達進行相對定量分析。試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件中的GLM進行分析。采用Duncan氏法進行均值多重比較，試驗結(jié)果以“平均值±標準誤”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱誘導對BMECs抗氧化能力的影響

42 ℃熱誘導對BMECs中抗氧化酶活性及培養(yǎng)液中MDA含量的影響見表2。在陽性對照組中，BMECs中SOD和GSH-Px活性均顯著低于陰性對照組(P<0.05)；BMECs中CAT活性在熱誘導1、4和8 h時較正常培養(yǎng)條件下的陰性對照組未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，在熱誘導12和24 h時則顯著低于陰性對照組(P<0.05)。當42 ℃培養(yǎng)24 h時，BMECs培養(yǎng)液中MDA含量急劇上升，顯著高于陰性對照組(P<0.05)。

表2 熱誘導對BMECs中抗氧化酶活性及培養(yǎng)液中MDA含量的影響Table 2 Effects of heat induction on activities of antioxidant enzymes and content of MDA in culture medium

2.2 SSa和SSd對熱誘導的BMECs氧化應激的緩解

2.2.1 SSa和SSd對熱誘導的BMECs中SOD、GSH-Px和CAT活性的影響

不同濃度的SSa和SSd對熱誘導的BMECs中SOD活性的影響見表3。與相同熱誘導時間的陽性對照組相比，在熱誘導1 h時，0.1、1.0 μmol/L SSa和0.10 μmol/L SSd處理組BMECs中SOD活性顯著提高(P<0.05)；在熱誘導4 h時，0.1 μmol/L SSa處理組BMECs中SOD活性顯著提高(P<0.05)；在熱誘導8 h時，0.1 μmol/L SSa對BMECs中SOD活性無顯著影響(P>0.05)，但1.0 μmol/L SSa和0.01、0.10 μmol/L SSd可使BMECs中SOD活性顯著降低(P<0.05)；在熱誘導24 h時，各處理組BMECs中SOD活性均顯著降低(P<0.05)。

表3 不同濃度SSa和SSd對熱誘導的BMECs中SOD活性的影響 Table 3 Effects of different concentrations of SSa and SSd on SOD activity in heat induced BMECs U/mL

不同濃度SSa和SSd對熱誘導的BMECs中GSH-Px活性的影響見表4。與相同熱誘導時間的陽性對照組相比，在熱誘導1 h時，1.0 μmol/L SSa和0.01、0.10 μmol/L SSd處理組BMECs中GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)；在熱誘導4 h時，任意濃度的SSa和SSd均能顯著提高BMECs中GSH-Px活性(P<0.05)；在熱誘導12和24 h時，0.01 μmol/L SSd組BMECs中GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)，而1.0 μmol/L SSa處理組BMECs中GSH-Px活性則顯著降低(P<0.05)。

表4 不同濃度SSa和SSd對熱誘導的BMECs中GSH-Px活性的影響Table 4 Effects of different concentrations of SSa and SSd on GSH-Px activity in heat induced BMECs U/mL

不同濃度SSa和SSd對熱誘導的BMECs中CAT活性的影響見表5。與相同熱誘導時間的陽性對照組相比，0.01 μmol/L SSd在熱誘導1 h時顯著提高了BMECs中CAT活性(P<0.05)；在熱誘導4 h時，1.0 μmol/L SSa處理組BMECs中CAT活性顯著提高(P<0.05)；在熱誘導8 h時，0.1 μmol/L SSa和0.01 μmol/L SSd處理組BMECs中CAT活性顯著提高(P<0.05)，而1.0 μmol/L SSa和0.10 μmol/L SSd處理組BMECs中CAT活性則顯著降低(P<0.05)。

表5 不同濃度SSa和SSd對熱誘導的BMECs中CAT活性的影響Table 5 Effects of different concentrations of SSa and SSd on CAT activity in heat induced BMECs U/mL

2.2.2 不同濃度SSa和SSd對熱誘導的BMECs培養(yǎng)液中MDA含量的影響

不同濃度SSa和SSd對熱誘導的BMECs培養(yǎng)液中MDA含量的影響見表6。與相同熱誘導時間的陽性對照組相比，在熱誘導1和8 h時，任意濃度的SSa和SSd對培養(yǎng)液中MDA含量均無顯著影響(P>0.05)；在熱誘導12 h時，0.10 μmol/L SSd顯著提高了培養(yǎng)液中MDA含量(P<0.05)；在熱誘導24 h時，0.01 μmol/L SSd顯著降低了培養(yǎng)液中MDA含量(P<0.05)。

表6 不同濃度SSa和SSd對熱誘導的BMECs培養(yǎng)液中MDA含量的影響 Table 6 Effects of different concentrations of SSa and SSd on MDA content in culture medium of heat induced BMECs mmol/L

2.3 SSa和SSd對熱誘導的BMECs中熱休克蛋白基因表達的影響

如圖1所示，在42 ℃熱誘導條件下，BMECs中HSF-1和HSP70 mRNA相對表達量較陰性對照組在不同熱誘導時間下均顯著上調(diào)(P<0.05)，并且隨著熱誘導時間的延長而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在熱誘導4 h后相對表達量不再升高，但與陰性對照組相比仍然顯著上調(diào)(P<0.05)，直至熱誘導24 h時。在熱誘導8 h時，0.1 μmol/L SSa處理組BMECs中HSF-1 mRNA相對表達量較陽性對照組顯著提高(P<0.05)；任意濃度的SSa和SSd在熱誘導12 h時對BMECs中HSF-1 mRNA相對表達量均無顯著影響(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖2同。Data columns with different small letters indicated significant difference (P<0.05),while with the same small letters indicated no significant difference (P>0.05).The same as Fig.2.圖1 不同濃度SSa和SSd對熱誘導的BMECs中HSF-1 mRNA相對表達量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of SSa and SSd on mRNA relative expression level of HSF-1 in heat induced BMECs

如圖2所示，與陰性對照組相比，在熱誘導1 h時，任意濃度的SSa和SSd均能夠顯著提高BMECs中HSP70 mRNA相對表達量(P<0.05)；在熱誘導4和8 h時，0.1 μmol/L SSa和0.10 μmol/L SSd能夠顯著提高BMECs中HSP70 mRNA相對表達量(P<0.05)；在熱誘導12和24 h時，0.01 μmol/L SSd處理組BMECs中HSP70 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。

圖2 不同濃度SSa和SSd對熱誘導的BMECs中HSP70 mRNA相對表達量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of SSa and SSd on mRNA relative expression level of HSP70 in heat induced BMECs

3 討 論

3.1 熱處理對BMECs抗氧化能力的影響

熱應激會引起機體代謝增強，產(chǎn)生過量的ROS而發(fā)生氧化應激[18-19]。機體內(nèi)存在一套復雜的抗氧化防御系統(tǒng)，SOD是重要的內(nèi)源性抗氧化物酶，SOD催化ROS生成H2O2和氧氣(O2)[20]，GSH-Px和CAT進一步將H2O2分解生成H2O和O2，從而使細胞免受氧化應激損傷[21-22]。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，通常用MDA含量來評價脂質(zhì)過氧化的程度[23]。本試驗結(jié)果表明，在陽性對照組BMECs中SOD和GSH-Px活性較陰性對照組顯著降低，熱誘導8 h時，BMECs中CAT活性也顯著降低。隨著熱誘導時間的延長，BMECs培養(yǎng)液中MDA含量逐漸增加，在42 ℃處理24 h時，培養(yǎng)液中MDA含量達到最大值，表明42 ℃熱處理能夠誘導BMECs發(fā)生氧化應激。

3.2 SSa和SSd對熱誘導的BMECs抗氧化能力的影響

研究表明，植物提取物不僅對動物的免疫功能發(fā)揮調(diào)控作用，還能通過減少ROS的產(chǎn)生而作為抗氧化劑使用[24-25]。關于柴胡皂苷的藥理作用的研究發(fā)現(xiàn)，SSa和SSd具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化應激、抑制細胞凋亡等作用[13]。基于純化的柴胡皂苷單體的研究表明，SSa[26]和SSd[27]可提高細胞抗氧化能力，清除ROS，抑制脂質(zhì)過氧化。Chen等[28]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射SSa能夠緩解香煙煙霧引起的小鼠肺臟組織損傷，抑制MDA的生成，且激活肺組織中與氧化應激相關的核因子E2相關因子2(Nrf2)信號通路。SSa具有良好的抗炎和抗氧化作用，SSa可顯著抑制脂多糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞ROS的產(chǎn)生及炎癥因子的表達[29]。何燕等[30]研究表明，SSd可顯著降低肝纖維化大鼠血清和肝臟中MDA的含量，緩解大鼠的脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象。SSd能夠通過抑制MDA的產(chǎn)生和提高SOD的活性來發(fā)揮抗氧化作用，減輕四氯化碳(CCl4)誘導的急性肝細胞損傷[31]。GSH-Px是具有一種較強的抗氧化應激作用的酶，可提高細胞抗氧化和清除自由基的能力，保護細胞免受氧化應激損傷。李素婷等[32]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加不同濃度的SSd可以緩解乙醇誘導的原代大鼠肝細胞損傷，顯著提高細胞中GSH-Px活性，增強細胞抗氧化能力。SSd顯著降低H2O2誘導的大鼠腎上腺嗜鉻細胞(PC12)MDA的釋放，提高SOD活性和總抗氧化能力，并且SSd能夠抑制ROS積累，阻斷絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)依賴性氧化損傷而緩解H2O2誘導的細胞凋亡[33]。熱應激奶牛生產(chǎn)試驗結(jié)果表明，飼糧中添加柴胡提取物可降低奶牛直腸溫度，改變奶牛血液代謝，提高熱應激奶牛產(chǎn)奶量和乳蛋白產(chǎn)量，降低乳中體細胞數(shù)[17]。本試驗結(jié)果表明，與陽性對照組相比，培養(yǎng)基中添加任意濃度的SSa均能夠顯著提高熱誘導1 h時BMECs中SOD活性；在熱誘導4、8和24 h時，0.1 μmol/L SSa組BMECs中CAT活性較陽性對照組顯著提高；培養(yǎng)基中添加0.01 μmol/L SSd在熱誘導1、4、8、12和24 h時均能顯著提高BMECs中GSH-Px活性。上述結(jié)果表明適宜濃度的SSa和SSd可以通過提高BMECs中抗氧化酶活性而增強抗氧化能力。在熱誘導24 h時，0.01 μmol/L SSd顯著降低了BMECs培養(yǎng)液中MDA含量。本研究中所利用的細胞模型與上述研究不同，但本質(zhì)都是探究SSa和SSd對細胞抗氧化能力的影響，本試驗證明較低劑量的SSa(0.1 μmol/L)和SSd(0.01 μmol/L)對熱誘導的BMECs氧化應激有較好的緩解作用，可能是由于SSa和SSd能夠增強BMECs中抗氧化物酶的活性并且抑制脂質(zhì)過氧化作用。

研究表明，柴胡皂苷的藥理學和毒理學效應與劑量相關[34]，腹腔注射較大劑量的SSa后小鼠出現(xiàn)毒性反應[35]。Chen等[36]研究了SSd對人肝細胞的毒性作用，結(jié)果表明，SSd呈劑量依賴性抑制細胞活力，0.4 μmol/L SSd顯著抑制細胞增殖，該濃度下細胞線粒體膜電位降低，B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)基因表達下調(diào)，標志細胞凋亡的Bcl-2相關X蛋白(Bax)基因表達上調(diào)。SSa會以劑量依賴的方式增加表皮角質(zhì)細胞(HEKa)中ROS的產(chǎn)生，降低線粒體膜電位，誘導HEKa凋亡[37]。Wang等[38]也發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L SSa會誘導癌細胞產(chǎn)生ROS，導致細胞凋亡，且SSa較SSd細胞毒性更強。研究發(fā)現(xiàn)，長時間、多次為大鼠灌服柴胡皂苷粗提物會導致大鼠肝臟毒性損傷，且損傷途徑與氧化損傷機制有關[39]。本試驗結(jié)果表明，在熱誘導12和24 h時，培養(yǎng)基中添加1.0 μmol/L SSa和0.10 μmol/L SSd對BMECs中SOD、GSH-Px和CAT活性無顯著改善作用，或者顯著降低了以上抗氧化酶的活性，說明高濃度的SSa和SSd可能會對細胞產(chǎn)生毒性作用。在熱誘導12 h時，0.10 μmol/L SSd組培養(yǎng)液中MDA的含量顯著升高，表明SSa和SSd對BMECs氧化應激的緩解作用存在劑量依賴性，較高濃度的SSa或SSd可能會隨著熱處理時間的延長對BMECs產(chǎn)生不利影響。本研究進一步證實了SSa和SSd 既是柴胡發(fā)揮功效的主要化學單體成分，又是其產(chǎn)生毒性的主要物質(zhì)基礎。

3.3 SSa和SSd對熱誘導的BMECs中熱休克蛋白基因表達的影響

熱休克反應是細胞應對高溫的適應性機制，對于熱應激下細胞的存活至關重要[40]，若不及時采取緩解措施，持續(xù)熱應激會導致細胞死亡。在體外，暴露于高溫環(huán)境會導致BMECs增殖停滯并誘導細胞凋亡[41]。HSF-1是調(diào)節(jié)熱休克蛋白(HSPs)基因表達的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，在細胞遭受熱應激時，HSF-1啟動轉(zhuǎn)錄過程，促進HSPs的表達，從而對錯誤折疊蛋白進行修復，提高細胞抵抗熱應激的能力[42-43]。HSPs的大量表達是熱應激狀態(tài)下一種重要的內(nèi)源性保護機制，HSF-1和HSPs表達的上調(diào)可增強細胞的穩(wěn)定性，并在熱應激條件下形成耐熱性[41]。本試驗結(jié)果表明，在42 ℃熱處理下，BMECs中HSF-1和HSP70基因的表達均顯著上調(diào)，并且隨著熱處理時間的延長而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，表明BMECs在熱處理條件下啟動了HSPs的內(nèi)源性保護機制，并且BMECs產(chǎn)生了熱耐受性。

Guo等[44]研究發(fā)現(xiàn)，HSP70可通過調(diào)節(jié)GSH-Px的活性以應對氧化應激，并且提出這可能是HSPs在應激狀態(tài)下發(fā)揮保護細胞功能的一種作用機制。Choi等[45]探討HSP70與抗氧化酶的關系時發(fā)現(xiàn)，敲除HSP70基因后小鼠中SOD活性和SOD蛋白表達水平與對照組小鼠相比顯著降低，推測HSP70可能通過轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后修飾參與了SOD的表達調(diào)控。HSPs可通過調(diào)節(jié)細胞的氧化狀態(tài)來保護細胞免受熱和氧化應激的損傷，同時，一些外源性的添加物有助于調(diào)控熱休克相關基因的表達，從而改善細胞的抗氧化能力[46]。天然植物來源的化合物可能通過其生物和藥理活性來誘導應激條件下HSPs的表達，從而增強機體或者細胞在應激狀態(tài)下的抗氧化能力[47]。Zhang等[48]用SSd處理高溫誘導的豬腎近端小管上皮細胞，HSP72 mRNA和蛋白表達均顯著增加，且呈劑量依賴性。本試驗中，在熱誘導1 h時，0.01 μmol/L SSd能顯著提高BMECs中HSP70 mRNA相對表達量，同時BMECs中SOD和GSH-Px活性較陽性對照組顯著升高；在熱誘導12和24 h時，0.01 μmol/L SSd能夠顯著提高BMECs中HSP70 mRNA相對表達量，BMECs中GSH-Px活性較陽性對照組也顯著提高，但高濃度的SSa和SSd卻對HSP70 mRNA相對表達量無顯著影響，說明隨著熱處理時間的延長，高濃度的SSa和SSd不能起到緩解BMECs熱應激的作用，反而會對熱誘導條件下的BMECs產(chǎn)生不利影響，該結(jié)論與Zhang等[48]的研究結(jié)果相似。本試驗僅研究了SSa和SSd對熱誘導的BMECs中HSF-1和HSP70基因表達的影響，其作用通路及影響機制還有待進一步探究。

4 結(jié) 論

42 ℃高溫會誘導BMECs發(fā)生氧化應激，并引發(fā)細胞熱休克反應。在BMECs培養(yǎng)基中添加不同濃度的SSa和SSd會以劑量依賴性的方式提高熱誘導條件下BMECs中SOD、GSH-Px和CAT的活性，降低培養(yǎng)液中MDA的含量；同時，較低濃度的SSa和SSd可顯著提高HSF-1和HSP70 mRNA相對表達量，且HSP70基因表達上調(diào)可能與細胞中抗氧化物酶活性增強存在關聯(lián)。綜上可知，0.1 μmol/L SSa和0.01 μmol/L SSd對熱誘導條件下BMECs的氧化應激損傷有較好的緩解作用。