瑞芬太尼通過調(diào)控miR-212-3p/LIN28B表達(dá)影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

唐婧英 李選發(fā) 鄧小華 陳俏江 吳向雅

(1海南省人民醫(yī)院麻醉科，海南 ?？?570311；2海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科；3海南省定安縣人民醫(yī)院麻醉科)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和致死率，對女性生命健康造成極大的威脅。子宮內(nèi)膜癌的治療以手術(shù)為主，輔助放療、化療等。但是患者預(yù)后較差，5年生存率較低〔1〕，因此尋找早期治療靶點(diǎn)和有效藥物是腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。阿片類藥物在晚期癌痛的治療中較為常用，瑞芬太尼是一種阿片類藥物，主要用于臨床麻醉〔2〕。研究顯示，瑞芬太尼可通過抑制Akt通路及調(diào)控B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2/Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡〔3〕。然而，瑞芬太尼能否影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞惡性行為還未知。miR-212-3p是一種微小RNA(miRNA)，其在骨肉瘤、胰腺癌、胃癌等細(xì)胞中低表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等密切相關(guān)，是潛在的治療靶點(diǎn)〔4～6〕。生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，Lin-28同源物B(LIN28B)可能是miR-212-3p的靶基因。LIN28B屬于高度保守的鋅指家族蛋白成員，其在肝癌、胃癌、宮頸癌等癌組織或細(xì)胞中異常表達(dá)，可作為患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)〔7～9〕。

但目前，miR-212-3p/LIN28B對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞惡性行為的影響也還未知。本研究以miR-212-3p/LIN28B軸為切入點(diǎn)，探討瑞芬太尼對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa增殖、遷移和侵襲的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和試劑 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株，上海素爾生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、北京索萊寶；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，美國Sigma公司；引物序列、miR-212-3p 模擬物(mimics)和抑制劑(anti-miR-212-3p)、模擬對照序列(miR-NC)及抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、LIN28B小干擾RNA(si-LIN28B)及小干擾RNA陰性序列(si-NC)，廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒，大連寶生物；兔抗人LIN28B、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9抗體均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒，美國Promega公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇Ishikawa細(xì)胞，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時，胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將濃度2.5×104個/ml的對數(shù)期Ishikawa細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1.0 ml。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，換為不含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。利用LipofectamineTM2000試劑盒，分別將miR-NC、miR-212-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-212-3p、si-NC、si-LIN28B轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，換為含完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-212-3p或Western印跡檢測LIN28B蛋白表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，并收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞分組處理 將Ishikawa細(xì)胞分為瑞芬太尼0 ng/ml組、瑞芬太尼5 ng/ml組、瑞芬太尼50 ng/ml組和瑞芬太尼500 ng/ml組，細(xì)胞分別用含0、5、50、500 ng/ml〔10〕瑞芬太尼的培養(yǎng)基干預(yù)24 h。將轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-212-3p mimics、si-NC、si-LIN28B的細(xì)胞均用不含瑞芬太尼的培養(yǎng)基干預(yù)24 h，并分別記為miR-NC組、miR-212-3p組、si-NC組、si-LIN28B組。將轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-212-3p的細(xì)胞均用含500 ng/ml 瑞芬太尼的培養(yǎng)基干預(yù)24 h，記為瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC組、瑞芬太尼500 ng/mL+anti-miR-212-3p組。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖 將濃度2.5×104個/ml的Ishikawa細(xì)胞及轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-212-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-212-3p、si-NC、si-LIN28B的細(xì)胞均接種于96孔板中，每孔200 μl，培養(yǎng)箱12 h后，棄培養(yǎng)基，按照上述1.2.2分組處理。培養(yǎng)結(jié)束后，加20 μl MTT(5 mg/ml)，培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄上清液，加150 μl二甲基亞砜，混合均勻，酶標(biāo)儀于490 nm處測定吸光度(A)值。以0 ng/ml的瑞芬太尼處理組細(xì)胞的吸光值作為對照，計(jì)算抑制率。增殖抑制率(%)=(A對照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對照組×100%。

1.2.4Transwell法檢測細(xì)胞的遷移和侵襲 將濃度2.5×104個/ml的Ishikawa細(xì)胞及轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-212-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-212-3p、si-NC、si-LIN28B的細(xì)胞均接種于6孔板中，每孔2.5 ml，培養(yǎng)箱12 h后，棄培養(yǎng)基，按照上述1.2.2分組處理。培養(yǎng)結(jié)束后，棄培養(yǎng)基，收集各組細(xì)胞。將各組細(xì)胞用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基調(diào)整濃度為1.0×105個/ml。遷移實(shí)驗(yàn)：取100 μl各組細(xì)胞懸液加至Transwell小室上室，500 μl含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基加至下室。培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min。用PBS清洗后，顯微鏡觀察，隨機(jī)取5個視野計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：預(yù)先在Transwell小室上室鋪設(shè)基質(zhì)膠，自然晾干后，加100 μl細(xì)胞懸液，其余操作與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.5qRT-PCR檢測miR-212-3p和LIN28B mRNA表達(dá) 用Trizol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA純度的濃度后，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件，95預(yù)變性5 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行45個循環(huán)。采用 2-△△Ct法計(jì)算miR-212-3p相對U6、LIN28B mRNA相對GAPDH的表達(dá)量。

1.2.6Western印跡檢測蛋白表達(dá) 用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，投井下二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度后，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將分離后蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。4℃冰箱中分別用LIN28B、CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9和GAPDH一抗孵育過夜。洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HPR)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。洗膜后，滴加顯影液，避光顯影。Bio-radChem DOC MP全能型成像分析系統(tǒng)拍照，并分析目的蛋白相對GAPDH的表達(dá)量。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因 TargetScan生物信息學(xué)系統(tǒng)預(yù)測顯示，LIN28B的3′UTR中含有與miR-212-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，有上海生工生物工程有限公司分別構(gòu)建含有結(jié)合位點(diǎn)的LIN28B野生型重組質(zhì)粒(WT-LIN28B)和突變型重組質(zhì)粒(MUT-LIN28B)。將濃度2.5×104個/ml的對數(shù)期Ishikawa細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1.0 ml。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，換為不含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。利用LipofectamineTM2000試劑盒，分別共轉(zhuǎn)染miR-212-3p mimics與WT-LIN28B、miR-NC與WT-LIN28B、miR-212-3p mimics與MUT-LIN28B、miR-NC與MUT-LIN28B至Ishikawa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，換為含完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒操作說明，檢測熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1瑞芬太尼對Ishikawa細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響 瑞芬太尼5 ng/ml組、瑞芬太尼50 ng/ml組和瑞芬太尼500 ng/ml組Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞中p21蛋白表達(dá)顯著高于瑞芬太尼0 ng/ml組(P<0.05)，細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)量及細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)低于瑞芬太尼0 ng/ml組(P<0.05)，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見圖1、圖2、表1。

1～4:瑞芬太尼0 ng/ml組、瑞芬太尼5 ng/ml組、瑞芬太尼50 ng/ml組、瑞芬太尼500 ng/ml組，圖3同圖1 瑞芬太尼對Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 瑞芬太尼對Ishikawa細(xì)胞遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表1 瑞芬太尼對Ishikawa細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響

2.2瑞芬太尼對Ishikawa細(xì)胞中miR-212-3p和LIN28B表達(dá)的影響 瑞芬太尼5 ng/ml組、瑞芬太尼50 ng/ml組和瑞芬太尼500 ng/ml組Ishikawa細(xì)胞中miR-212-3p表達(dá)高于瑞芬太尼0 ng/ml組(P<0.05)，LIN28BmRNA和蛋白的表達(dá)低于瑞芬太尼0 ng/ml組(P<0.05)，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 瑞芬太尼對Ishikawa細(xì)胞中LIN28B蛋白表達(dá)的影響

表2 瑞芬太尼對Ishikawa細(xì)胞中miR-212-3p和LIN28B表達(dá)的影響

2.3miR-212-3p靶向調(diào)控LIN28B的表達(dá) TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，LIN28B的3′UTR中含有與miR-212-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖4。共轉(zhuǎn)染miR-212-3p mimics與WT-LIN28B的Ishikawa細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-NC與WT-LIN28B的Ishikawa細(xì)胞(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染miR-212-3p與MUT-LIN28B的Ishikawa細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miR-NC與WT-LIN28B的Ishikawa細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。miR-212-3p組Ishikawa細(xì)胞中miR-212-3p表達(dá)量(2.86±0.24)顯著高于miR-NC組(1.01±0.08，t=21.938，P<0.05)；LIN28B蛋白表達(dá)量(0.23±0.03)顯著低于miR-NC組(0.65±0.06，t=18.783，P<0.05)，見圖5。

圖4 LIN28B的3′UTR中含有與miR-212-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖5 miR-212-3p調(diào)控LIN28B蛋白的表達(dá)

2.4過表達(dá)miR-212-3p對Ishikawa細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響 miR-212-3p組Ishikawa細(xì)胞中細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞中p21蛋白表達(dá)均顯著高于miR-NC組(P<0.05)，細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)及細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)均顯著低于miR-NC(P<0.05)。見表4、圖6。

表4 過表達(dá)miR-212-3p對Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖6 過表達(dá)miR-212-3p對Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5抑制LIN28B表達(dá)對Ishikawa細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響 si-LIN28B組Ishikawa細(xì)胞中LIN28B蛋白水平、細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)及細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)顯著低于si-NC組(P<0.05)，增殖抑制率及細(xì)胞中p21蛋白表達(dá)均顯著高于si-NC組(P<0.05)。見圖7、表5。

圖7 抑制LIN28B對Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表5 抑制LIN28B對Ishikawa細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響

2.6抑制miR-212-3p逆轉(zhuǎn)了瑞芬太尼(500 ng/ml)對Ishikawa細(xì)胞增殖和遷移侵襲的作用 瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-212-3p組細(xì)胞中miR-212-3p表達(dá)水平、增殖抑制率及細(xì)胞中p21蛋白表達(dá)均低于瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC組(P<0.05)，細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)及細(xì)胞中LIN28B、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)均顯著高于瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC組(P<0.05)。見表6、圖8。

表6 抑制miR-212-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了瑞芬太尼對Ishikawa細(xì)胞增殖和遷移侵襲的作用

1，2：瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC組，瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-212-3p組圖8 抑制miR-212-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了瑞芬太尼對Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

3 討 論

腫瘤是一種細(xì)胞增殖紊亂疾病，抑制腫瘤細(xì)胞的異常增殖可起抗腫瘤的作用〔11〕。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，細(xì)胞周期調(diào)控的紊亂是細(xì)胞增殖失控的主要原因〔12〕。CyclinD1可通過激活細(xì)胞周期依賴性激酶調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分裂，參與腫瘤的發(fā)生〔13〕。本研究結(jié)果提示瑞芬太尼可能通過調(diào)節(jié)CyclinD1、p21阻礙子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤細(xì)胞的基本生物學(xué)特征〔14〕。MMP可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔15〕。本研究結(jié)果提示瑞芬太尼可能通過調(diào)控MMP-2和MMP-9抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞遷移和侵襲。miRNA在基因表達(dá)過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生命學(xué)過程。研究表明，miRNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與患者預(yù)后密切相關(guān)〔16，17〕。miR-212-3p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)中低表達(dá)，miR-212-3p過表達(dá)可抑制GBM細(xì)胞的活力，其可能通過靶向調(diào)控SGK3表達(dá)抑制GBM細(xì)胞的增殖〔18〕。miR-212-3p通過調(diào)控SOX5表達(dá)可以抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療提供新的生物學(xué)靶點(diǎn)〔19〕。本研究結(jié)果提示miR-212-3p可作為子宮內(nèi)膜癌的潛在治療靶標(biāo)。通過采取有效的手段提高子宮內(nèi)膜癌患者機(jī)體內(nèi)miR-212-3p的表達(dá)，有助于該疾病的治療，延長患者生存期。

研究證實(shí)miRNA可通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展過程。如miR-125b可能通過調(diào)控LIN28B的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力〔20〕。本研究提示LIN28B作為促癌基因參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展，抑制LIN28B表達(dá)有助于延緩病情。