白芷提取物通過調(diào)控SBF2-AS1/miR-329-3p軸影響卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡

谷少華 劉巧方 李向南

(1新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院中醫(yī)產(chǎn)科，河南 新鄉(xiāng) 453500；2河南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院)

卵巢癌發(fā)病率與死亡率逐年增高，嚴(yán)重危害患者身體健康及生活質(zhì)量，目前臨床主要采用手術(shù)與放化療結(jié)合的方式治療卵巢癌，具有一定治療效果，但長期化療導(dǎo)致患者出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)〔1，2〕。既往研究顯示從天然物質(zhì)中提取有效成分用于治療惡性腫瘤成為研究重點，部分中藥已被證實可通過影響腫瘤細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等過程而發(fā)揮抗腫瘤作用，但中藥的抗腫瘤作用機(jī)制尚未完全闡明〔3〕。研究表明白芷對胃癌、直腸癌、食管癌、卵巢癌等惡性腫瘤具有一定的抑制作用〔4～6〕。但白芷對卵巢癌細(xì)胞生物行為及機(jī)制尚未可知。長鏈非編碼RNA(LncRNA)異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究表明長鏈非編碼RNA SBF2-AS1(LncRNA SBF2-AS1)在肺癌中上調(diào)表達(dá)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖〔7〕。但SBF2-AS1對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未可知。starBase預(yù)測顯示微小RNA-329-3p(miR-329-3p)可能是SBF2-AS1的靶基因，研究表明miR-329-3p在宮頸癌中表達(dá)下調(diào)，miR-329-3p過表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖〔8〕。但白芷對SBF2-AS1/miR-329-3p軸的調(diào)控作用及其對卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響尚未可知。本研究主要探討白芷提取物對卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，分析其對SBF2-AS1/miR-329-3p軸的調(diào)控作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 白芷提取物購自陜西嘉禾生物科技股份有限公司。卵巢癌細(xì)胞 A2780購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。DMEM培養(yǎng)基與0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Thermo Fisher公司；蛋白提取試劑盒購自陜西碧云天生物工程有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自 美國Sigma公司；SBF2-AS1小干擾RNA(si-SBF2-AS1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-329-3p模擬物(mimics)、陰性對照 mimic NC 序列(miR-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1購自上海索寶生物科技有限公司；Lipofectamine2000與Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；Primescript TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(反轉(zhuǎn)錄試劑盒)購自日本TaKaRa公司；SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自沈陽萬類生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報告基因載體及活性檢測試劑盒購自美國Promega公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、P21、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)一抗購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1實驗處理與分組 卵巢癌A2780細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞穩(wěn)定傳代后，收集對數(shù)生長期A2780細(xì)胞，用不同濃度(4 mg/ml、8 mg/ml、16 mg/ml)的白芷提取物處理A2780細(xì)胞，實驗分組：對照組(未經(jīng)任何處理的細(xì)胞)、白芷-L組(用終濃度為4 mg/ml的白芷提取物處理細(xì)胞24 h)、白芷-M組(用終濃度為8 mg/ml的白芷提取物處理細(xì)胞24 h)、白芷-H組(用終濃度為16 mg/ml的白芷提取物處理細(xì)胞24 h)。采用MTT檢測白芷提取物對A2780細(xì)胞活力的影響，選用抑制抑制作用約為50%的白芷濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。后續(xù)研究中為探討SBF2-AS1對A2780細(xì)胞增殖及凋亡的影響，實驗分組：si-NC組(si-NC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞24 h)、si-SBF2-AS1組(si-SBF2-AS1si-NC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞24 h)。為驗證白芷提取物是否通過調(diào)控SBF2-AS1而發(fā)揮作用，實驗分組：白芷-M+pcDNA3.1組(pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至細(xì)胞24 h，用含有終濃度為8 mg/ml的白芷提取物處理細(xì)胞24 h)、白芷-M+pcDNA3.1-SBF2-AS1組(pcDNA3.1-SBF2-AS1轉(zhuǎn)染至細(xì)胞24 h，用含有終濃度為8 mg/ml的白芷提取物處理細(xì)胞24 h)。

1.2.2MTT檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期A2780細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至3×104個/ml，按照每孔100 μl接種至96孔板，按照1.2.1分組處理，分別于作用24 h、48 h、72 h時，每孔加入20 μl MTT(質(zhì)量濃度5 mg/ml)，室溫孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，充分混勻，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(OD 490 nm)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組A2780細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌，加入500 μl結(jié)合緩沖液，加入5 μl Annexin V-FITC，充分混勻，加入5 μl PI，室溫避光孵育10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測細(xì)胞中SBF2-AS1、miR-329-3p表達(dá)水平 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，參照Primescript TMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將總RNA合成cDNA，SBF2-AS1正向引物5′-CACGACCCAGAAGGAGTCTAC-3′，反向引物：5′-CCCGGTACCTTCCTGTCATA-3′；miR-329-3p正向引物5′-GGGAACACACCTGGTTAAC-3′，反向引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。qRT-PCR反應(yīng)以cDNA為模板，參照SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃ 2 min(循環(huán)1次)，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s(循環(huán)40次)，SBF2-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-329-3p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算SBF2-AS1、miR-329-3p相對表達(dá)量。

1.2.5雙熒光素酶報告基因檢測 starBase預(yù)測SBF2-AS1與miR-329-3p存在結(jié)合位點，將結(jié)合位點載入熒光素酶報告基因載體構(gòu)建野生型載體WT-SBF2-AS1，利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點進(jìn)行突變，將突變位點載入熒光素酶報告基因載體構(gòu)建突變型載體MUT-SBF2-AS1，取對數(shù)生長期A2780細(xì)胞，隨機(jī)分成4組：WT-SBF2-AS1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組、WT-SBF2-AS1+miR-329-3p mimics共轉(zhuǎn)染組、MUT-SBF2-AS1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組、MUT-SBF2-AS1+miR-329-3p mimics共轉(zhuǎn)染組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞檢測熒光素酶活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。qRT-PCR法檢測SBF2-AS1對miR-329-3p的調(diào)控作用，取對數(shù)生長期A2780細(xì)胞隨機(jī)分成4組：pcDNA3.1組、pcDNA3.1-SBF2-AS1組、si-NC組、si-SBF2-AS1組，檢測各組細(xì)胞中miR-329-3p的表達(dá)水平。

1.2.6Western印跡檢測CyclinD1、Bcl-2、P21、Bax蛋白表達(dá) 收集各組A2780細(xì)胞，加入適量蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，按照BCA試劑盒操作測定蛋白濃度，每孔30 μg蛋白上樣量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳反應(yīng)條件：80 V 30 min，120 V 90 min，分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫條件下采用5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗稀釋液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗滌，孵育二抗稀釋液(1∶2 000)，TBST洗滌，暗室內(nèi)曝光，顯影，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)及ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析、LSD-t檢驗、Kruska-WallisH檢驗。

2 結(jié) 果

2.1白芷對A2780細(xì)胞增殖的影響 與對照組相比，白芷-L組、白芷-M組、白芷-H組A2780細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，白芷-H組A2780細(xì)胞活力顯著低于白芷-L組、白芷-M組(P<0.05)，白芷-M組A2780細(xì)胞活力顯著低于白芷-L組(P<0.05)，選用抑制作用約為50%的白芷濃度白芷-M(40 μg/ml)做后續(xù)實驗，見表1。Western印跡檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，白芷-L組、白芷-M組、白芷-H組A2780細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，P21蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，且白芷不同劑量組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 白芷對細(xì)胞A2780增殖蛋白表達(dá)的影響

表1 白芷對細(xì)胞A2780增殖的影響

2.2白芷對A2780細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較，白芷-M組A2780細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見圖2、表2。

A：白芷對細(xì)胞A2780凋亡的影響；B：白芷對細(xì)胞A2780凋亡蛋白表達(dá)的影響圖2 白芷對細(xì)胞A2780凋亡及凋亡蛋白表達(dá)的影響

表2 白芷對細(xì)胞A2780凋亡的影響

2.3白芷對A2780細(xì)胞中SBF2-AS1、miR-329-3p表達(dá)的影響 與對照組相比，白芷-M組A2780細(xì)胞中SBF2-AS1的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-329-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見表3。

表3 白芷對細(xì)胞A2780中SBF2-AS1、miR-329-3p表達(dá)的影響

2.4抑制SBF2-AS1對A2780細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與si-NC組相比，si-SBF2-AS1組A2780細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，P21、Bax蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見表4、圖3。

表4 抑制SBF2-AS1對細(xì)胞A2780增殖、凋亡的影響

圖3 抑制SBF2-AS1對細(xì)胞A2780增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.5過表達(dá)SBF2-AS1能逆轉(zhuǎn)白芷對A2780細(xì)胞增殖、凋亡的作用 與白芷-M+pcDNA3.1組比較，白芷-M+pcDNA3.1-SBF2-AS1組細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，SBF2-AS1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-329-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，P21、Bax蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見圖4、表5。

1～4:對照組、白芷-M組、白芷-M+pcDNA3.1組、白芷-M+pcDNA3.1-SBF2-AS1組圖4 過表達(dá)SBF2-AS1能逆轉(zhuǎn)白芷對細(xì)胞A2780增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表5 過表達(dá)SBF2-AS1能逆轉(zhuǎn)白芷對細(xì)胞A2780增殖、凋亡的影響

2.6SBF2-AS1靶向、調(diào)控miR-329-3p starBase預(yù)測顯示SBF2-AS1的3′UTR中含有與miR-329-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖5。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，與WT-SBF2-AS1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組相比，WT-SBF2-AS1+miR-329-3p共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；相較于MUT-SBF2-AS1+miR-NC共轉(zhuǎn)染組，MUT-SBF2-AS1+miR-329-3p共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性無明顯變化，見表6。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組(0.31±0.03)相比，pcDNA3.1-SBF2-AS1組A2780細(xì)胞中miR-329-3p的表達(dá)水平顯著降低(0.09±0.01，P<0.05)；與si-NC組(0.32±0.03)相比，si-SBF2-AS1組A2780細(xì)胞中miR-329-3p的表達(dá)水平顯著升高(0.69±0.07，P<0.05)。

圖5 SBF2-AS1靶向miR-329-3p

表6 雙熒光素酶報告實驗

3 討 論

長期化療導(dǎo)致卵巢癌患者出現(xiàn)化療耐藥性，還可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞惡性程度〔9〕。因而尋找副作用小且低廉有效的藥物對提高卵巢癌治療效果具有重要意義。研究表明中藥黃連素可有效抑制卵巢癌細(xì)胞增殖并可提高細(xì)胞凋亡率〔10〕。

白芷提取物可通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖及增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力而發(fā)揮抗癌活性〔11〕。白芷提取物還可通過激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗癌作用〔12〕。研究表明白芷中提取的歐前胡素還可通過調(diào)控mTOR/p70S6K/4E-BP1和MAPK途徑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及血管生成〔13〕。但白芷提取物對卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響尚未可知。本研究結(jié)果提示白芷提取物可有效抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可顯著促進(jìn)P21、Bax的表達(dá)，而抑制CyclinD1、Bcl-2的表達(dá)。研究表明CyclinD1在腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，并可通過調(diào)控細(xì)胞周期影響細(xì)胞增殖，P21可負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖〔14〕。細(xì)胞增殖與凋亡失衡是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因，研究表明Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡，而Bax可促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔15〕。提示白芷提取物可通過調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

SBF2-AS1通過競爭性吸附miR-619-5p而抑制其活性進(jìn)而上調(diào)HDAC3的表達(dá)最終促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及侵襲〔16〕。研究表明SBF2-AS1還可通過調(diào)節(jié)miR-361-5p/FOXM1軸進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展〔17〕。SBF2-AS1還可通過調(diào)孔miR-140-5p/TGFBR1途徑促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展〔18〕。但SBF2-AS1在卵巢癌中的作用機(jī)制尚未見報道。本研究結(jié)果提示沉默SBF2-AS1的表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究雙熒光素酶報告實驗與qRT-PCR實驗結(jié)果顯示SBF2-AS1可競爭性結(jié)合miR-329-3p，并可負(fù)向調(diào)控miR-329-3p的表達(dá)與活性。研究表明LncRNA TP73-AS1通過調(diào)控miR-329-3p / ARF1軸促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展〔19〕。miR-329-3p可靶向MAPK1而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，遷移及侵襲〔20〕。本研究提示白芷提取物可能通過抑制SBF2-AS1的表達(dá)及促進(jìn)miR-329-3p的表達(dá)從而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為驗證上述推測，本研究實驗結(jié)果顯示，SBF2-AS1過表達(dá)能逆轉(zhuǎn)白芷提取物對卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用。本研究首次證實白芷提取物可通過調(diào)控SBF2-AS1/miR-329-3p軸而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上，白芷提取物可有效抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，具有明顯的劑量依賴性，還可提高卵巢癌細(xì)胞凋亡率，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其主要通過調(diào)控SBF2-AS1/miR-329-3p軸而發(fā)揮抗腫瘤作用，可為卵巢癌治療提供新方向。