MicroRNA-129-5p在糖尿病性心肌病中的作用

孔德憶 孔霄

(1韓國(guó)嘉泉大學(xué)，韓國(guó) 首爾 13120；2曲阜市人民醫(yī)院心內(nèi)科)

糖尿病性心肌病是糖尿病的主要心血管并發(fā)癥，其特征是心肌纖維化、心室重構(gòu)和心臟功能障礙。線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、炎癥、鈣處理受損、腎素-血管緊張素系統(tǒng)活化及心肌細(xì)胞凋亡均與糖尿病性心肌病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)〔1，2〕。微小RNA(miRNAs)是一組由19～25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄后修飾進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而抑制miRNA的翻譯或促進(jìn)其降解，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究表明，miRNAs在糖尿病性心肌病的生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。miR-206-3p在高糖誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)靶向下調(diào)LXRα的表達(dá)促進(jìn)高糖介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔3〕；miR-146可能通過(guò)調(diào)節(jié)IRAK1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與糖尿病心肌損傷的發(fā)生發(fā)展〔4〕。然而，miR-129-5p在糖尿病性心肌病發(fā)病中的作用及機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。本文旨在探究miR-129-5p在高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中的表達(dá)及作用，為糖尿病合并心血管并發(fā)癥的診斷和治療提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 人H9C2心肌細(xì)胞購(gòu)自上海生物科學(xué)研究所。主要試劑及儀器：10%胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。miR-129-5p模擬物及其陰性對(duì)照物均購(gòu)自上海GenePharma公司。Lipofectamine?2000、TRIzol試劑和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。PCR試劑盒和基因引物均購(gòu)自Takara生物有限公司。CCK-8試劑盒購(gòu)于愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司。Ki67、Bax、酶切-caspase-3、β-actin和二抗均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，伯樂(lè)流式細(xì)胞儀ZE5購(gòu)于伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司(bio-rad)。多功能酶標(biāo)儀PerkinElmer EnVision購(gòu)于珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司 。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染分組 將H9C2心肌細(xì)胞置于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并在37℃、5% CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2心肌細(xì)胞接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用5.5 mmol/L葡萄糖(對(duì)照組)或50.0 mmol/L葡萄糖(高糖組)干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞96 h。最后，按照制造商的說(shuō)明，使用脂質(zhì)體Lipofectamine?2000將miR-129-5p模擬物(HG+miR-129-5p模擬物組)及其陰性對(duì)照物(HG+mimics-NC組)轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細(xì)胞中。

1.3qRT-PCR法檢測(cè)miR-129-5p的表達(dá)水平〔4〕對(duì)照組和高糖組干預(yù)H9C2心肌細(xì)胞不同時(shí)間(0、24、48、72、96 h)后，采用實(shí)時(shí)熒光聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞中miR-129-5p的相對(duì)表達(dá)水平。根據(jù)制造商說(shuō)明，使用TRIzol試劑盒提取H9C2心肌細(xì)胞中的總RNA，并采用紫外分光光度法檢測(cè)RNA濃度和純度，進(jìn)而合成互補(bǔ)DNA。使用SYBR Premix-Ex-Taq試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。以U6為內(nèi)參，miR-129-5p上游引物：5′-ACACTCCTTTTTGCGTCTGGGCTTGC-3′，下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.4ELISA檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α含量〔5〕采用ELISA檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-129-5p對(duì)H9C2心肌細(xì)胞上清液中炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平。取轉(zhuǎn)染后的H9C2心肌細(xì)胞接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，于4℃，1 000 r/min離心10 min，取細(xì)胞上清液。按照制造商的說(shuō)明書，應(yīng)用IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒分別檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β和TNF-α的含量。

1.5氧化應(yīng)激標(biāo)志物超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的測(cè)量〔6〕H9C2心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，按照制造商說(shuō)明書，應(yīng)用SOD和MDA試劑盒分別測(cè)定H9C2心肌細(xì)胞上清液中SOD和MDA的含量。

1.6CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞存活率 收集各組心肌細(xì)胞，并接種于96孔板中，接種密度為2×103個(gè)細(xì)胞/孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后每孔加入CCK-8試劑(10 μl)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后在酶標(biāo)儀上于波長(zhǎng)為450 nm處檢測(cè)吸光值。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞的凋亡〔7〕采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-129-5p對(duì)H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，用胰酶消化并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，將H9C2心肌細(xì)胞懸浮在100 μl上樣緩沖液中，并加入5 μl Annexin V-FITC，然后在黑暗中于室溫孵育15 min。隨后，添加5 μl PI后，將細(xì)胞在室溫下黑暗中孵育15 min。最后，按照試劑盒說(shuō)明書，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.8免疫印跡檢測(cè)各組細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的各組心肌細(xì)胞，加入裂解液裂解細(xì)胞后提取總蛋白，并對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉，洗膜后分別加入稀釋的Ki67(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、酶切-caspase-3(1∶500)和β-actin(1∶1 000)一抗，培養(yǎng)過(guò)夜后(4℃)，加入二抗(1∶2 000)，培養(yǎng)2 h后進(jìn)行顯影和拍照。

1.9統(tǒng)計(jì)分析方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組miR-129-5p表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，高糖組各時(shí)點(diǎn)H9C2心肌細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05，P<0.01,P<0.001)，且呈時(shí)間依賴關(guān)系，見(jiàn)表1。

表1 兩組不同時(shí)間H9C2心肌細(xì)胞中miR-129-5p相對(duì)表達(dá)比較

2.2各組心肌細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)比較 與對(duì)照組相比，高糖組H9C2心肌細(xì)胞中IL-1β、TNF-α和MDA相對(duì)含量顯著升高(P<0.01)，而SOD相對(duì)含量顯著降低(P<0.01)；與高糖+mimics-NC組相比，高糖+miR-129-5p模擬物組H9C2心肌細(xì)胞中IL-1β、TNF-α和MDA相對(duì)含量顯著降低(P<0.05,P<0.01)，而SOD相對(duì)含量顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組IL-1β、TNF-α、SOD和MDA相對(duì)含量及細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.3各組心肌細(xì)胞存活率比較 與對(duì)照組〔(100.00±6.78)%〕相比，高糖組H9C2細(xì)胞存活率〔(43.42±5.67)%〕顯著降低(P<0.001)，與高糖+mimics-NC組〔(46.39±5.11)%〕相比，高糖+miR-129-5p模擬物組中H9C2心肌細(xì)胞存活率〔(79.68±8.67)%〕顯著增加(P<0.001)。

2.4各組H9C2心肌細(xì)胞凋亡比較 與對(duì)照組〔(5.71±0.54)%〕相比，高糖組H9C2心肌細(xì)胞凋亡率〔(22.56±2.18)%〕顯著升高(P<0.001)；與高糖+mimics-NC組〔(19.32±1.86)%〕相比，高糖+miR-129-5p模擬物組中H9C2心肌細(xì)胞凋亡率〔(7.27±0.68)%〕顯著降低(P<0.001)，見(jiàn)圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高糖環(huán)境下H9C2心肌細(xì)胞的凋亡

2.5各組H9C2心肌細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，高糖組Ki67蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，而Bax和酶切-caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)；與高糖+mimics-NC組相比，高糖+miR-129-5p mimics組Ki67蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01)，而Bax和酶切-caspase-3蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01)。見(jiàn)表2，圖2。

1～4：對(duì)照組、高糖組、高糖+mimics-NC組、高糖+miR-129-5p mimics組圖2 各組細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

糖尿病性心肌病是糖尿病患者的重要心血管并發(fā)癥，可導(dǎo)致心力衰竭、心律不齊和猝死，是糖尿病患者死亡的主要原因〔8，9〕。然而糖尿病性心肌病的診斷和治療受到限制。miRNA在許多生物過(guò)程中都起重要作用，包括心血管疾病、糖尿病和相關(guān)并發(fā)癥〔10～12〕。有研究發(fā)現(xiàn)miR-6216在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，敲低miR-6216表達(dá)可減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷〔13〕；姜輝等〔14〕也在研究中發(fā)現(xiàn)敲低miR-633可通過(guò)調(diào)節(jié)AKT的活性顯著促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞增殖和遷移，從而促進(jìn)心肌梗死進(jìn)程。研究報(bào)道，miR-129-5p在多種疾病中均差異表達(dá)，參與調(diào)控多個(gè)疾病的發(fā)生和發(fā)展〔15，16〕，然而miR-129-5p在糖尿病性心肌病中的作用還不清楚。

本研究結(jié)果證明了miR-129-5p在高糖干預(yù)的H9C2心肌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)。過(guò)表達(dá)miR-129-5p可在體外減少高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激。同時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-129-5p可顯著削弱高糖對(duì)H9C2心肌細(xì)胞的存活率及Ki67蛋白表達(dá)水平的抑制作用，另外，流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-129-5p減輕了高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞的凋亡，并減少了高糖誘導(dǎo)的Bax和酶切-caspase-3蛋白表達(dá)水平。

綜上，在高糖環(huán)境下miR-129-5p的表達(dá)顯著下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-129-5p抑制高糖干預(yù)的H9C2心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及凋亡，并促進(jìn)了高糖抑制的細(xì)胞增殖。提示miR-129-5p具有預(yù)防糖尿病心肌病的潛力，并為后續(xù)相關(guān)研究進(jìn)一步提供了理論基礎(chǔ)。