LncRNA LINC01446靶向miR-432-5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及其分子機(jī)制

田貴金 劉軍紅 陳晶 張小龍 楊志森

(1邯鄲市第一醫(yī)院綜合外科，河北 邯鄲 056002；2武安市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科)

肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率高，手術(shù)和放化療是其主要治療手段，肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者治療效果、患者預(yù)后和生存期，深入研究肝癌的分子機(jī)制，尋找分子靶標(biāo)，對(duì)于肝癌的靶向治療具有重要的意義〔1,2〕。研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，部分LncRNA也參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可作為診斷的生物標(biāo)志物或治療的靶點(diǎn)〔3〕。LINC01446是一種新的LncRNA，研究發(fā)現(xiàn)敲低LINC01446可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞周期進(jìn)展并減少體外侵襲〔4〕。還有研究報(bào)道LINC01446與胃癌的總體存活率相關(guān)〔5〕。此外研究發(fā)現(xiàn)miRNA也參與腫瘤的發(fā)展發(fā)展，麥冬腺苷-B通過(guò)Linc00668/miR-432-5p抑制人肺腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化〔6〕。LncRNA癌癥易感性候基因(CASC)15通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-432-5p上調(diào)Toll-樣受體(TLR)4而促進(jìn)心臟肥大〔7〕。然而，LINC01446和miR-432-5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及LINC01446與miR-432-5p之間的關(guān)系尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究LINC01446和miR-432-5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及LINC01446是否通過(guò)調(diào)控miR-432-5p影響肝癌細(xì)胞的進(jìn)展，為肝癌的分子靶向治療提供參考和新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1肝癌組織和肝癌細(xì)胞來(lái)源 肝癌組織和癌旁組織均取自邯鄲市第一醫(yī)院，患者均知情。正常肝細(xì)胞THLE-2和肝癌細(xì)胞MHCC97L、Hep3B、Huh7、HCCLM3購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)。

1.1.2主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RIPA蛋白裂解液、四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室、基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司。si-con、si-LINC01446、pcDNA、pcDNA-LINC01446、miR-con、miR-432-5p、anti-miR-con、anti-miR-432-5p載體質(zhì)粒購(gòu)自北京源生思創(chuàng)生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 正常肝細(xì)胞THLE-2和肝癌細(xì)胞MHCC97L、Hep3B、Huh7、HCCLM3用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞Hep3B，將si-con、si-LINC01446、pcDNA、pcDNA-LINC01446、miR-con、miR-432-5p分別轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞中，分別記為si-con組、si-LINC01446組、pcDNA組、pcDNA-LINC01446組、miR-con組、miR-432-5p組；將si-LINC01446質(zhì)粒分別與anti-miR-con、anti-miR-432-5p共轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞中，分別記為si-LINC01446+anti-miR-con組、si-LINC01446+anti-miR-432-5p組；以正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照(NC)組。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)LINC01446和miR-432-5p表達(dá)水平 提取癌組織及各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。LINC01446上游引物序列：5′-ACTGCAGCATTCGAGAGGTT-3′，下游引物序列：5′-TCCACACATGGCATACACCT-3′；β-actin上游引物序列：5′-CCTGTGGCATC-CACGAAACT-3′，下游引物序列：5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′；miR-432-5p上游引物序列：5′-AACGAGACGACGACAGAC-3′，下游引物序列：5′-CTTGGAGTAGGTCATTGGGT-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3Western印跡檢測(cè)細(xì)胞核增殖抗原標(biāo)記物(Ki67)、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、β-連環(huán)蛋白(catenin)、c-myc蛋白和糖原合成酶激酶(GSK)-3β蛋白表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后室溫封閉2 h，再分別加入一抗4℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育90 min，分析蛋白條帶吸光度，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4MTT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)，按試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)490 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液重懸，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 侵襲實(shí)驗(yàn)：用基質(zhì)膠包被Transwell小室上室，然后取200 μl細(xì)胞懸液種于其中，培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定后用0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察并隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)：不用基質(zhì)膠包被Transwell上室，其余同侵襲實(shí)驗(yàn)步驟。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將LINC01446野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體分別與miR-con和miR-432-5p 共轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA LINC01446和miR-432-5p在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá) 與癌旁組織相比，肝癌組織中LINC01446表達(dá)水平顯著升高，miR-432-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1；與正常肝細(xì)胞THLE-2相比，肝癌細(xì)胞MHCC97L、Hep3B、Huh7、HCCLM3中LINC01446表達(dá)水平顯著升高，miR-432-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。可見(jiàn)，肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中LINC01446高表達(dá)，miR-432-5p低表達(dá)。

表1 LncRNA LINC01446和miR-432-5p在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

表2 LncRNA LINC01446和miR-432-5p在肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)

2.2沉默LINC01446抑制肝癌細(xì)胞Hep3B存活和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 與si-con組相比，si-LINC01446組LINC01446表達(dá)水平顯著降低，Ki67表達(dá)水平和細(xì)胞存活率顯著降低，Cleaved caspase-3表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表3、圖2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡率

表3 沉默LINC01446抑制肝癌細(xì)胞Hep3B存活、遷移、侵襲、凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)

圖2 Western印跡檢測(cè)Ki67和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

2.3沉默LINC01446抑制肝癌細(xì)胞Hep3B遷移和侵襲 與si-con組相比，si-LINC01446組MMP-2、MMP-9表達(dá)水平及Hep3B細(xì)胞給遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖3、圖4。

圖3 Transwell檢測(cè)肝癌細(xì)胞遷移(結(jié)晶紫染色，×200)

圖4 Western印跡檢測(cè)MMP-2和MMP-9表達(dá)

2.4LINC01446靶向調(diào)控miR-432-5p表達(dá) StarBase預(yù)測(cè)顯示LINC01446與miR-432-5p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖5)。miR-432-5p與WT-LINC01446共轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)(表4)。si-LINC01446組miR-432-5p表達(dá)水平顯著高于si-con組(4.19±0.35 vs 1.00±0.11,P<0.05)；pcDNA-LINC01446組miR-432-5p表達(dá)水平顯著低于pcDNA組(0.39±0.06 vs 0.96±0.09；P<0.05)。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖5 LINC01446與miR-432-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

2.5miR-432-5p抑制肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 與miR-con組相比，miR-432-5p組MMP-2、MMP-9表達(dá)水平和遷移、侵襲數(shù)量顯著降低，Ki67表達(dá)水平和細(xì)胞存活率顯著降低，Cleaved caspase-3表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖6、表5。

圖6 Western印跡檢測(cè)Ki67、Cleaved caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)

表5 miR-432-5p抑制肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

2.6干擾miR-432-5p部分逆轉(zhuǎn)沉默LINC01446抑制肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用 與si-LINC01446+anti-miR-con組相比，si-LINC01446+anti-miR-432-5p組miR-432-5p表達(dá)水平顯著降低，Ki67表達(dá)水平和細(xì)胞存活率顯著升高，MMP-2、MMP-9表達(dá)水平和遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著升高，Cleaved caspase-3表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖7，表6。

表6 干擾miR-432-5p部分逆轉(zhuǎn)沉默LINC01446抑制肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用

2.7LINC01446調(diào)控miR-432-5p表達(dá)影響肝癌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路 與si-con組相比，si-LINC01446組β-catenin、c-myc表達(dá)水平顯著降低，GSK-3β表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與si-LINC01446+anti-miR-con組相比，si-LINC01446+anti-miR-432-5p組β-catenin、c-myc表達(dá)水平顯著升高，GSK-3β表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖8，表7。可見(jiàn)，沉默LINC01446抑制Wnt信號(hào)通路的激活，而干擾miR-432-5p部分逆轉(zhuǎn)沉默LINC01446對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用。

1～4：si-con組，si-LINCO1446組，si-LINC01446+anti-miR-con組，si-LINCO1446+anti-miR-432-5p組；圖8同圖7 Western印跡檢測(cè)Ki67、Cleaved caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)

圖8 Western印跡檢測(cè)β-catenin、c-myc和GSK-3β蛋白表達(dá)

表7 干擾miR-432-5p和沉默LINC01446對(duì)肝癌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的影響

3 討 論

肝癌是預(yù)后較差的惡性腫瘤，靶向治療是中晚期治療的新方法，尋找更多肝癌相關(guān)的特異性靶點(diǎn)對(duì)臨床肝癌的靶向治療具有重要意義〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，與肝癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、凋亡有關(guān)〔9〕。如沉默LncRNA核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本(NEAT)1表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔10〕。有研究報(bào)道LncRNA LINC01446中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與放線菌的相對(duì)豐度相關(guān)，而放線菌與炎癥性腸病相關(guān)〔11〕。LncRNA LINC01446通過(guò)調(diào)節(jié)miR-489-3p促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展〔4〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中LINC01446高表達(dá)，沉默LINC01446后，細(xì)胞存活率和遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低，而細(xì)胞凋亡率顯著升高，且Ki67、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低，Cleaved caspase-3表達(dá)水平顯著升高。Ki67是DNA合成相關(guān)酶，其表達(dá)水平的高低可以用以判斷細(xì)胞增殖活性，研究發(fā)現(xiàn)Ki67在肝癌患者中高表達(dá)，影響患者預(yù)后〔12〕。MMP-2、MMP-9均屬于MMP家族，與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)，上調(diào)MMP-2/MMP-9，促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移〔13〕。Cleaved caspase-3是細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，激活caspase-3活化為Cleaved caspase-3可促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明沉默LINC01446可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)miRNA與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)控miRNA的表達(dá)可抑制腫瘤的進(jìn)展〔15〕。有研究報(bào)道過(guò)表達(dá)circ_001569通過(guò)調(diào)控miR-411-5p和miR-432-5p促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，遷移和侵襲〔16〕。hsa_circ_0008039通過(guò)調(diào)節(jié)miR-432-5p促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移〔17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-432-5p可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，LINC01446靶向調(diào)控miR-432-5p，干擾miR-432-5p部分逆轉(zhuǎn)了沉默LINC01446對(duì)Hep3B細(xì)胞的作用。提示，LINC01446可能通過(guò)調(diào)控miR-432-5p影響肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是Wnt的經(jīng)典信號(hào)通路，研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究肝癌中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用機(jī)制可為其作為靶點(diǎn)用于肝癌的臨床治療提供理論依據(jù)〔18〕。β-catenin的異常表達(dá)可以激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，c-myc是一種癌基因，也是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因，有研究表明SNHG16通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移〔19〕。GSK-3β是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，GSK-3β能磷酸化β-catenin使其降解，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活〔20〕。人參皂苷Rh2通過(guò)激活GSK-3β，降解β-catenin抑制肝癌的轉(zhuǎn)移〔21〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明沉默LINC01446抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。而干擾miR-432-5p部分逆轉(zhuǎn)沉默LINC01446對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用。提示，LINC01446可能通過(guò)調(diào)控miR-432-5p影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。

綜上所述，沉默LINC01446可通過(guò)調(diào)控miR-432-5p和Wnt信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。