miR-100-5p靶向mTOR信號通路調(diào)控人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞自噬

桂坤 黃昱 王美錦 歐陽偉煒

(1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 貴陽 550004；2貴州省腫瘤醫(yī)院胸部腫瘤科)

肺癌是全球性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年約有160萬人死于肺癌，占全球癌癥死亡人數(shù)的19%〔1〕。事實(shí)上，僅肺癌死亡人數(shù)就超過了緊隨其后的3種最常見癌癥：結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌的死亡人數(shù)的總和〔2〕。目前臨床上肺癌的治療主要是以手術(shù)治療為主，輔以放療、化療和藥物治療等綜合治療。然而，與絕大多數(shù)實(shí)體瘤一樣，肺腺癌存在多種原癌基因誘發(fā)、耐藥性高、惡性侵襲轉(zhuǎn)移等問題，使其針對性的治療和篩查十分困難。因此，確定非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的詳細(xì)分子機(jī)制及尋找新的生物標(biāo)志物，將有助于開發(fā)更好、更具體的臨床治療方法。表觀遺傳調(diào)控機(jī)制在誘發(fā)基因突變，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵性作用。miRNAs是一類短、非編碼RNA分子(約22個(gè)核苷酸長)，通過與靶向mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，阻礙靶基因的表達(dá)，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)揮關(guān)鍵作用〔3〕。miRNAs主要參與了細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等關(guān)鍵細(xì)胞功能，常被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)。細(xì)胞自噬是控制細(xì)胞存活和死亡的重要生理活動(dòng)〔4〕。mTOR是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有多種生理功能，如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、增殖、分化、運(yùn)動(dòng)和侵襲等。事實(shí)上，自噬在腫瘤的發(fā)生過程中起著雙刃劍的作用〔5〕。mTOR通常被認(rèn)為是一種促生長因子，是凋亡的抑制劑。細(xì)胞應(yīng)激后，mTOR下調(diào)抑制細(xì)胞生長和增殖，促進(jìn)自噬和凋亡。而細(xì)胞質(zhì)中p53可抑制mTOR信號傳導(dǎo)，抑制自噬。研究發(fā)現(xiàn)miR-100在多種腫瘤中通過靶向mTOR影響其發(fā)生發(fā)展，這對未來腫瘤的靶向性治療研究提供了很好的參考價(jià)值〔6〕。我們將miR-100-5p的模擬物(mimics)和抑制劑(inhibitor)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測轉(zhuǎn)染后miR-100-5p、自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2及mTOR的相對表達(dá)量，同時(shí)檢測細(xì)胞的凋亡率，采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測A549細(xì)胞中miR-100-5p與mTOR誘導(dǎo)的自噬之間的關(guān)系。本研究旨在探討miR-100-5p調(diào)控自噬相關(guān)的信號通路mTOR，參與腫瘤自噬過程，進(jìn)一步揭示miRNA涉及表觀遺傳在腫瘤細(xì)胞調(diào)控的詳細(xì)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；miR-100-5p mimics、miR-100-5p干擾序列inhibitor和對應(yīng)的陰性無關(guān)序列NC由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自Thermo Fisher公司。青霉素及鏈霉素購自美國Invitrogen公司。本研究所使用的抗體：GAPDH抗體mTOR蛋白抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自生工生物工程(上海)公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒、蛋白裂解液及Trizol試劑購自美國Thermo Scientific公司；所有引物由生工生物公司提供。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞凍存管購自美國Corning公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌A549細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，采用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期的A549，以4×105個(gè)細(xì)胞每孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜后觀察細(xì)胞融合情況，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 對于6孔板中培養(yǎng)的A549細(xì)胞，待其貼壁融合至70%～80%時(shí)，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后使用Lipofectamine2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為5組，設(shè)置如下(每組有3個(gè)平行樣)：對照組、mimics組、mimics NC組、inhibitor組和inhibitor NC組。參照Lipofectamine2000操作說明書，將miR-100-5p mimics，miR-100-5p mimics NC，miR-100-5p inhibitor和miR-100-5p inhibitor NC與Lipofectamine 2000按比例混合，室溫靜置20 min。每孔中加入200 μl，20 nmol/L的核酸，補(bǔ)Opti-MEM至1 ml，對照組加入等體積溶劑對照。轉(zhuǎn)染6 h后換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞用于后續(xù)鑒定實(shí)驗(yàn)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-100-5p與mTOR的相對表達(dá)檢測 使用Trizol 裂解液提取收集轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的總RNA，具體操作如下：細(xì)胞懸液先經(jīng)800 r/min離心5 min后，去除上清液，加入1 ml的裂解液，使用振蕩器振蕩混勻數(shù)下，將樣品放在室溫下5 min，隨后在4℃ 12 000 r/min離心5 min，留取上清，放入一個(gè)無核糖核酸酶(RNase)離心管中，加入200 μl氯仿，經(jīng)上下劇烈振蕩數(shù)秒，隨后在室溫下放置5 min，再4℃ 12 000 r/min離心10 min再將水相取出，加入與轉(zhuǎn)移液等體積的異丙醇混合放入-20℃中30 min，4℃ 12 000 r/min離心30 min，再加入100 μl的75%乙醇沉淀后，加入100 μl的無水乙醇清洗1遍后，加入15～30 μl RNase-Free ddH2O2，室溫溶解。使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA(約500 ng)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用PCR擴(kuò)增自噬基因Beclin1，LC3和內(nèi)參基因GADPH；miR-100-5p及內(nèi)參U6。Beclin1的引物正義鏈：5′-GGAGCTGCCGTTATACTGTTC-3′，反義鏈為5′-TCTCCACATCCATCCTGTAGG-3′；LC3的引物正義鏈：5′-GGTGATCATCGAGCGCTACA-3′,反義鏈：5′-CGCCGGATGATCTTGACCAA-3′；GADPH的引物為正義鏈為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，反義鏈：5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′；mTOR的引物正義鏈：5′-AGGCCTTGGTGAGAGCTGTA-3′，反義鏈：5′-GGCACACATTTGAAGAAGCA-3′；U6的引物正義鏈：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義鏈：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 分組方法同1.2.2，培養(yǎng)48 h后，棄掉細(xì)胞上清液，用PBS洗1遍，0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，PBS洗滌2遍調(diào)整細(xì)胞密度成1×106個(gè)/ml懸液，依次加入5 μl的Annexin V-FITC與3 μl的PI，室溫避光孵育10 min，使用BD流式細(xì)胞儀系統(tǒng)進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.5Western印跡 將各組細(xì)胞樣本PBS清洗，RIPA裂解液冰上裂解30 min，離心測上清中蛋白的濃度，加入適量的1×十二烷基硫酸鈉(SDS)結(jié)合緩沖液，煮沸5 min。采用不連續(xù)系統(tǒng)蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，待轉(zhuǎn)膜完成后，馬上將聚偏氟乙烯(PVDF)膜放入TBST溶液中漂洗1～2 min，隨后加入5%脫脂奶粉封閉液，于室溫下封閉1 h。孵育一抗：先按蛋白Marker將PVDF膜剪開轉(zhuǎn)膜后，參考一抗附說明書要求的比例稀釋一抗，4 ℃孵育過夜，接著加入TBST洗滌液清洗3次，每次持續(xù)15 min；孵育二抗：參考二抗使用說明書，按1∶2 000的比例稀釋辣根過氧化物酶(HPR)標(biāo)記的二抗，接著將PVDF膜加入已經(jīng)稀釋好的二抗，在室溫下孵育60 min；最后置于TBST洗滌3次，每次15 min；顯色后拍照。

1.2.6靶基因預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因測定 靶基因預(yù)測采用Targetscan軟件預(yù)測miR-100-5p下游靶基因，隨后采用雙熒光酶素報(bào)告基因檢測進(jìn)行鑒定。操作如下：轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種于24孔板，使用Lipo fectamine 2000混合miR-100-5p mimics和含有野生型與突變型mTOR 3′UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，將收集的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中，液氮反復(fù)凍融兩次，4℃，12 000 r/min離心5 min，收集上清，轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml EP中，獲得細(xì)胞提取液。將細(xì)胞提取液及熒光素酶反應(yīng)底物25℃水浴10 min。在新的離心管中分別加入100 μl熒光素酶反應(yīng)底物及20 μl細(xì)胞提取液，振蕩混合，15 s內(nèi)讀數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1A549細(xì)胞中miR-100-5p和mTOR的相對表達(dá)情況 A549細(xì)胞經(jīng)過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，對照組、mimics NC組、inhibitor NC組的miR-100-5p、自噬相關(guān)基因mTOR、Beclin1、LC3和Bcl-2表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與mimics NC組比，mimics組miR-100-5p、自噬相關(guān)基因表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，與inhibitor NC組比，inhibitor組miR-100-5p、自噬相關(guān)基因表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，與mimics組和mimics NC組比較， inhibitor組miR-100-5p、自噬相關(guān)基因表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，見表1。

表1 各組A549細(xì)胞中miR-100-5p和mTOR的相對表達(dá)情況

2.2miR-100-5p誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡 對照組、mimics NC組、mimics組、inhibitor NC組、inhibitor組A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞凋亡比例分別為(5.87±0.78)%，(5.46±0.99)%，(10.40±1.75)%，(5.47±0.68)%，(5.28±1.02)%，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.169，P<0.001)。mimics組A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞凋亡比例顯著高于其余組(均P<0.05)。

2.3轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)情況 對照組、mimics NC組、mimics組mTOR蛋白水平分別為0.42±0.13，0.13±0.04，0.92±0.24，mTOR蛋白水平比較：mimics組>對照組>mimics NC組(F=56.661，P=0.000)。見圖1。表明mTOR為miR-100-5p的直接靶基因，miR-100-5p對mTOR呈正向調(diào)控，具原癌基因作用，在肺癌細(xì)胞中促進(jìn)自噬，抑制凋亡密切相關(guān)。

圖1 轉(zhuǎn)染miRNA mimics的肺癌細(xì)胞自噬蛋白mTOR的表達(dá)

2.4mTOR是miR-100-5p的靶基因 mTOR是miR-100-5p的靶基因mTOR報(bào)告基因活性mimics組(1.03±0.11)、mimics+野生型組(0.49±0.06)和mimics+突變型組(1.07±0.12)，3組mTOR報(bào)告基因活性存在差異(F=26.417,P=0.000)。與mimics組比，mimics+野生型組mTOR報(bào)告基因活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.929,P=0.000)；與mimics組比，mimics+突變型組mTOR報(bào)告基因活性無明顯增高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.737,P=0.482)；與mimics+野生型組比較，mimics+突變型組mTOR報(bào)告基因活性明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.969,P=0.000)。表明miR-100-5p mimics能使細(xì)胞的野生型mTOR下調(diào)，而對突變型報(bào)告基因活性的影響無明顯差異，miR-100-5p均可以靶向抑制mTOR使其表達(dá)下調(diào)。

3 討 論

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥，其特點(diǎn)是對化療和放療均具有高耐藥性和復(fù)發(fā)率，死亡率極高，約占全球癌癥相關(guān)死亡總數(shù)的四分之一以上〔7〕。早期肺癌可進(jìn)行手術(shù)切除以獲得較高的治愈率，但晚期肺癌存在侵襲性轉(zhuǎn)移明顯降低了治療效果〔8〕。按照病理組織學(xué)分類可將肺癌分為兩個(gè)亞型，NSCLC(85%)和小細(xì)胞肺癌(SCLC，15%)，兩者治療方法和機(jī)制存在一定的差異。其中，在NSCLC中，多種基因的突變、缺失和重組會(huì)誘發(fā)信號通路和生理活動(dòng)的異?！?〕。此外，NSCLC進(jìn)一步分為3種主要的亞型，包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌。鱗狀細(xì)胞癌占20%～30%，通常發(fā)現(xiàn)于靠近氣管的肺部中心。腺癌占40%～70%，發(fā)生于肺部外側(cè)。大細(xì)胞癌占10%～15%，發(fā)生于肺組織內(nèi)部〔10〕。目前，NSCLC的免疫檢查點(diǎn)抑制劑的使用極大地促進(jìn)了臨床腫瘤免疫治療的快速發(fā)展。

miRNAs是一種非編碼、進(jìn)化保存的小分子RNA，能夠通過不同的機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)〔11〕。研究表明miRNAs在肺部疾病的發(fā)展中起著重要的作用〔12，13〕。據(jù)報(bào)道，肺癌患者腫瘤組織中Dicer酶的水平顯著降低，對其預(yù)后生存率有明顯影響，而Dicer是miRNAs成熟所必需的酶〔14〕。在SCLC中，miR-17～92過表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和血管的新生〔15〕。Liu等〔16〕也證實(shí)了miR-31在NSCLC中抑制腫瘤發(fā)展的抑制基因。此外，在非吸煙者和吸煙者肺癌患者中，miR-21均有較高的表達(dá)水平〔17〕。miR-100位于mir100HG簇，是一種長鏈非編碼RNA，也產(chǎn)生let-7和miR-125b。這3個(gè)成熟的miRNA都參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展〔18，19〕。在肺癌中，let-7的表達(dá)通常較低，這對接受手術(shù)治療的患者的生存有負(fù)面影響〔20〕。研究表明，miR-100-5p可能通過靶向mTOR誘導(dǎo)SW480細(xì)胞的自噬死亡〔21〕。Wang等〔22〕報(bào)道m(xù)iR-100-5p在缺氧誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓中可抑制mTOR信號通路。自噬失調(diào)在腫瘤的發(fā)病不同的病程中調(diào)控機(jī)制存在差異〔23〕。自噬在肺癌的發(fā)展中扮演極其重要的作用，在促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡中具有兩面性。一般來說，自噬的抑制限制了細(xì)胞克服壓力和維持穩(wěn)態(tài)的能力〔24〕。

研究表明miR-100在高轉(zhuǎn)移能力的A549中呈低表達(dá)，具有類似抑癌基因〔25〕。本研究結(jié)果提示miR-100-5p在自噬調(diào)控中作用十分重要。