葛根素對卡那霉素耳中毒小鼠耳蝸Calpain1活性的影響

盧偉 衛(wèi)玲燕 任延鑫 李鑫宇 寶東艷

(錦州醫(yī)科大學(xué) 1第一臨床學(xué)院骨科，遼寧 錦州 121001；2第一臨床學(xué)院2015級；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室)

聽力障礙是世界主要健康問題之一。全世界每500名新生兒中就有1例患有聽力障礙，65歲以上近1/3患有聽力障礙〔1，2〕。由于耳蝸神經(jīng)元和耳蝸毛細胞不能再生，耳毒性藥物、噪聲及年齡都可造成耳聾。鈣蛋白酶(Calpain)是一類廣泛分布于哺乳動物胞質(zhì)中的鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶。Calpain1和Calpain2是此家族中研究最廣泛的成員，都是由28和80 kD亞單位組成的異二聚體。近年來發(fā)現(xiàn)，在慶大霉素、丁胺卡那霉素及新霉素等氨基糖甙類誘導(dǎo)的內(nèi)耳細胞死亡中有鈣蛋白酶的參與〔3～5〕。前期研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能拮抗卡那霉素(KM)的耳毒性，本實驗通過制備KM耳中毒小鼠模型，結(jié)合聽腦干反應(yīng)觀察葛根素對KM耳中毒的拮抗作用，同時探討葛根素發(fā)揮作用是否與 Calpain1有關(guān)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 BALB/c雄性小鼠40只，體重25～30 g。由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SYXK( 遼) 2004-0029。

1.2主要試劑和儀器 葛根素注射液購自康普藥業(yè)股份有限公司，批號H20043980。硫酸KM(粉劑)生理鹽水溶解使用，購自美國 Ameresco公司，每日新鮮配制。兔抗Calpain1單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，β-actin 購自武漢博士德生物工程有限公司。Smart EP&OAE聽覺誘發(fā)電位記錄系統(tǒng)購自美國智聽公司。

1.3分組及小鼠耳毒模型制備 BALB/c小鼠隨機分成4組，每組10只。正常對照組：腹腔注射等量生理鹽水；KM組：KM皮下注射 750 mg/kg，2次/d；KM+葛根素組：皮下注射KM 750 mg/kg，2次/d，同時腹腔注射葛根素200 mg/kg，1次/d；葛根素組：腹腔注射葛根素200 mg/kg，1次/d，4組均連續(xù)注射14 d，14 d內(nèi)每天監(jiān)測體重，根據(jù)體重調(diào)整藥量。

1.4聽腦干反應(yīng)(ABR)測試 ABR測試需要在隔音屏蔽室內(nèi)進行，同時注意動物保溫。用藥前測ABR以進行正常BALB/c小鼠的篩選，每種藥物停藥后分別測ABR進行聽力損傷后聽閾的測定。測定ABR的方法：小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉100 mg/kg，在小鼠顱頂正中皮下插入電極的正極，給聲側(cè)耳郭下插入負極，在對側(cè)耳郭后下插入接地電極，用聽覺誘發(fā)電位記錄系統(tǒng)給予小鼠短純音刺激，依次選取8、12、24 kHz進行測試，記錄小鼠ABR閾值的變化，短純音刺激從80 dB開始，以5 dB逐次遞減，剛出現(xiàn)ABRⅠ波的值為聽閾標準，每只小鼠每側(cè)耳至少重復(fù)2次。

1.5Western印跡 實驗結(jié)束后，分別測試ABR，斷頭處死小鼠后，迅速取出聽泡，之后取出聽泡內(nèi)的小鼠耳蝸組織，迅速置于液氮中，放入-80℃冰箱中備用。按照Western印跡說明書操作，加入裂解液后勻漿，離心5 min后取上清，加入緩沖液后離心，變性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，加入二抗，發(fā)光顯影，計算Calpain1/β-actin作為蛋白相對表達量。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組ABR閾值比較 停藥后，KM組3種頻率的ABR閾值較給藥前明顯提高，提示小鼠的聽力下降，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；KM+葛根素組ABR閾值較正常對照組升高，但低于KM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。葛根素組停藥后較給藥前聽力無明顯變化(P>0.05)，見表1。

表1 各組腦干聽覺閾值

2.2Western印跡檢測Calpain1蛋白表達 KM 組(0.69±0.13)與正常對照組(0.48±0.12)比較，Calpain1表達水平明顯升高(P<0.05)。KM+葛根素組(0.58±0.14)明顯高于正常對照組，但明顯低于KM組(P<0.05)。正常對照組與葛根素組(0.50±0.12)差異不顯著(P>0.05)，見圖1。

圖1 各組Calpain1蛋白表達

3 討 論

雖然KM等氨基甙類抗生素在臨床上廣泛應(yīng)用于治療危及生命的細菌性感染，但KM有顯著的劑量依賴性耳毒性〔6〕。目前認為，氨基甙類藥物的主要耳毒性靶點是毛細胞，毛細胞死亡后，螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在數(shù)周或數(shù)月開始退化。隨著氨基甙類用藥劑量或用藥時間的延長，首先損傷毛細胞高頻基底部，低頻的尖端隨后損傷〔7〕。氨基甙類誘導(dǎo)的毛細胞變性被認為是與活性氧(ROS)介導(dǎo)的凋亡有關(guān)〔8，9〕。

雖然Calpain在許多細胞功能中起重要作用，但其過度激活已被證明與許多疾病有關(guān)。在已鑒定的15種Calpain亞型中，Calpain1和Calpain2(又名m-calpain)廣泛分布于包括耳蝸在內(nèi)的大多數(shù)組織和器官中〔10〕。Calpain是鈣敏感的中性半胱氨酸蛋白酶，參與凋亡和壞死途徑的調(diào)節(jié)〔11，12〕。Calpain1與內(nèi)耳細胞凋亡的相關(guān)性表明，Calpain1很可能是KM誘導(dǎo)內(nèi)耳細胞凋亡的介質(zhì)〔13〕。本研究結(jié)果提示Calpain1介導(dǎo)了KM的耳毒性，與Li等〔13〕結(jié)果一致。

葛根原產(chǎn)于東南亞，幾千年來一直被用作食物、藥物和飼料，是中國古代最早使用的草藥之一〔14〕。葛根素是從葛根中分離出來的3種主要的異黃酮化合物之一〔15〕，已被廣泛用于治療心血管疾病、腦血管疾病、癌癥、帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)、糖尿病及糖尿病并發(fā)癥。對發(fā)熱、炎癥、高脂血癥、骨壞死、酒精引起的疾病和氧化損傷也有保護作用。葛根素具有抑制鈣內(nèi)流、改善微循環(huán)、降低胰島素抵抗、清除氧自由基、抗細胞死亡、抑制酒精攝入等多種藥理作用。

臨床報道葛根素能改善內(nèi)耳的血液循環(huán)，擴張血管，治療突發(fā)性耳聾和神經(jīng)性耳鳴有明顯療效〔16〕。不同濃度組葛根素均能拮抗慶大霉素對離體小鼠耳蝸的損傷〔17〕。同時，葛根素可有效抑制順鉑所致小鼠耳蝸Calpain2的高表達，以減輕順鉑的耳毒性，改善小鼠聽功能。前期研究表明〔18，19〕，葛根素能通過拮抗核因子(NF)-κB p50和NF-κB p65的活化易位，改善KM所致的小鼠耳毒性。本研究結(jié)果表明，同時應(yīng)用KM和葛根素小鼠耳蝸表達Calpain1明顯減少，同時聽力損傷也有所改善，提示葛根素對KM損傷小鼠耳蝸的保護作用可能與下調(diào)Calpain1有關(guān)，葛根素單獨應(yīng)用對小鼠聽力無損害，因此，葛根素具有廣闊的應(yīng)用前景。