河南漯河地區(qū)1 450例遺傳咨詢者的外周血染色體核型分析*

辛淑文，楊少哲，胥 博，滕少俠，李榮香，付秀虹

(漯河市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心/河南省生育力保護(hù)和優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/漯河市婦產(chǎn)生殖遺傳醫(yī)院/漯河市產(chǎn)前診斷中心/漯河市出生缺陷防治中心，河南 漯河 462000)

由染色體數(shù)目和(或)結(jié)構(gòu)異常引起的疾病統(tǒng)稱為染色體病。有研究表明，染色體異常在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、原發(fā)不孕不育、胎停育、生育畸形或智力障礙胎兒等病因中占3%～5%[1-3]，并且這些異常情況是育齡期夫婦常見的病理現(xiàn)象，可造成育齡期男女的生育障礙。對這類遺傳咨詢患者進(jìn)行外周血染色體核型分析已成為一種重要的遺傳學(xué)檢查方法，以達(dá)到對染色體病的診斷及預(yù)防的目的。本研究回顧性分析了在漯河市中心醫(yī)院進(jìn)行遺傳咨詢的1 450例患者的外周血染色體核型檢查結(jié)果，旨在分析和評估漯河地區(qū)染色體病的分布情況，為臨床診斷、遺傳咨詢和生育指導(dǎo)提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2017年1月至2020年3月在漯河市中心醫(yī)院進(jìn)行遺傳咨詢的患者1 450例，其中男687例，年齡8～56歲，平均(31.53±7.43)歲；女763例，年齡9～54歲，平均(30.28±6.96)歲。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn) (1)患有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、閉經(jīng)或不孕、不育癥、少弱精子癥、無精癥、胎停育、發(fā)育遲緩、智力障礙等；(2)無有害物質(zhì)接觸史；(3)簽署本研究知情同意書。

1.2方法

1.2.1外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 采集患者3～5 mL靜脈血于肝素鈉抗凝管中，顛倒混勻數(shù)次。采用5 mL注射器吸取靜脈血，在無菌條件下添加35滴(女性)和30滴(男性)接種于5 mL培養(yǎng)基(達(dá)暉生物)中，37 ℃培養(yǎng)72 h。

1.2.2外周血染色體核型制備 培養(yǎng)72 h后加入100 ng/μL秋水仙素10 μL，處理30 min。2 000 r/min離心10 min，棄上清液。加入0.075 mol/L氯化鉀8 mL進(jìn)行低滲，吹吸混勻，37 ℃水浴35 min。添加新鮮配置的卡諾固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)2 mL混勻進(jìn)行預(yù)固定，37 ℃水浴5 min。2 000 r/min離心10 min，棄上清液。加入固定液8 mL進(jìn)行固定，吹吸混勻，離心，棄上清液。再次固定，加入適量固定液調(diào)成細(xì)胞懸液進(jìn)行滴片。在75 ℃干燥箱中烤片3～5 h。

1.2.3Giemsa顯帶 玻片置入0.05%胰酶消化30～40 s，用0.9%氯化鈉溶液沖洗后置于染液中2 min，然后顯微鏡下觀察。選取染色體核型完整、條帶較長、分散良好的核型圖作為觀察對象。油鏡下觀察帶紋清晰、透亮則消化時(shí)間合適。顯微鏡下觀察染色體染至紫紅色。必要時(shí)采用C帶或N帶顯帶技術(shù)。采用德國蔡司全自動核型分析掃描系統(tǒng)對掃描記錄的細(xì)胞分裂中期相進(jìn)行計(jì)數(shù)和核型分析。在400條帶水平進(jìn)行分析，每例外周血樣本計(jì)數(shù)20個(gè)以上分裂相，分析染色體核型不少于5個(gè)，對異常核型增加計(jì)數(shù)和分析個(gè)數(shù)。核型描述按ISCN2016標(biāo)準(zhǔn)操作。

1.2.4核型核對驗(yàn)證 從染色體異常結(jié)果中隨機(jī)挑選出10例樣本，送往鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行核型核對驗(yàn)證。

1.3數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用Excel2007軟件錄入數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用描述性統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.11 450例受檢者的樣本染色體檢出結(jié)果 1 450例患者中，染色體異常94例(6.48%)。染色體多態(tài)性58例(4.00%),染色體數(shù)目異常12例(0.83%),染色體結(jié)構(gòu)異常23例(1.59%),性別反轉(zhuǎn)1例(0.07%)，見表1。

表1 1 450例樣本染色體檢出結(jié)果

2.2染色體多態(tài)性樣本的分布情況 在58例染色體多態(tài)性樣本中，9號染色體臂間倒位18例，占31.03%；Y染色體臂間倒位2例，占3.45%；長臂異染色質(zhì)區(qū)增加(次縊痕變異)21例，占36.21%；短臂隨體增加(隨體變異)10例，占17.24%；短臂隨體柄增加(隨體柄變異)4例，占6.90%；著絲粒異染色質(zhì)區(qū)增加(著絲粒變異)3例，占5.17%，見表2。

表2 58例染色體多態(tài)性樣本的分布情況

2.3染色體數(shù)目/結(jié)構(gòu)異常的分布情況 1 450例患者中，染色體數(shù)目異常12例，其中性染色體數(shù)目異常、克氏綜合征6例，克氏綜合征嵌合體1例，XYY綜合征1例，XXX綜合征1例，特納綜合征1例，常染色體數(shù)目異常2例，見表3。染色體結(jié)構(gòu)異常23例，其中相互易位9例，羅氏易位6例，倒位4例，染色體增加缺失/缺失4例，見表4。

表3 12例染色體數(shù)目異常的分布情況

表4 23例染色體結(jié)構(gòu)異常的分布情況

2.4驗(yàn)證情況 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心核型核對，驗(yàn)證結(jié)果和本院檢測結(jié)果完全一致。

3 討 論

染色體病是由染色體數(shù)目異常和(或)結(jié)構(gòu)異常所導(dǎo)致的疾病。染色體病是育齡期夫婦自然流產(chǎn)、不孕不育，以及新生兒智力障礙、發(fā)育畸形等的重要原因之一。染色體核型分析技術(shù)被認(rèn)為是染色體病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其不僅能檢測5～10 Mb以上的染色體不平衡性異常，還能檢測染色體平衡性異常，如易位、倒位等。夫婦雙方外周血染色體核型分析現(xiàn)已成為輔助生殖技術(shù)前期準(zhǔn)備的一項(xiàng)必備檢查，以降低缺陷兒的出生。

本研究對1 450例在本院進(jìn)行遺傳咨詢者的染色體核型進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，染色體異常檢出率為6.34%，高于一般人群的5%[4]。該檢出率低于九江地區(qū)的11.9%[5]和南京地區(qū)的15.76%[6]，可能與納入的樣本量與地域差異有關(guān)。但高于廈門地區(qū)的4.68%[7]和南通地區(qū)的2.59%[8]?？赡芘c未將染色體多態(tài)性納入染色體異常有關(guān)。與南京地區(qū)的6.37%[9]和云南德宏地區(qū)的6.85%[10]接近。表明遺傳咨詢者具有較高的染色體異常檢出率。

本研究中染色體異常以染色體多態(tài)性為主，共58例(4.00%)，其次為染色體結(jié)構(gòu)異常(23例)、染色體數(shù)目異常(12例，包含克氏綜合征嵌合體1例)及性別反轉(zhuǎn)1例。染色體多態(tài)性主要存在于1、9、16號染色體的異染色質(zhì)區(qū)，D、G組染色體隨體或隨體柄，9號染色體臂間倒位和Y染色體異染色質(zhì)區(qū)增加/減少/倒位中。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，染色體多態(tài)性因?qū)儆谌祟惾旧w正常變異，一般不具有臨床意義。有學(xué)者認(rèn)為，在行輔助生殖技術(shù)助孕的人群中，染色體多態(tài)性患者的妊娠結(jié)局與健康人群無異[11-12]。Yqh-可能伴隨著AZF基因缺失而導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，從而影響男性生育能力[13]。有研究曾發(fā)現(xiàn)，Y倒位大多數(shù)為家族遺傳，且不會伴其他異常[14]。但也有研究表明，男性染色體多態(tài)性與男性無精、少精等生育異常密切相關(guān)[15]。而女性染色體多態(tài)性可能導(dǎo)致流產(chǎn)次數(shù)增多[16]，尤其是1、9、16號染色體qh+可能導(dǎo)致體外受精聯(lián)合胚胎移植技術(shù)助孕患者異常受精比例增加和種植率降低，故染色體多態(tài)性是否具有臨床意義仍有待于進(jìn)一步研究。

本研究中染色體數(shù)目異常共12例，其中性染色體異常10例，常染色體2例。10例性染色體數(shù)目異常，包括7例克氏綜合征(含1例克氏綜合征嵌合體)、1例特納綜合征、1例XXX綜合征和1例XYY綜合征。在不育男性中的患病率為3%～4%，而在無精子癥患者中則高達(dá)10%～12%[17]。有些患者可通過睪丸取精術(shù)幫助克氏綜合征患者獲取精子，采用同周期顯微手術(shù)聯(lián)合輔助生殖技術(shù)更易獲得遺傳學(xué)子代[18]。特納綜合征的外生殖器表型為女性，有研究表明，在國外活產(chǎn)女嬰中的發(fā)病率約為1/2 500，活產(chǎn)嬰兒的發(fā)病率約為1/4 000[19]。特納綜合征的特征性臨床表現(xiàn)主要與矮小同源盒基因有關(guān)[20]。受倫理限制，國內(nèi)目前尚無合法供卵系統(tǒng)，故不能自然受孕的特納綜合征患者幾乎無生育可能。

本研究中染色體結(jié)構(gòu)異常共23例，占樣本總例數(shù)的1.59%。其中相互易位9例，羅氏易位6例，倒位4例，染色體增加/缺失4例。朱蕊等[21]提出，不良孕產(chǎn)史夫婦其中一方出現(xiàn)染色體核型異常的概率為3%～10%，而且大多數(shù)為染色體平衡易位。平衡易位屬于染色體平衡性結(jié)構(gòu)異常，此外，還有倒位、羅氏易位等。染色體不平衡性結(jié)構(gòu)異常包括染色體增加和缺失。染色體平衡易位主要是遺傳物質(zhì)無增加，也無減少，攜帶者的臨床表型和健康者無異。但這類攜帶者在生育期生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中，易位染色體將形成易位型的四射體，可形成18種配子，其中1/18可生育正常兒，1/18可生育表型正常的攜帶者，其余16/18因部分三體或單體而導(dǎo)致流產(chǎn)或死胎。染色體倒位由于染色體基因順序的重新組合，遺傳物質(zhì)沒有丟失，故表型正常。但在減數(shù)分裂過程中同源染色體之間進(jìn)行交換可形成4種配子，1種正常，1種為倒位攜帶者，另外2種為部分重復(fù)和丟失的重組型，將導(dǎo)致死胎、流產(chǎn)或畸形兒的出生。對于染色體結(jié)構(gòu)異常患者發(fā)生反復(fù)流產(chǎn)和希望生育染色體核型正常后代，尤其需要能區(qū)分易位攜帶狀態(tài)和正常胚胎的植入前遺傳學(xué)檢測技術(shù)[22]。

本研究結(jié)果顯示，染色體異?？蓪?dǎo)致不良孕產(chǎn)史、原發(fā)不孕、少弱精子癥、無精癥、發(fā)育遲緩、智力低下等異常現(xiàn)象，也證實(shí)了細(xì)胞染色體檢查的重要性。目前，染色體疾病大多數(shù)還不能被治愈，主要通過對育齡期婦女孕前期、孕中期和新生兒期進(jìn)行篩查，以期盡早發(fā)現(xiàn)染色體疾病，并進(jìn)行早期診斷和針對性治療。本研究結(jié)果可為產(chǎn)前診斷遺傳咨詢及生殖工作提供參考。將傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳染色體核型分析技術(shù)與染色體微陣列分析技術(shù)、高通量測序技術(shù)等多種分子遺傳學(xué)技術(shù)相結(jié)合，從而提高對因染色體疾病導(dǎo)致不孕不育的確診率。