血清miR-92a、miR-196a表達(dá)與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

孫 倩 王 宇 邱衛(wèi)強(qiáng)

宮頸癌的治療主要為以手術(shù)及放化療為主的綜合治療，可有效延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，但受多種因素影響，部分患者預(yù)后并不理想[1]。據(jù)報(bào)道，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與宮頸癌患者預(yù)后密切相關(guān)，且合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后相對(duì)較差[2]。因此，明確宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況尤為必要。目前已證實(shí)，微小核糖核酸(MicroRNA，miRNA)在細(xì)胞的多種生理過(guò)程中發(fā)揮作用，若miRNA異常表達(dá)可導(dǎo)致疾病發(fā)生，包括惡性腫瘤[3]。其中miR-196a被證實(shí)可促進(jìn)胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤發(fā)生[4]。miR-92a也可通過(guò)多種信號(hào)在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[5]。結(jié)合上述機(jī)制，血清miR-92a、miR-196a的異常表達(dá)可能與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也有一定關(guān)系，但目前相關(guān)報(bào)道較少?；诖?，本研究將重點(diǎn)觀察血清miR-92a、miR-196a表達(dá)與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 納入對(duì)象

回顧性分析2018年6月至2019年12月醫(yī)院收治的44例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者資料，納入淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，另采集同期收治的44例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者資料，納入無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為宮頸癌；②首次就診；③均為原發(fā)腫瘤；④預(yù)計(jì)生存時(shí)間>3個(gè)月；⑤實(shí)驗(yàn)室檢查資料、病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并其他婦科疾病；③術(shù)前接受放、化療等抗腫瘤治療；④術(shù)前伴有急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病。

1.2 方法

1.2.1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移評(píng)估方法 查閱所有患者入院時(shí)MRI、CT等影像學(xué)檢查資料，參照標(biāo)準(zhǔn)[6]，統(tǒng)計(jì)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

1.2.2 miRNA檢測(cè)方法 全部患者在入院時(shí)均接受血清相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果資料保存完整。入院時(shí)，采集患者清晨空腹靜脈血3 ml，3000 r/min離心10 min，離心半徑為10 cm，收集上層血清，加入1 ml提取劑Trizol，放置于-70 ℃冰箱中保存，按照總RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書，提取總RNA，采用美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以U6為內(nèi)參，miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系15 μl∶5 μlRNA模板，3 μl U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15 μl 100 mmol/l脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，1μl 50U/μl逆轉(zhuǎn)錄酶，10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液1.5 μl，0.19 μl 20 U/μl RNase抑制劑，4.16 μl雙蒸水。反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μl∶1 μl引物及探針Mix(20×)，10μlTaqMam 通用混合物溶液(2×)，1.33 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，7.67 μl雙蒸水。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性60 s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每個(gè)反應(yīng)體系熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷循環(huán)數(shù)即為Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-92a及miR-196a水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.2.3 基線資料統(tǒng)計(jì) 設(shè)計(jì)基線資料填寫表詳細(xì)記錄患者的一般資料，包括年齡、腫瘤直徑、病理類型[7][鱗癌、腺癌、其他(包括腺樣囊狀性癌、腺樣基底細(xì)胞癌、腺鱗癌、未分化癌等)]、分化程度(高分化、中分化、低分化)，血清腫瘤標(biāo)志物[糖類抗原199(Carbohydrate antigen199，CA199)、糖類抗原125(Carbohydrate antigen125，CA125)，入院時(shí)取靜脈血3 ml，3000 r/min離心10 min，采用放射免疫法測(cè)定]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者資料比較

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者的血清CA199、CA125、miR-92a、miR-196a均高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；組間其他基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者的基線資料比較

2.2 各主要指標(biāo)與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系的回歸分析

將2.1中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入作為自變量，將宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況作為因變量(1=轉(zhuǎn)移，0=未轉(zhuǎn)移)，經(jīng)Logistic回歸結(jié)果顯示，血清CA199、CA125、miR-92a、miR-196a的異常表達(dá)可能與宮頸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，血清CA199、CA125、miR-92a、miR-196a過(guò)表達(dá)可能是宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)因子(OR>1，P<0.05)，其中miR-92a、miR-196a的過(guò)表達(dá)檢驗(yàn)所得的OR值較高，可作為獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子，見(jiàn)表2。

表2 各主要指標(biāo)與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系的回歸分析結(jié)果

2.3 血清miR-92a、miR-196a預(yù)測(cè)宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值分析

將宮頸癌患者的血清miR-92a、miR-196a作為檢驗(yàn)變量，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況作為狀態(tài)變量(1=轉(zhuǎn)移，0=未轉(zhuǎn)移)，繪制ROC曲線(圖1)結(jié)果顯示，血清miR-92a、miR-196a單一及聯(lián)合預(yù)測(cè)宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的AUC均>0.80，預(yù)測(cè)價(jià)值均較理想，且以聯(lián)合檢測(cè)價(jià)值最佳。各指標(biāo)對(duì)應(yīng)特異度、靈敏度、cut-off值及約登指數(shù)見(jiàn)表3。

圖1 血清miR-92a、miR-196a預(yù)測(cè)宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值的ROC曲線圖

表3 血清miR-92a、miR-196a預(yù)測(cè)宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值分析結(jié)果

3 討論

據(jù)報(bào)道，部分宮頸癌患者在就診時(shí)便伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且隨著疾病的進(jìn)展，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率逐漸升高[8]。因淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與宮頸癌患者預(yù)后密切相關(guān)，若在早期明確淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生情況，可能對(duì)疾病治療干預(yù)措施的制定有重要意義。

CA125、CA199是重要的血清腫瘤標(biāo)志物，被證實(shí)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中CA125為廣譜腫瘤標(biāo)志物，是1種糖蛋白，主要從上皮性卵巢癌抗原中檢出，宮頸癌患者的血清CA125水平均有不同程度升高[9]。而CA199屬于黏液糖蛋白抗原，分布于胰腺、膽管上皮等，是存在血液循環(huán)的腫瘤相關(guān)抗原[10]。有相關(guān)研究采用CA125、CA199聯(lián)合診斷宮頸癌取得滿意效果[11]。由此猜測(cè)，血清CA125、CA199可能與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究在比較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的血清CA125、CA199后，經(jīng)Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清CA199、CA125異常表達(dá)與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)有一定關(guān)系，二者過(guò)表達(dá)可能是宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)因子。證實(shí)上述猜測(cè)，但因CA199、CA125不僅在諸多惡性腫瘤疾病患者血清中呈過(guò)表達(dá)，且在受炎癥、免疫等其他因素影響后，也有一定程度升高，特異性及穩(wěn)定性不佳；且在本研究中二者經(jīng)回歸分析所得的OR風(fēng)險(xiǎn)值也偏低，難以在評(píng)估宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，因此本研究未將其作為主要的指標(biāo)觀察分析。

相關(guān)研究指出，miRNA具有腫瘤標(biāo)靶的作用，可能同時(shí)兼具促癌基因和抑癌基因的作用[12]。而一個(gè)miRNA分子可靶向多個(gè)基因表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)活性，miR-92a為生物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，主要發(fā)揮癌基因作用，可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[13]。miR-196a作為miRNA家族中一員，已有不少研究證實(shí)，miR-196a在腫瘤組織中呈過(guò)表達(dá)，具有致瘤作用，可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性，并與腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)[14]。由此，推測(cè)血清miR-92a、miR-196a也可能與宮頸癌患者淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者的血清miR-92a、miR-196a均高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，初步推測(cè)血清miR-92a、miR-196a可能與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且該推測(cè)在進(jìn)一步的回歸分析檢驗(yàn)中被證實(shí)，簡(jiǎn)單分析原因：miR-92a過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致某些靶向癌基因過(guò)度激活，通過(guò)抑制P21的表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展來(lái)促進(jìn)宮頸癌腫瘤細(xì)胞的增殖，繼而引起淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生[15]。而miR-196a可能通過(guò)參與并促進(jìn)宮頸上皮癌變過(guò)程，具有促癌基因功能，同時(shí)通過(guò)調(diào)控多種基因促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，如miR-196a過(guò)表達(dá)可下調(diào)Radixin基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞侵襲，同時(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)PaP1A基因表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的侵襲，進(jìn)而誘發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[16]。

在證實(shí)miR-196a、miR-92a與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系后，進(jìn)一步繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，血清miR-92a、miR-196a單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的AUC均>0.80，預(yù)測(cè)價(jià)值均較理想，且以聯(lián)合檢測(cè)價(jià)值最佳。上述結(jié)果不僅證實(shí)血清miR-92a、miR-196a與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且說(shuō)明了血清miR-92a、miR-196a對(duì)未來(lái)宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估及預(yù)測(cè)有較高的應(yīng)用價(jià)值，即宮頸癌患者若入院時(shí)血清miR-92a、miR-196a呈過(guò)表達(dá)，其可能有較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，臨床應(yīng)盡早行影像學(xué)或病理檢查，明確淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，可能對(duì)指導(dǎo)早期治療有積極意義；同時(shí)可在未來(lái)治療中將miR-92a、miR-196a作為靶基因，以為患者選擇合適的藥物治療，或可對(duì)延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間、改善生存質(zhì)量有積極意義。

綜上所述，宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能與血清miR-92a、miR-196a異常表達(dá)有關(guān)，若在入院時(shí)檢測(cè)患者血清miR-92a、miR-196a呈過(guò)表達(dá)，可能提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高風(fēng)險(xiǎn)。