lncRNA-HCG11通過調控miR-144-3p/PRP11分子軸參與結直腸癌細胞增殖及轉移的分子機制研究

于德水 張曉艷

結直腸癌(CRC)發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位列第三[1]。超過50%的結直腸癌患者最終會發(fā)展成遠端轉移。腫瘤細胞的侵襲和轉移是導致結直腸癌患者治療失敗以及死亡的主要原因[2]。大量研究表明，lncRNAs參與調節(jié)腫瘤的增殖、侵襲與轉移等生物學行為[3]。lnc-RNA 可作為內源競爭性 RNA(ceRNAs)或發(fā)揮miRNA海綿作用，在轉錄后水平調節(jié)miRNA下游靶蛋白的表達，進而促進或抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移。其中，lncRNA-HCG11在肝癌和乳腺癌細胞中表達上調，與腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移相關[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-144-3p在膠質母細胞瘤、骨髓瘤、肺腺癌、食管癌、前列腺癌等中發(fā)揮抑癌基因的作用，抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移[5]。富含脯氨酸蛋白(proline-rich protein 11，PRR11)是近年發(fā)現(xiàn)的一個與腫瘤發(fā)生發(fā)展均密切相關的新基因，在非小細胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌以及卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中高表達，促進腫瘤的增殖、侵襲、遷移以及上皮-間質轉化等惡性生物學行為[6]。并且，在胰腺癌中，miR-144-3p靶向下調PRR11表達，抑制胰腺癌細胞PANC-1的增殖。本研究旨在探討lncRNA-HCG11通過調控miR-144-3p/PRP11分子軸參與結直腸癌細胞增殖及轉移的分子機制，尋找結直腸癌中調控癌細胞增殖遷移的新靶點和標志分子，為診斷和預后提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與耗材

人結直腸癌細胞株(HCT116、SW480、Lovo)和人正常結直腸上皮細胞NCM460均購于中國科學院上海生命科學研究所細胞庫。PMI-DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(鏈霉素，青霉素)及胰酶均購自Gibco公司；Transwell小室購自Corning公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、LipofectamineTM2000轉染試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒均購自Invitrogen 公司；雙熒光素報告基因試劑盒購自Omega 公司；miR-144-3p mimic/inhibitor/scramble及實驗用到的siRNAs和引物序列由TransGen生物科技公司合成；SYBR Green q-PCR Master Mix試劑盒購自Sigma公司；HCG11、PRP11的過表達質粒購自上海吉凱生物公司；質粒提取試劑盒、RIPA裂解液、CCK-8試劑盒、ECL 發(fā)光試劑盒均購自碧云天生物科技公司；Western blot一抗(antibody-GADPH，antibody-PRP11)和二抗(羊抗兔)購自CST公司；自動酶標儀購自BIO-BRAD公司；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組

人結直腸癌細胞株(HT29、LOVO、Lovo)用10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞分為si-HCG11組；pcDNA-HCG11組；miR-144-3p mimic組；pcDNA-PRP11組；pcDNA-lnc-HCG11+miR-148a-3p mimic組；miR-148a-3p mimic+pcDNA-PRP11組；si-lnc-HCG11+pcDNA-PRP11組。每組轉染實驗組設置NC對照。

1.3 細胞轉染

選取對數(shù)生長期的結直腸癌細胞，胰酶消化，用DMEM培養(yǎng)基調整密度至1×105個/ml。接種到6孔板，每孔加2 ml細胞懸液，培養(yǎng)24 h，按照1.2中的分組設置，采用LipofectamineTM2000轉染試劑盒轉染，48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉染效果。

1.4 qPCR檢測結直腸癌細胞中HCG11和miR-144-3p的表達

Trizol 試劑提取人結直腸癌細胞株的總RNA，DNA酶處理后用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。取2 μl cDNA產物放入EP 管，采用SYBR Green Master Mix反應體系進行擴增。擴增體系總體積為 20 μl，反應條件為：95 °C 預變性 30 s，95 °C 變性 5 s、60 °C 退火、72 ℃ 延伸30 s，共循環(huán) 40 次。采用U6作內參，檢測各組細胞HCG11和miR-144-3p相對表達。測定模板的Ct值，循環(huán)數(shù)法(2-ΔΔCt)定量相對表達量。見表1。

表1 PCR引物序列

1.5 CCK-8法檢測細胞的增殖活力

胰酶消化對數(shù)生長期的各組細胞，96孔板接種細胞，接種量1×104個/孔，每組 設置3個復孔，每孔加100 μl培養(yǎng)基，分別在24 h、48 h、72 h、96 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。檢測前每孔加入20 μl CCK-8試劑，孵育1 h，用酶標儀測定450 nm波長處的吸光值(D450)，繪制細胞增殖曲線圖。相同條件下實驗重復3次。

1.6 Western blotting檢測細胞相關蛋白表達

收集細胞，用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細胞，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。50 μg/孔上樣，10% SDS-PAGE凝膠分離1 h，轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBS緩沖液封閉1 h，加入一抗，4 ℃過夜，PBST緩沖液漂洗3次，5 min/次，加入二抗，37 ℃ 孵育4 h。PBST緩沖液漂洗3次，加入ECL顯影，再洗膜3次。使用 ECL 蛋白質印跡試劑盒顯色。GAPDH用作內參，蛋白凝膠成像系統(tǒng)分析樣品中目標蛋白的相對含量。實驗重復3次，取平均值。

1.7 Transwell實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力

侵襲實驗中將 Matrigel 加入 Transwell 小室上室的聚碳酸酯濾膜上，37 ℃孵育15 min，使Matrigel膠凝固；遷移實驗則無需 Matrigel 基質膠。將細胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞密度為1×105個/ml。在Transwell小室24孔板中，每孔上室加入200 μl細胞懸液，下室加入600 μl完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h，用棉簽拭去小室上方未穿膜的細胞，PBS上下沖洗2遍，膜下細胞用5%的多聚甲醛固定，0.5% 結晶紫溶液染色 10 min，顯微鏡下隨機選取10個視野檢查(200×)，對細胞進行記數(shù)。相同實驗條件下重復3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測lncRNA-HCG11與miR-144-3p、miR-144-3p與PRP11的相互作用

將lnc-HCG11與miR-144-3p、miR-144-3p與PRP11結合部位的序列及其突變體序列插入Firefly熒光素酶報告基因下游，構建表達載體。將miR-144-3p mimics與pGL4-HCG11-WT/MUT或pGL4-PRP11-WT/MUT共轉染到HEK293T細胞。對照組用miR-144-3p scramble與pGL4-HCG11-WT/MUT或pGL4-PRP11-WT/MUT共轉染。轉染實驗完成后，細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。裂解細胞，測熒光強度。Renilla熒光值作為內參。RUL值=Firefly luciferase RLU值/Renilla luciferase RUL值。

1.9 統(tǒng)計學處理

實驗結果用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0分析，多組比較和兩組間比較分別采用單因素方差分析和t檢驗，用GraphPad Prism 7對實驗數(shù)據進行圖片繪制。P<0.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌和正常結直腸上皮細胞中l(wèi)ncRNA-HCG11的表達水平

qRT-PCR的檢測結果表明，與正常結直腸上皮細胞NCM460相比，lncRNA-HCG11在3種結直腸癌細胞株(HCT116、SW480、Lovo)中的表達水平顯著上調(P<0.01或P<0.001，圖1)。3種結直腸癌細胞中，lncRNA-HCG11在Lovo中的表達水平最高(P<0.05或P<0.01，圖1)。后續(xù)實驗選取lncRNA-HCG11高表達的Lovo細胞。

注：與NCM460比較，**P<0.01，***P<0.001，與Lovo相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 lncRNA-HCG11對結直腸癌細胞Lovo生物學行為的影響

qRT-PCR檢測結果表明，與對照組相比，敲降lncRNA-HCG11，Lovo細胞中l(wèi)ncRNA-HCG11的表達水平顯著降低(P<0.01，圖2A)；過表達lncRNA-HCG11，Lovo細胞中l(wèi)ncRNA-HCG11的表達水平明顯著升高(P<0.001，圖2A)；CCK-8實驗結果表明，敲降lncRNA-HCG11顯著抑制Lovo細胞增殖活力(P<0.05或P<0.01，圖2B)。Transwell實驗結果表明，敲降lncRNA-HCG11，Lovo細胞的侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)顯著低于對照組(P<0.01，圖2C-F)。而過表達lncRNA-HCG11，在CCK-8實驗和Transwell實驗中都得到相反的結果(P<0.05或P<0.01，圖2B-F)。因此，敲降lncRNA-HCG11可抑制Lovo細胞的增殖侵襲和遷移；過表達lncRNA-HCG11則促進Lovo細胞的增殖、侵襲和轉移。

注：與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 lncRNA-HCG11調控miR-144-3p的表達

starBase數(shù)據庫的預測結果表明，miR-144-3p可能是lncRNA-HCG11的靶基因(圖3A)。雙熒光素酶報告基因實驗結果表明，轉染miR-144-3p mimics，lnc-HCG11野生型載體組HEK293T細胞的熒光強度與對照組相比顯著降低(P<0.01，圖3B)，而lncRNA-HCG11突變型載體組細胞的熒光強度與對照組無顯著差異(圖3B)。這表明lncRNA-HCG11與miR-144-3p 靶向結合。同時，qRT-PCR定量結果表明，與對照組相比，敲降lncRNA-HCG11，Lovo細胞中miR-128-3p的表達水平明顯升高(P<0.001，圖3C)。由此可知，lncRNA-HCG11對miR-144-3p具有負調控作用。

注：與 NC 組比較，**P<0.01，***P<0.001。

2.4 miR-144-3p對結直腸癌細胞Lovo生物學行為的影響

qRT-PCR檢測結果表明，與對照組相比，過表達miR-144-3p，Lovo細胞中miR-144-3p的表達水平顯著升高(P<0.001，圖4A)；CCK-8實驗結果表明，過表達miR-144-3p顯著抑制Lovo細胞增殖活力(P<0.05或P<0.01，圖4B)；Transwell實驗結果表明，過表達miR-144-3p，Lovo細胞的侵襲和遷移能力與對照組相比顯著降低(P<0.01，圖C-F)。而轉染miR-144-3p inhibitor顯著降低miR-144-3p表達(P<0.01，圖4A)；在CCK-8實驗和Transwell實驗中都得到相反的結果(P<0.05或P<0.01，圖B-F)。因此，過表達miR-144-3p顯著抑制Lovo細胞的增殖、侵襲和遷移；抑制miR-144-3p表達能顯著促進Lovo細胞的增殖、侵襲和遷移。

注：與 NC組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.5 miR-144-3p對PRP11表達的調控作用

starBase數(shù)據庫的預測結果表明，PRP11可能是miR-144-3p的靶基因(圖5A)。雙熒光素酶報告基因實驗結果表明，轉染miR-144-3p mimics，PRP11野生型載體組HEK293T細胞的熒光素酶活性顯著下降(P<0.01，圖5B)，而miR-144-3p mimics與PRP11突變型載體共轉染，HEK293T細胞的熒光素酶活性與對照組相比無顯著差異(圖5B)。同時，Western blotting檢測結果表明，過表達miR-144-3p，Lovo細胞中PRP11的表達水平顯著下降(P<0.01，圖5C)。這表明，miR-144-3p負調控PRP11的表達。

注：與正常對照組比較，** P<0.01。

2.6 lncRNA-HCG11通過miR-144-3p/PRP11分子軸對結直腸癌細胞生物學行為的影響

Western blot檢測結果表明，過表達PRP11，Lovo細胞中PRP11表達水平明顯高于對照組(P<0.001，圖6A)；CCK-8檢測結果表明，與對照組相比，過表達PRP11顯著促進 Lovo細胞的增殖活力(P<0.05或P<0.01，圖6B)。Transwell實驗表明，與對照組相比，過表達PRP11組Lovo細胞的侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)顯著升高(P<0.01，圖6C-D)?；貜蛯嶒炛?，同時轉染pcDNA-lnc-HCG11+miR-148a-3p mimic，miR-148a-3p mimic+pcDNA-PRP11，si-lnc-HCG11+pcDNA-PRP11，顯著恢復了Lovo細胞中PRP11的表達水平(P<0.01，圖6A)。CCK-8和Transwell實驗檢測結果分別表明，lnc-HCG11通過下調miR-144-3p對PRP11的抑制作用，促進Lovo細胞增殖、侵襲和遷移(P<0.05或P<0.01，圖6B-D)。由此可知，lnc-HCG11與PRP11競爭結合miR-144-3p，促進Lovo細胞增殖、侵襲和遷移。

a：NC組；b：pcDNA-PRP11組；c：miR-144-3p模擬+pcDNA-PRP11組；d：si-lnc-HCG11+pcDNA-PRP11組；e：miR-144-3p模擬+pcDNA-PRP11組。與a組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與b組比較，#P<0.01。

3 討論

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國的發(fā)病率呈上升趨勢。結直腸癌患者的5年存活率與腫瘤細胞的浸潤、轉移程度負相關。近年來結腸癌的診斷和治療雖然在一定程度上降低了患者死亡率，但侵襲、轉移仍是導致結腸癌患者預后差和治療失敗的主要原因[7]。因此，深入研究結直腸癌侵襲和轉移相關的分子機制，對患者的診斷和預后有重要意義。大量研究證實，lncRNA在腫瘤的侵襲轉移中發(fā)揮了重要調節(jié)作用，已發(fā)現(xiàn)多個lncRNA與結直腸癌的侵襲和轉移相關[8]。例如，He等發(fā)現(xiàn)，lncRNA-CCAT1在結直腸癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織，在結腸癌細胞SW620中過表達CCAT1可顯著促進細胞增殖和侵襲[9]。Lu等發(fā)現(xiàn)，lncRNA-PANDAR在結直腸癌細胞中的表達水平顯著高于正常結腸上皮細胞，在體外實驗中，敲降lncRNA-PANDAR顯著抑制結直腸癌細胞生長、遷移和侵襲。Xu等發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MALAT1在結腸癌細胞HT29中，表達上調，沉默lncRNA-MALAT1顯著抑制結直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-HCG11在3株結直腸癌細胞中的表達明顯高于正常結腸上皮細胞；敲降lncRNA-HCG11顯著抑制腸癌細胞Lovo的增殖、侵襲和遷移能力；雙熒光基因報告實驗表明，lncRNA-HCG11負調控miR-148a-3p。

研究證實，miRNAs可與靶基因mRNA 3'端非翻譯區(qū)結合，促進靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯，在轉錄后水平調節(jié)其下游靶基因的表達，從而發(fā)揮促癌或抑癌基因的作用。有研究報道，miR-144-3p在多種腫瘤中異常表達，并參與調控腫瘤的增殖和轉移。其中，HCMV陽性膠質母細胞瘤細胞中，miR-144-3p 通過靶向下調TOP2A的表達，抑制HCMV陽性膠質瘤的體外增殖、克隆形成和侵襲[11]；前列腺癌細胞中，miR-144-3p 通過靶向下調CEP55的表達，抑制前列腺癌細胞的增殖、誘導細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-144-3p顯著抑制結直腸癌細胞Lovo的增殖、侵襲和遷移；進一步實驗表明miR-128-3p靶向負調控PRP11的表達。

PRP11是近年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的調節(jié)分子，PRP11參與細胞周期的調控，可能通過推動細胞的S期向G2/M期轉換，進而促進腫瘤細胞增殖。研究表明，PRP11在胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中高表達，與患者的不良預后相關[12]。雖然已證實PRP11參與細胞周期調控，但其涉及的分子機制仍然未知。目前為止，PRR11 在結直腸癌中的相關研究尚未報道。本研究通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)PRP11可能是 miR-144-3p的靶基因，并且，miR-144-3p與lnc-HCG11的位點也可以結合PRP11?；谝陨?，我們以內源競爭內源性 RNA理論為基礎，探討了lnc-HCG11通過miR-144-3p/PRP11分子軸對結直腸癌細胞Lovo增殖侵襲和遷移的調控作用。

本研究結果表明，HCG11在結直腸癌細胞系Lovo中表達水平顯著高于正常結直腸上皮細胞，LncRNA-HCG11通過與PRP11競爭結合miR-144-3p，從而促進結直腸癌細胞Lovo的增殖和遷移。