生長年限對甘肅貝母根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

武 睿，陳 垣，郭鳳霞，周 洋，焦旭升

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅省中藥材規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅省藥用植物栽培育種工程研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)定西校區(qū)，甘肅 定西 743000)

甘肅貝母(FritillariaprzewalskiiMaxim.)屬百合科多年生草本植物，是中藥川貝母(FritillariaeCirrhosaeBulbs)的基源植物之一，干燥鱗莖入藥，俗稱“岷貝”，具有清熱潤肺、化痰止咳、散結(jié)消癰等多種功效[1]。野生資源分布區(qū)域極其狹窄，主要分布在青藏高原2 400～4 300 m的高山草叢中，生態(tài)環(huán)境脆弱，海拔高，氣候寒冷，晝夜溫差大、紫外輻射強、無霜期短，導(dǎo)致甘肅貝母野生種群自然更新速度緩慢[2]，加之需求量不斷增加、過量的采集和生境惡化等原因的影響，其野生資源蘊藏量急劇下降，瀕臨滅絕，被《中國珍稀瀕危植物名錄》列為國家三級保護植物[3]，人工馴化栽培成為保護甘肅貝母野生資源和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要手段。然而，在栽培過程中，隨著貝母生長年限的增加，加之田間管理不善，藥材質(zhì)量呈現(xiàn)降低的趨勢，品質(zhì)退化較為嚴重[4]。此外，我們團隊在2016—2019年的連續(xù)4年的大田觀察中還發(fā)現(xiàn)，由于各種原因?qū)е碌母拭C貝母返青率也隨生長年限的增加而加重，個別地塊返青率不到20%，嚴重影響甘肅貝母的生產(chǎn)，表現(xiàn)出明顯的連作障礙(continuous monoculture problem)。研究者們同樣發(fā)現(xiàn)約有70%以上的藥用植物[5]，尤其是根及根莖類藥材，如人參[6]、當歸[7]、地黃[8]及山藥[9]等連續(xù)在同一塊田地上種植后均會出現(xiàn)土壤微生態(tài)環(huán)境惡化、自身生長發(fā)育不良、產(chǎn)量與藥用品質(zhì)下降等現(xiàn)象。近年來研究還發(fā)現(xiàn)根際微生態(tài)失調(diào)、微生物種群結(jié)構(gòu)的失衡可能是連作障礙發(fā)生的主要影響因子[10-12]。因此，探究甘肅貝母連作障礙發(fā)生機理與控制技術(shù)是一項亟待解決的問題。

根際土壤微生物被稱為植物的第二個基因組[11]，在維持土壤功能和生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性中起著至關(guān)重要的作用，參與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)、有機質(zhì)分解、土壤腐殖質(zhì)形成、土壤結(jié)構(gòu)維持、溫室氣體產(chǎn)生和環(huán)境污染物凈化[12-16]，通常被認為是土壤健康的敏感生物學(xué)指標[17-18]。同時，土壤養(yǎng)分也為土壤微生物提供了生長環(huán)境及能量，使得土壤質(zhì)量可通過微生物數(shù)量的變化而體現(xiàn)[19]。根際微生物群落的多樣性和組成的變化被認為與生物和非生物因素的變化有關(guān)，例如種植系統(tǒng)、植物種類和土壤特性[20]。細菌是土壤微生物中分布最廣、數(shù)量最多的部分[21]，占土壤微生物總數(shù)的70%～90%，是土壤養(yǎng)分變化的敏感指標之一[22]。研究微生物群落組成及多樣性一直是揭示植物-微生物互作關(guān)系機制的熱點問題。目前高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，提高了研究者對環(huán)境中微生物群落組成和功能的認知。因此，研究不同生長年限土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律，對選擇合理種植措施和改善土壤生態(tài)功能具有重要意義。

目前，甘肅貝母人工栽培所面臨的技術(shù)難題如種子灌漿特性[23]、種子發(fā)芽條件[24]、間作效果[25]及生殖分配規(guī)律[2]已有報道，但甘肅貝母生長年限與根際微生物群落結(jié)構(gòu)的變化研究未見報道。為此，本研究采用Illumina Misqe高通量測序?qū)Ω拭C漳縣撂荒(CK)、1 a生、3 a生和5 a生的甘肅貝母根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性分布特征進行研究，并闡明細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要環(huán)境驅(qū)動因子，旨在揭示不同種植年限下細菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性的異同關(guān)系，為克服甘肅貝母連作障礙和保持高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于甘肅省漳縣石川鎮(zhèn)(34°35′N，104°19′E)，屬高寒冷涼氣候，海拔2 700 m，年均氣溫4.2℃，年均降水量500～612 mm，且主要集中在7—9月，≥0℃日照時數(shù)1 629 h，≥10℃日照時數(shù)1 048 h，無霜期120～130 d。試驗地為多年撂荒地，為典型高山草甸土，土壤類型為黑土。坡度15°，占地面積2 500 m2，是甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)陳垣教授建立的野生甘肅貝母撫育基地。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 種子采集 甘肅貝母采用種子直播，于2012—2017年每年7月中旬采集野生甘肅貝母蒴果，帶回試驗地低溫4℃保濕保存?zhèn)溆?，種子千粒重為(1.610±0.194)g(n=10)。

1.2.2 種子播種 播種試驗采用單因子隨機區(qū)組設(shè)計。播前先整地，首先沿坡度將田地分成長畦(畦面長10 m，寬1 m，高5 cm)，畦間距0.3 m。種子條播，播深3 cm，行距為10 cm，播種量為8.0 g·m-2，每年播種3 畦，逐年同一時間連續(xù)播種。播后蓋遮陽網(wǎng)，供試樣地長期未施肥，除草等田間管理方式均一致。

1.3 土樣采集

1.3.1 根際土樣采集 本研究于甘肅貝母生長旺盛期(2018年6月25日)在撂荒地(CK)、甘肅貝母生長1 a(BM-1Y)、3 a(BM-3Y)和5 a(BM-5Y)的試驗小區(qū)采挖完整帶土甘肅貝母植株，參照蔡子平等[26]的方法現(xiàn)場收集根際土壤樣品。即在各處理隨機選取3個樣點，用滅菌鏟取15 cm×15 cm的土壤樣方，深度15 cm，將樣方土壤取出后置于滅菌的白瓷盤(20 cm×30 cm)中，貝母鱗莖及根系周圍松散土為非根際土，附著在甘肅貝母鱗莖及根系表面的土壤為根際土，迅速將甘肅貝母苗連同根際土壤裝入已滅菌并編號的20 mL離心管中，蓋緊離心管后用PM-966封口膜封口，然后將離心管放入干冰盒，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行根際土壤分離、根際土壤DNA提取和高通量測序，分析不同生長年際間根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性。

1.3.2 非根際土樣采集 取出的土壤樣品中抖落與甘肅貝母鱗莖及根系松散結(jié)合的土壤作為非根際土壤，將非根際土壤剔除甘肅貝母枯葉、根系和石塊等雜物后混合均勻，用無菌自封袋包好，置于冰盒帶回實驗室自然風(fēng)干，風(fēng)干過篩后進行土壤pH值、有機質(zhì)(OM)、水解氮(HN)、速效磷(AP)、速效鉀(AK)、全氮(TN)、全磷(TP)和全鉀(TK)等土壤理化因子的測定。

1.4 試驗方法

1.4.1 土壤理化因子 測定風(fēng)干土先過篩(篩孔1 mm)。土壤pH值采用pH計測定。OM采用K2Cr2O7-H2SO4稀釋熱法測定，TK和AK利用火焰光度計(M410，Sherwood，Britain)進行測定，TP和AP利用紫外分光光度計(TU-1901)進行測定，TN用凱氏定氮儀測定，利用堿性水解擴散法測定土壤HN[27]。

1.4.2 DNA抽提和PCR擴增 根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA kit(Omega Bio-tek, Norcross，GA，US)說明書進行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度；使用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序如下：95℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)(95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s)，然后72℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4℃進行保存(PCR儀：ABI Gene Amp?9700型)。PCR反應(yīng)體系為：5×Trans Start Fast Pfu緩沖液4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，上游引物(5 μM)0.8 μL，下游引物(5 μM)0.8μL，Trans Start Fast Pfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補足至20 μL。每個樣本3個重復(fù)。DNA抽提和PCR擴增均在上海美吉生物公司(上海，中國)利用Illumina-MiSeq平臺進行雙端測序分析。

1.4.3 高通量序列分析 獲得原始序列數(shù)據(jù)后，首先對有效序列進行去雜、修剪、去除嵌合體序列等過濾處理，得到優(yōu)化序列，通過聚類分析形成操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，然后對在97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。利用土壤細菌種類數(shù)(OTUs)和16S rDNA序列數(shù)(Reads)計算土壤細菌的Alpha多樣性，菌群豐度指數(shù)Chao I指數(shù)，菌群多樣性指數(shù)Shannon，覆蓋度指數(shù)Coverage以及譜系多樣性Phylogenetic diversity(PD)。

其中,SChao I為估計的OUT數(shù)目，Sobs為實際觀測到的OUT數(shù)目，n1為只含一條序列的OUT數(shù)目，n2為只含兩條序列的OUT數(shù)目。

Shannon的計算公式為：

其中,Sobs為實際觀測到的OUT數(shù)目，ni為第i個OUT所含的序列，N為所有序列數(shù)。

其中,n1為只含一條序列的OUT數(shù)目，N為抽樣中出現(xiàn)的總序列數(shù)目。

RDA/CCA分析反映菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系，其選擇原則是先用species-sample數(shù)據(jù)(97%相似性的樣本OTU表)做DCA分析，看分析結(jié)果中Lengths of gradient第一軸的大小，如果大于等于3.5，就采用CCA;如果小于3.5，RDA的結(jié)果要好于CCA，所有計算均采用上海美吉云平臺(https://www.i-sanger.com/)進行指數(shù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Microsoft Excel 2013軟件對數(shù)據(jù)進行整理和作圖。用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，One-way ANOVA進行單因素方差分析，采用最小顯著差異法(LSD)比較數(shù)據(jù)組間的差異，用Person相關(guān)系數(shù)評價不同因子間的相關(guān)性，用R語言進行RDA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長年限對甘肅貝母土壤理化因子的影響

由表1可見，除TN、TK和TP外，其他理化因子與甘肅貝母生長年限均有顯著影響(P<0.05)。與CK處理相比，土壤pH、OM、HN、AP和AK均隨甘肅貝母生長年限的增加呈先增加后降低趨勢，其中BM-1Y處理顯著提高了土壤OM、HN、AP及AK的含量，較CK處理分別提高了27.10%(P<0.05)、2.96%(P<0.05)、1.08%(P>0.05)及11.99%(P>0.05)；而BM-5Y處理達最低，OM、HN和AP較CK處理分別降低了22.76%、9.28%、和51.25%，且各處理間差異顯著(P<0.05)。TN、TP和TK含量均與生長年限無關(guān)，各處理間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同生長年限對甘肅貝母根際土壤細菌群落Alpha多樣性的影響

單樣本的多樣性分析可以反映樣品內(nèi)的細菌群落的豐富度和多樣性。不同生長年限對甘肅貝母土壤細菌群落Alpha多樣性指數(shù)影響如表2所示。不同生長年限甘肅貝母根際土的測序深度指數(shù)(Coverage 指數(shù))都在0.97以上，說明測序結(jié)果能夠展示樣品中絕大部分信息。OUT數(shù)、PD值、Chao I指數(shù)及Shannon指數(shù)在BM-1Y、BM-3Y和BM-5Y處理中的大小為BM-1Y>BM-3Y>BM-5Y，說明甘肅貝母生長年限越長，土壤細菌的物種總數(shù)、菌群豐富度以及復(fù)雜程度越低。

表2 不同生長年限甘肅貝母根際土壤細菌群落Alpha多樣性比較

2.3 不同生長年限對甘肅貝母土壤細菌組成的影響

從12個根際土壤樣品中共獲得細菌序列583687條(41837～52310)，以97%的相似水平進行OTU聚類，共獲得4980個OUT，對OTU的代表序列進行物種注釋后，繪制各個樣品在門水平上相對豐度大于1%的物種圖(圖1，見 頁)。測序后共獲得40門99綱190目369科655屬的土壤細菌，其中放線菌門(Actinobacteria)(23.58%～32.08%)豐度最高，其次是變形菌門(Proteobacteria)(22.00%～28.80%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(13.82%～20.86%)和綠彎菌門(Chloroflexi)(8.43%～15.08%)，均為土壤中的優(yōu)勢菌門，相對豐度均大于5%，占獲得總細菌序列量的82.96%。

對比不同生長年限間細菌門水平相對豐度關(guān)系發(fā)現(xiàn)，上述4種優(yōu)勢細菌中的變形菌門和酸桿菌門在各生長年限間差異不顯著，但酸桿菌門在BM-1Y、BM-3Y和BM-5Y處理的相對豐度均低于CK處理，較CK處理分別降低了26.06%、33.76%和22.30%。放線菌門在BM-1Y，BM-3Y和BM-5Y處理中相對豐度均高于CK處理，較CK處理分別提高了33.80%(P<0.05)、20.10%(P>0.05)和36.04%(P<0.05)。綠彎菌門在BM-1Y、BM-3Y和BM-5處理中相對豐度均低于CK處理，較CK處理分別降低了44.08%(P<0.05)、19.23%(P>0.05)和20.40%(P>0.05)。

在不同生長年限中檢測到相對豐度較低(1%～5%)的細菌門有：硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。其中硝化螺旋菌門相對豐度在不同生長年限間較穩(wěn)定，處理間無顯著差異；疣微菌門相對豐度在BM-1Y、BM-3Y和BM-5Y處理中均隨生長年限的增加而增大，但均低于CK處理；厚壁菌門相對豐度在BM-1Y、BM-3Y和BM-5Y處理中同樣隨生長年限的增加而增大，且均高于CK處理；擬桿菌門和芽單胞菌門相對豐度雖在不同處理中無一定的規(guī)律，但擬桿菌門在BM-5Y處理含量最低，較CK、BM-1Y和BM-3Y處理分別降低了55.56%(P<0.05)、55.09%(P<0.05)和60.63%(P<0.05)，而芽單胞菌門在BM-5Y處理含量最高，較CK、BM-1Y和BM-3Y處理分別提高了46.86%(P<0.05)、2.93%(P>0.05)和38.19%(P>0.05)。此外，本研究還檢測到包括藍細菌(Cyanobacteria)在內(nèi)的31個豐度很低的痕量菌門以及未分類的細菌門。

在屬水平，除未被分類的細菌屬9.66%外，不同生長年限甘肅貝母土壤細菌相對豐度排序前13的細菌菌屬分布見圖2。不同生長年限細菌優(yōu)勢屬基本相同，其中norank_c_ _Acidobacteria的相對豐度最高，達7.36%～12.73%，其次是屬norank_c_ _KD4-96、norank_o_ _Gaiellales和Gaiella，相對豐度分別為3.16%～6.65%、3.86%～5.24%和3.22%～4.11%。研究還發(fā)現(xiàn)隨著甘肅貝母生長年限的增加，norank_c_ _Acidobacteria和norank_f_ _Anaerolineaceae的相對豐度顯著降低。此外，根際土特有的細菌屬因生長年限不同而異(圖3)，其中CK處理獨有12個細菌屬，BM-1Y處理獨有13個細菌屬，BM-3Y獨處理有13個細菌屬，BM-5Y處理獨有16個細菌屬。

2.4 不同生長年限對甘肅貝母土壤理化因子與根際土壤細菌優(yōu)勢菌群的影響

由表3可知，不同年限甘肅貝母土壤理化因子與根際土壤細菌優(yōu)勢菌群的相關(guān)性不同，pH、OM、HN、AP和AK是驅(qū)動不同生長年限甘肅貝母根際土壤細菌群落的主要因子。變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)與根際土壤各理化因子間沒有顯著的相關(guān)性(P>0.05)。放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)與pH值呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，浮霉菌門(Planctomycetes)與pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)與AK呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。擬桿菌門(Bacteroidetes)與HN呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。厚壁菌門(Firmicutes)與OM、HN、AP呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。此外，土壤理化因子與細菌Alpha多樣性指數(shù)的相關(guān)性也不同，OM、HN和AP均與Chao I指數(shù)和Shannon指數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其他土壤理化因子與Chao I指數(shù)和Shannon指數(shù)無相關(guān)性(P>0.05)。

為了進一步探明不同年限甘肅貝母根際土壤細菌群落發(fā)生變化的主要環(huán)境因子。本研究對不同生長年限下甘肅貝母根際土壤相對豐度前10的細菌群落(門水平)與土壤理化性質(zhì)進行RDA/CCA分析(圖4)，第一軸可以解釋所有信息的53.33%，第二軸可以解釋所有信息的14.13%，DCA分析結(jié)果Axis_lengths=0.6282<3.5，表明該分析采用RDA分析。從表3還可以看出，pH、AK、HN、AP、OM、TK、TN和TP對不同年限甘肅貝母根際土壤優(yōu)勢細菌門均有一定程度的驅(qū)動作用，其程度大小為：pH>AK>HN>AP>OM>TK>TN>TP，其中pH、AK、HN、AP、OM是最主要的驅(qū)動因子。受此5種環(huán)境因子影響較大的細菌為：厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)及擬桿菌門(Bacteroidetes)。除AK外其余均對擬桿菌門(Bacteroidetes)具有正向作用，對放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)具有負向作用。

表3 不同生長年限甘肅貝母根際土壤細菌優(yōu)勢菌群(門)與土壤理化因子的相關(guān)性

3 討 論

3.1 生長年限對甘肅貝母根際土壤細菌多樣性的影響

甘肅貝母是多年生草本植物，從種子播種到開花結(jié)果至少需要5 a，商品藥材也至少需要3 a左右的時間。目前，大量研究已證實同一植物在同一土壤中生長多年(連作)，會出現(xiàn)明顯的連作障礙，可導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)改變、土壤微生物群落多樣性降低等，存在潛在的土壤肥力衰退趨勢[28-29]。土壤細菌作為土壤微生物中最重要的活性組分，其多樣性水平被認為是評價土壤生態(tài)功能的重要指標[30]。母茂君等[31]研究發(fā)現(xiàn)，隨著太白貝母生長年限的增加，根際土壤細菌多樣性整體上呈現(xiàn)遞減趨勢，土壤微生物區(qū)系由高肥力的“細菌型”向低肥力的“真菌型”過渡。Dong L L等[32]研究發(fā)現(xiàn)，三七在連作中土壤細菌Chao I指數(shù)和Shannon指數(shù)均隨連作年限的延長整體呈先增加后降低趨勢，說明適當短期連作能增加土壤細菌多樣性，而長期連作能降低土壤細菌多樣性。肖龍敏等[33]在不同種植年限寧夏枸杞根際微生物的群落多樣性研究中發(fā)現(xiàn)根際細菌的Shannon指數(shù)在種植5 a時達最高，隨著生長年限的延長而逐漸降低，在種植15 a時顯著降低，種植24 a達最低。本研究以撂荒地為對照(CK)，對生長1 a(BM-1Y)、3 a(BM-3Y)、5 a(BM-5Y)的甘肅貝母根際土的細菌群落Alpha多樣性同樣得出，OUT數(shù)、PD值、Chao I指數(shù)及Shannon指數(shù)均在BM-5Y中最低，說明甘肅貝母生長年限越長，土壤細菌的物種總數(shù)、菌群豐富度以及復(fù)雜程度越低，也就是土壤細菌的多樣性降低。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)土壤細菌Alpha多樣性指數(shù)與土壤有機質(zhì)、水解氮和速效磷均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，說明土壤養(yǎng)分的降低導(dǎo)致土壤細菌多樣性降低。同樣，劉株秀等[29]研究得出，大豆長期連作提高了土壤養(yǎng)分含量和細菌群落的豐富度和多樣性，Zak等[34]研究證實，輪作下細菌多樣性指數(shù)的增加不僅是由于作為微生物外源植物殘體種類數(shù)量的增加，而土壤養(yǎng)分尤其是速效養(yǎng)分的升高是微生物多樣性增加的另一主要因素。還有研究揭示，低養(yǎng)分堿性土壤條件不利于根際土壤微生物的生長和繁殖，同時也抑制了細菌的多樣性[35]，這均與本研究結(jié)果一致。所以在甘肅貝母栽培的田間管理中，隨著甘肅貝母生長年限的延長，可根據(jù)其生長情況適量增施氮肥和磷肥，并配合使用農(nóng)家肥，可保證其土壤微生物和土壤養(yǎng)分的平衡。

3.2 生長年限對甘肅貝母根際土壤優(yōu)勢細菌群的影響

細菌群落是土壤微生物中最主要的一類微生物，也是土壤微生物多樣性的重要指標。植物在土壤中的年限直接影響土壤細菌群落的結(jié)構(gòu)[36]，其細菌組成和豐度大小均有一定程度的差異[32]。本研究通過高通量測序技術(shù)對比發(fā)現(xiàn)，生長年限對甘肅貝母根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)具有一定的差異，但主要優(yōu)勢菌群較穩(wěn)定，均以放線菌門(Actinobacteria)豐度最高，其次是變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)。這與Wu等[37]和Xiong等[38]在高粱和黑胡椒連作對細菌群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致。這意味著放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)均能適應(yīng)各種植物物種的根際環(huán)境。土壤中每一特定性的菌類均具有不同的功能特性，放線菌門是自養(yǎng)型細菌，它不依賴土壤養(yǎng)分而生存，變形菌門是一類適應(yīng)性很強的細菌，該類菌中既包含動植物的病原菌也存在抑制致病菌的有益菌。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)各生長年限均有其特定的細菌微生物，并偏向特定種群，這與Lauber[39]等的研究結(jié)果相吻合。究其原因可能是多年生的甘肅貝母根系分泌物積聚在根際土壤中，為多個微生物群提供了底物。Chen[40]等同樣發(fā)現(xiàn)，植物不僅為微生物群落提供了營養(yǎng)，而且它們的根系分泌物還含有各種抗微生物代謝產(chǎn)物。

3.3 生長年限對甘肅貝母土壤理化因子與根際土壤細菌群落的相關(guān)性

在連續(xù)種植中，土壤理化因子能夠更好地體現(xiàn)土壤的健康狀況，并且能夠影響土壤微生物種群數(shù)量及分布。不同植被的營養(yǎng)代謝活動導(dǎo)致土壤養(yǎng)分具有一定的差異[41]。有研究表明，土壤理化因子與土壤微生物群落顯著相關(guān)，土壤環(huán)境因子的改變會影響土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)[42]。在本研究中，除TN、TK和TP外，其他pH、OM、HN、AP和AK等土壤理化因子與甘肅貝母生長年限均呈顯著差異(P<0.05)，其中pH、OM、HN、AP和AK是驅(qū)動甘肅貝母根際土壤細菌群落的主要因子。近年來，土壤pH值在細菌群落結(jié)構(gòu)形成中的重要作用已得到了充分的論證，均被揭示出pH值是決定細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主導(dǎo)因子[29,43]。Degrune等[44]發(fā)現(xiàn)微小的土壤pH值變化與細菌群落組成及多樣性指數(shù)存在顯著的相關(guān)性(P<0.01)。本研究同樣得出pH與放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)均呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，這進一步說明pH值下降有利于放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的生長。放線菌門(Actinobacteria)是自養(yǎng)型細菌，它不依賴土壤養(yǎng)分而生存，因此它與土壤養(yǎng)分相關(guān)性不顯著。OM、HN和AP均與厚壁菌門(Firmicutes)呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，而對擬桿菌門(Bacteroidetes)具有正向作用。擬桿菌門是有機碳的主要礦化者[29]，可以增加有機碳的含量，并為其他微生物及土壤酶活性提供能量。說明除土壤pH值外，土壤養(yǎng)分是引起不同種植制度中土壤細菌群落結(jié)構(gòu)變化的另一主要貢獻因子。

4 結(jié) 論

本研究從分子生物學(xué)的角度，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，甘肅貝母生長年限的延長顯著影響其土壤理化因子和細菌菌群結(jié)構(gòu)，其中BM-5Y顯著降低了土壤OM、HN和AP的含量，也顯著降低細菌多樣性，但各生長年限中的優(yōu)勢菌相對穩(wěn)定，均為放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)。土壤理化因子的變化會顯著影響細菌微生物群落結(jié)構(gòu)，其中pH、AK、OM、HN、AP含量是驅(qū)動根際土細菌群落的主要因子，且pH與放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，而OM、HN和AP均與厚壁菌門(Firmicutes)呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。因此，在甘肅貝母栽培中，應(yīng)結(jié)合輪作倒茬適時采挖，避免因生長年限過長而使土壤養(yǎng)分偏耗，進而改變根際土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)，影響甘肅貝母生長。

致謝：感謝甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)博士生安志剛及碩士生袁洪超、金彥博和郭一青參與馴化栽培。感謝碩士生王紅燕及本科生周錦程參與野外田間管理、土樣采集及室內(nèi)實驗。感謝康俊彥及郭志軍在栽培和田間管理中的技術(shù)指導(dǎo)。