基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的精覆力骨合劑治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制研究

閆起，姜北，楊波，梁華，李澤光，趙福紅，陳鑫，鄭時(shí)嘉，周忠光※

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040；3.牡丹江市第二人民醫(yī)院，黑龍江牡丹江157000；4.天問山農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)股份有限公司，黑龍江哈爾濱150323）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis,OP）是一種常見的骨代謝性疾病[1]，會(huì)引起骨礦物質(zhì)與骨基質(zhì)的丟失，造成骨密度降低、骨微結(jié)構(gòu)損壞，進(jìn)而導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，嚴(yán)重影響全球數(shù)億患者的生活質(zhì)量[2]。OP亦是我國老年人常見的主要慢性疾病之一[3]。OP的發(fā)生與多種因素相關(guān)，如人種、性別、年齡、營養(yǎng)、內(nèi)分泌和免疫等[4]。病理機(jī)制可以歸納為骨重建的平衡失調(diào)，出現(xiàn)骨吸收大于骨形成?，F(xiàn)階段OP的治療目的是盡可能減少骨吸收、增加骨形成。臨床常用治療手段包括非藥物治療（運(yùn)動(dòng)、增加鈣攝入及戒煙酒等）與藥物治療（基礎(chǔ)治療藥物、抗骨吸收藥物、促骨形成藥物、雙重調(diào)節(jié)藥物及中藥等）[5]。中醫(yī)古籍里并沒有記載“骨質(zhì)疏松癥”這一具體病名，但卻有與其癥狀相類似的“骨極”、“髓枯”和“骨痿”等描述。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病變主臟在腎，疾病性質(zhì)屬虛證，病機(jī)以精血虧虛為主[6]。

黃精獲天地之淳精，自古以來就是益壽遐齡之上品，甚至有“久服成仙”之傳說[7]，更有“仙人余糧”之美譽(yù)。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，黃精具有調(diào)節(jié)免疫、提高記憶力、抗氧化、抗衰老、抗疲勞及抗OP等多種作用[8]。精覆力骨合劑源于周忠光教授經(jīng)驗(yàn)方，以黃精為君藥，針對OP的中醫(yī)病因病機(jī)遣藥配伍而成，由黃精、覆盆子、黑芝麻、牡蠣、芡實(shí)、黨參和丁香組成，具有補(bǔ)益肝腎、健脾益氣和固本壯骨的功效，用于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和骨量減少，癥見腰背肢體疼痛、無力，在緩解OP癥狀、控制疾病進(jìn)展等方面具有較好的療效。但關(guān)于精覆力骨合劑治療OP的作用機(jī)制尚不明確，需要不斷探索，深入挖掘，所以基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的科學(xué)研究方法，對精覆力骨合劑抗OP作用機(jī)制進(jìn)行探析具有十分重要的意義。

1 資料與方法

1.1 精覆力骨合劑所含活性成分的篩選

TCMSP數(shù)據(jù)庫內(nèi)搜索黃精、覆盆子、黑芝麻、牡蠣、芡實(shí)、黨參及丁香等中藥所含化合物。根據(jù)藥物進(jìn)入機(jī)體內(nèi)所需經(jīng)歷的ADME過程，以生物利用度（Oral bioavailability）≥30%，類藥性（Drug-likeness）≥0.18為篩選條件，過濾后獲得活性成分。

1.2 精覆力骨合劑潛在靶標(biāo)基因與OP相關(guān)靶標(biāo)基因的確定

TCMSP數(shù)據(jù)庫內(nèi)檢索和已獲得活性成分相匹配的潛在靶標(biāo)基因。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫的UniprotKB模塊，限定物種為“human”，對已經(jīng)獲得的有關(guān)蛋白或基因名稱進(jìn)行校對。使用Genecards與OMIM數(shù)據(jù)庫，分別進(jìn)行以“osteoporosis”為主題詞的檢索，獲取OP治療的已知靶標(biāo)基因。

1.3 精覆力骨合劑活性成分靶標(biāo)基因與OP已知治療靶標(biāo)基因相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將精覆力骨合劑潛在靶標(biāo)基因與OP已知治療基因相交，兩者的交集即是復(fù)方治療OP的靶標(biāo)基因，而與交集基因相匹配的活性成分即為有效成分。利用Venny在線平臺，同樣將精覆力骨合劑潛在靶標(biāo)基因與OP已知治療基因相交，繪制韋恩圖。使用Cytoscape3.7.2，構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的篩選

在STRING平臺，輸入疾病靶點(diǎn)基因與藥物效用基因，以“Homosapiens”為物種，進(jìn)行蛋白互作分析，置信度設(shè)置為0.4，隱藏游離蛋白，得到PPI圖。對STRING所得PPI網(wǎng)絡(luò)文件使用Cytoscape3.7.2做進(jìn)一步可視化處理，計(jì)算節(jié)點(diǎn)屬性值，以Degree、combined_score值調(diào)節(jié)圖中節(jié)點(diǎn)、邊的可視化效果（節(jié)點(diǎn)由小到大，顏色由暗到亮表示Degree值由小到大；邊由粗到細(xì)，顏色由暗到亮表示combined_score值由小到大）。以節(jié)點(diǎn)degree值為指標(biāo)，篩選出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)核心基因。運(yùn)行R 4.0.2軟件繪制柱狀圖。

1.5 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/h3>

將交集基因?qū)隒ytoscape3.7.2，使用軟件中的Bisogenet及CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，對所得網(wǎng)絡(luò)計(jì)算所有節(jié)點(diǎn)Degree中位數(shù)，以＞2倍中位數(shù)為篩選條件，得到Hithubs網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步分別計(jì)算Hithubs網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、Information、LAC和Network中位數(shù)，以＞1倍中位數(shù)為篩選條件，得到核心子網(wǎng)絡(luò)。

1.6 Gene Ontology分析及KEGG通路富集分析

使用R 4.0.2軟件中的Bioconductor包進(jìn)行Gene Ontology（BP、MF和CC）分析及KEGG通路富集分析，以P≤0.5、q≤0.5為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)過篩選后輸出結(jié)果，進(jìn)行條形圖與氣泡圖的可視化繪制。

2 結(jié)果

2.1 精覆力骨合劑活性成分與潛在靶標(biāo)基因

經(jīng)篩選后得到12個(gè)黃精的活性成分及149個(gè)成分-基因?qū)?yīng)關(guān)系；7個(gè)覆盆子的活性成分及286個(gè)成分-基因?qū)?yīng)關(guān)系；7個(gè)黑芝麻的活性成分及48個(gè)成分-基因?qū)?yīng)關(guān)系；2個(gè)芡實(shí)的活性成分及23個(gè)成分-基因?qū)?yīng)關(guān)系；21個(gè)黨參的活性成分及214個(gè)成分-基因?qū)?yīng)關(guān)系；6個(gè)丁香的活性成分及309個(gè)成分-基因?qū)?yīng)關(guān)系。復(fù)方中有不同藥物包含相同活性成分的情況，去重后保留49種活性成分（見表1）。對已經(jīng)獲得的有關(guān)基因名稱進(jìn)行校對后，得到905個(gè)成分-基因?qū)?yīng)關(guān)系，有不同活性成分對應(yīng)于同一個(gè)靶基因的情況，去重后保留220個(gè)靶標(biāo)基因。

表1 精覆力骨合劑活性成分Table 1 Active ingredients contained in the Jing Fu Ligu Mixture

續(xù)表1

2.2 OP治療靶標(biāo)基因

使用Genecards與OMIM數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行以“osteoporosis”為主題詞的檢索，獲取OP治療的已知靶標(biāo)基因共4 133個(gè)，剔除重復(fù)者，最后保留4 122個(gè)。

2.3 精覆力骨合劑活性成分靶標(biāo)基因與OP已知治療靶標(biāo)基因交集

將220個(gè)靶標(biāo)基因與4 122個(gè)治療基因相交，得到的153個(gè)交集即是精覆力骨合劑治療OP的靶標(biāo)基因，見表2；與之相匹配的39個(gè)活性成分即是復(fù)方治療OP的有效成分，見表3。利用Venny在線平臺繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 精覆力骨合劑-OP交集基因韋恩圖Fig.1 The Venn map of the Jing Fu Ligu Mixture-osteoporosis intersection gene

表2 精覆力骨合劑治療OP的靶標(biāo)基因Table 2 The intersection gene of Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

表3 精覆力骨合劑治療OP的有效成分Table 3 Effective ingredients of Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

續(xù)表3

2.4 精覆力骨合劑-OP靶標(biāo)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape3.7.2軟件，輸入數(shù)據(jù)文件，構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2。圖2的中間位置藍(lán)色三角形代表靶基因，橢圓形代表藥物活性成分，紅色表示多味藥物，黃色表示黃精，綠色表示覆盆子，灰色表示黑芝麻，橙色表示黨參，粉色表示芡實(shí)，紫色表示丁香。

圖2 精覆力骨合劑-OP可視化網(wǎng)絡(luò)Fig.2 The JingFuLiguMixture-osteoporosisvisualization network

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

所得PPI共有153個(gè)節(jié)點(diǎn)、2 924條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為38.2，平均局部聚類系數(shù)為0.62，見圖3。對PPI網(wǎng)絡(luò)文件使用Cytoscape3.7.2做進(jìn)一步可視化處理，計(jì)算節(jié)點(diǎn)屬性值，以Degree、combined_score值調(diào)節(jié)圖中節(jié)點(diǎn)、邊的可視化效果（節(jié)點(diǎn)由小到大，顏色由暗到亮表示Degree值由小到大；邊由粗到細(xì)，顏色由暗到亮表示combined_score值由小到大），見圖4。以節(jié)點(diǎn)degree值為指標(biāo)，篩選出前30個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)核心基因，運(yùn)行R 4.0.2軟件繪制柱狀圖，見圖5。Degree值排名前30位的核心節(jié)點(diǎn)分別為AKT1、IL6、ALB、VEGFA、JUN、CASP3、MAPK8、EGF、MMP9、PTGS2、MAPK1、EGFR、MYC、ESR1、FOS、CCND1、IL1B、MMP2、CCL2、MAPK14、HSP90AA1、AR、ERBB2、CAT、CYCS、RELA、MTOR、BCL2L1、CTNNB1和PPARG，這些蛋白是精覆力骨合劑治療OP的關(guān)鍵蛋白。

圖3 精覆力骨合劑-OP的PPI核心網(wǎng)絡(luò)（置信度＞0.4）Fig.3 The core net work of interaction between the Jing Fu Ligu Mixture and osteoporosis protein

圖4 精覆力骨合劑-OP的PPI核心網(wǎng)絡(luò)Cytoscape可視化（置信度＞0.4）Fig.4 The core net work Cytoscape visualization of interaction between the Jing Fu Ligu Mixture and osteoporosis protein

圖5 核心蛋白柱狀圖Fig.5 The core protein histogram

2.6 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/h3>

共得到7 352 Nodes、162 016 edges。經(jīng)過＞2倍中位數(shù)篩選后，得到2 082 Nodes、85 445 edges即為Hithubs網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步經(jīng)過＞1倍中位數(shù)篩選后，得到655 Nodes、29 560 edges即為核心子網(wǎng)絡(luò)，見圖6。靠前的節(jié)點(diǎn)即為精覆力骨合劑治療OP的核心靶基因，degree值排名前30的靶基因依次為APP、NTRK1、EGFR、CUL3、XPO1、HSP90AA1、TP53、ESR1、MCM2、UBC、FN1、CDK2、HSP90AB1、COPS5、RNF2、MYC、CUL7、CUL1、SIRT7、GRB2、CAND1、OBSL1、NPM1、YWHAZ、ITGA4、VCP、CCDC8、CDC5L、FBXO6和TRAF6。

圖6 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鯢ig.6 The network topology analysis

2.7 Gene Ontology分析

經(jīng)BP、CC和MF分析后各得到2 070條、71條和141條結(jié)果，選擇其中較關(guān)鍵者進(jìn)行分析，進(jìn)行前20個(gè)條目的條形圖與氣泡圖的可視化繪制，見圖7。GO Biological Process（BP）主要涉及細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對類固醇激素的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、對金屬離子的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、對抗生素的反應(yīng)和細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等。GO Cellular Component（CC）主要涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、囊泡腔、分泌顆粒腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、核染色質(zhì)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物和小窩等。GO Molecular Function（MF）主要涉及核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、RNA聚合酶II特異性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合及磷酸酶結(jié)合等。

圖7 精覆力骨合劑治療OP關(guān)鍵靶點(diǎn)的BP分析barplot與dotplot圖Fig.7 The barplot and dotplot diagrams of the GO Biological Process analysis of key Targets of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

圖8 精覆力骨合劑治療OP關(guān)鍵靶點(diǎn)的CC分析barplot與dotplot圖Fig.8 The barplot and dotplot diagrams of the GO Cellular Component analysis of key Targets of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

圖9 精覆力骨合劑治療OP關(guān)鍵靶點(diǎn)的MF分析barplot與dotplot圖Fig.9 The barplot and dotplot diagrams of the GO molecular Function analysis of key targets of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

2.8 KEGG分析

經(jīng)過篩選后輸出結(jié)果，共得到145條結(jié)果，選擇其中較關(guān)鍵者進(jìn)行分析，進(jìn)行前20個(gè)條目的條形圖與氣泡圖的可視化繪制，結(jié)果見表4、圖10和圖11。

圖10 精覆力骨合劑治療OP關(guān)鍵靶點(diǎn)富集信號通路barplot與dotplot圖Fig.10 The barplot and dotplot diagrams of the signal pathway of the key target enrichment of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

表4 精覆力骨合劑治療OP的關(guān)鍵信號通路Table 4 The key signaling pathways of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

3 討論

黃精自古以來就被奉為抗衰扶羸之圣藥，以“九蒸九曬”的炮制方法使用最為廣泛，增其厚重之氣，克其濕膩之性，強(qiáng)其補(bǔ)益之效[9]，達(dá)增效、減毒、緩性之目的[10]。具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾，潤肺，益腎之功[11]?？莎熤T虛，止寒熱，安五臟，補(bǔ)五勞七傷，填精髓，助筋骨。臨床應(yīng)用廣泛，亦是諸多中醫(yī)經(jīng)典方劑的重要組成藥物。雖然目前已有相關(guān)研究證實(shí)或間接證實(shí)黃精具有抗OP作用，但是以黃精作為君藥的中藥復(fù)方制劑治療OP的研究尚未見報(bào)道。周忠光教授遵循中醫(yī)理論，啟迪于經(jīng)典名方，傳承精華，守正創(chuàng)新，以黃精為君藥，針對OP的病因病機(jī)，施以補(bǔ)腎健脾，益氣生血，養(yǎng)陰助陽之法，創(chuàng)制中藥復(fù)方——精覆力骨合劑，用于OP的治療。該方由黃精、覆盆子、黑芝麻、牡蠣、芡實(shí)、黨參和丁香組成。方中黃精性平，味甘，歸腎、脾、肺經(jīng)，補(bǔ)諸虛，填精髓，益脾胃，潤心肺，使五勞七傷得補(bǔ)，筋骨得健，肌肉得充，為君藥。臣以覆盆子、黑芝麻和牡蠣。覆盆子性微溫，味甘酸，入肝腎經(jīng)，固精縮尿，益肝腎明目，以其溫補(bǔ)之性益肝補(bǔ)腎，強(qiáng)筋壯骨，使精血旺盛，骨得髓養(yǎng)，筋得血濡，經(jīng)脈得充，筋骨堅(jiān)強(qiáng)。黑芝麻味甘，性平，入肝腎大腸經(jīng)，功能補(bǔ)益精液，潤肝臟，養(yǎng)血舒筋，益氣力，長肌肉，填腦髓。牡蠣味咸，性微寒，入肝腎膽經(jīng)，潛陽補(bǔ)陰，收斂固澀，以補(bǔ)腎正氣，除虛勞乏損。三藥相須為伍，效力陡增，使肝腎得補(bǔ)，腎精得固，以治病求本。佐以芡實(shí)、黨參、丁香三藥。芡實(shí)味甘、澀，性平，歸脾、腎經(jīng)，益精氣，固腎氣，且能健脾除濕以止瀉。黨參味甘，性平，歸脾、肺經(jīng)，補(bǔ)中益氣，補(bǔ)血，生津。丁香味辛，性溫，歸脾、胃、肺、腎經(jīng)，辛溫芳香，以行氣滯，療腎氣，暖腰膝，壯陽，起痿?？v觀全方，組方精當(dāng)，配伍嚴(yán)緊，標(biāo)本兼顧，使肝腎之精血得補(bǔ)，氣血營衛(wèi)得充，筋脈骨骼得利，骨痿之諸癥得愈。

精覆力骨合劑治療OP的有效成分有39個(gè)，如Quercetin、DFV（liquiritigenin）、beta-sitosterol、diosgenin和kaempferol等。Quercetin屬于天然黃酮類物質(zhì)，具有廣泛的生物活性。Sok Kuan Wong等[12]對Quercetin的骨保護(hù)作用進(jìn)行回顧性綜述，指出Quercetin可以對由RANKL介導(dǎo)的OC分化、OB凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等具有抑制作用，對成骨、血管生成、抗氧化、脂肪細(xì)胞凋亡和OC凋亡等具有促進(jìn)作用。其所涉及的機(jī)制包括對Wnt、NF-B、Nrf2、SMAD、MAPK以及凋亡相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)。Shashi chauhan等[13]研究提示，beta-sitosterol可以影響體外OB的活性與增殖，在體內(nèi)可以通過雌激素的調(diào)節(jié)而改善OP狀態(tài)。另外，beta-sitosterol還能增加OB的骨保護(hù)素（OPG）表達(dá)，同時(shí)減少核因子-B受體活化因子配體（RANKL）的表達(dá)，使OPG/RANKL的比值提高，產(chǎn)生骨保護(hù)的功能[14]。Zhang zhiguo等[15]研究發(fā)現(xiàn)，diosgenin可以通過介導(dǎo)Wnt，PI3K，RANK/RANKL或破骨因子途徑中重要分子的表達(dá)，抑制OC生成，從而影響骨代謝。Liu Hao等[16]研究證實(shí)，kaempferol可以提高因去卵巢導(dǎo)致的骨丟失模型大鼠的骨密度，并且能促進(jìn)BMSCs的成骨分化，上調(diào)RUNX2、Osterix和CXCL12的表達(dá)，下調(diào)miR-10a-3p表達(dá)，發(fā)揮抗OP的作用。

精覆力骨合劑治療OP的核心靶點(diǎn)基因眾多，如VEGFA、MMP9、ESR1、FOS、MMP2、RELA和TRAF6等。VEGF是調(diào)節(jié)血管發(fā)育和血管生成的重要生長因子[17]。由于骨骼是高度血管化的器官，血管生成在成骨中起著重要作用，因此VEGF也影響骨的發(fā)育與修復(fù)。Watson E C等[18]指出血管內(nèi)皮細(xì)胞具有重要的信號傳導(dǎo)功能，可以控制周圍組織及器官的生長、穩(wěn)態(tài)與再生。對于骨骼系統(tǒng)，其可以通過為造血干細(xì)胞提供血管壁來調(diào)節(jié)骨的發(fā)育、再生。ESR1/ER是雌激素發(fā)揮骨代謝調(diào)節(jié)作用的重要介質(zhì)，在骨組織中廣泛表達(dá)[19]。通過ESR1的介導(dǎo)，雌激素可以作用于OB、OC，促進(jìn)OB的增殖與分化，抑制OC活性并促進(jìn)凋亡[20]。MMP在ECM和組織重構(gòu)、器官發(fā)生發(fā)育、血管形成、免疫炎癥、細(xì)胞遷移、增殖和細(xì)胞凋亡等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，而骨基質(zhì)中存在的MMP與骨的生長、發(fā)育和重建密切相關(guān)[21]。在骨代謝中，首先由MMP2啟動(dòng)骨轉(zhuǎn)換，隨后激活MMP9，在MMP2及MMP9的作用下水解部分降解的Ⅰ型膠原及其他多種骨基質(zhì)蛋白，骨鹽因失去依附而丟失，發(fā)生OP[22]。RELA（P65）屬于NF-B家族的一員，NF-B家族共有5個(gè)成員：NF-B1（P50）、NF-B2（P52）、RelA（P65）、RelB和c-Rel。RelA可以與P50通過Rel同源域（RHD域）相互作用，形成二聚體，激活NF-kB信號通路，參與OC分化過程[23]。

精覆力骨合劑治療OP所涉及的信號通路有IL-17信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、破骨細(xì)胞分化、MAPK信號通路、NF-B信號通路、VEGF信號通路和Wnt信號通路等。IL-17作為炎性因子能夠?qū)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種不同細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)而直接產(chǎn)生RANKL，亦或是通過刺激相關(guān)細(xì)胞使IL-1、IL-6及TNF-等分泌增加，間接促進(jìn)RANKL的產(chǎn)生[24]，通過RANKL-RANK的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控OC的增殖與分化，其還可以抑制OPG的表達(dá)，使RANKL/OPG值升高，打破骨代謝的平衡狀態(tài)，促進(jìn)骨吸收[25]。TNF（腫瘤壞死因子）在免疫及炎癥性骨破壞中發(fā)揮重要作用。通常作用于OC以外的其他細(xì)胞類型，或與RANKL協(xié)同作用以間接促進(jìn)OC生成和骨吸收[26]。HIF1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以誘導(dǎo)血管生成-骨生成偶聯(lián)，HIF1可以上調(diào)VEGF的表達(dá)，增加骨組織內(nèi)的血管生成，促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)育，使局部微循環(huán)血供豐富，調(diào)節(jié)骨代謝[27]。破骨細(xì)胞分化途徑十分繁雜，其中包含由RANKL介導(dǎo)的多條經(jīng)典信號途徑，如OPG/RANKL/RANK、RANKL/TRAF6/NF-B、RANKL/TRAF6/MAPKs和JAK2/STAT3/RANKL等。另外如IL-1、TNF-等炎性細(xì)胞因子、M-CSF等均參與到OC的分化過程中[28]。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特點(diǎn)是經(jīng)過MAPKKK-MAPKK-MAPK三級激酶磷酸化反應(yīng)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞相互傳導(dǎo)功能等進(jìn)程，包含ERK1/2/5、JNK、p38等多條轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[29]，其中以ERK1/2和p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與OB增殖、分化關(guān)系最為密切，向下影響Runx2以及成骨相關(guān)基因的表達(dá)[30,31]。Wnt信號通路包括經(jīng)典的Wnt/-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及非經(jīng)典的Wnt/Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和Wnt/Planar cell polarity信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。經(jīng)典的Wnt/-catenin能夠促進(jìn)OB的增殖、分化，而且對于OPG/RANKL/RANK信號通路亦有調(diào)控作用，通過抑制RANKL的表達(dá)、上調(diào)OPG的表達(dá)，間接影響OC的功能[32]。Wnt/-catenin還可以促進(jìn)MSCs向OB分化，激活轉(zhuǎn)錄因子Osterix的表達(dá)，促進(jìn)成骨[33]。

綜上所述，精覆力骨合劑能夠通過抗炎、改善骨微環(huán)境、調(diào)節(jié)成骨與破骨平衡、抑制OB凋亡和促進(jìn)OC凋亡等多種機(jī)制調(diào)節(jié)骨代謝，發(fā)揮治療OP的作用。本研究依托“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”理論，從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探析精覆力骨合劑的有效成分及作用靶點(diǎn)，結(jié)合生信數(shù)據(jù)分析，借助現(xiàn)代科學(xué)研究工具，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與可視化，契合中醫(yī)藥研究所具有的非線性的開放性復(fù)雜體系特點(diǎn)，探討精覆力骨合劑治療OP的多靶點(diǎn)整體調(diào)節(jié)作用機(jī)制，分析潛在效用靶點(diǎn)及信號通路，為臨床應(yīng)用黃精及以其為君藥的復(fù)方-精覆力骨合劑治療OP提供理論支持，為拓展傳統(tǒng)保健中藥黃精的臨床新用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)與思路。