黃芪多糖、銀黃聯(lián)用對(duì)新生犢牛免疫力及發(fā)病的影響

郭思凡，曹 杰

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193

0 引言

新生犢牛在胎兒時(shí)期無(wú)法通過(guò)胎盤(pán)獲得母源抗體，出生后需通過(guò)初乳獲得被動(dòng)免疫，此階段犢牛免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，易受各種病原侵襲而發(fā)生腹瀉、肺炎等疾病[1]。預(yù)防性使用抗生素可能造成犢牛腸道菌群失調(diào)、生長(zhǎng)緩慢，也會(huì)增加耐藥風(fēng)險(xiǎn)。黃芪多糖是中藥黃芪的提取物，能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞功能，快速殺滅病原菌，從多通路上提高犢牛免疫力[2，3]。銀黃可溶性粉是金銀花和黃芩提取物，主成分為黃芩苷和綠原酸，可干擾病原微生物的復(fù)制表達(dá)代謝，具有解熱、止咳平喘的作用，對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病有很好的抑制作用[4]。且黃芪多糖和銀黃可溶性粉沒(méi)有耐藥風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)的目的在于，探索黃芪多糖和銀黃聯(lián)用對(duì)新生犢牛免疫力及發(fā)病的影響，為犢牛疾病預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃芪多糖粉，北京生泰爾生物科技有限公司生產(chǎn)，獸藥字050325236；銀黃可溶性粉，北京生泰爾生物科技有限公司生產(chǎn)，獸藥字050325229。

免疫球蛋白G（IgG）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自比利時(shí)Bio-X Diagnostics公司；白細(xì)胞介素2（IL-2）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、CD3分子、CD4分子、CD8分子酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）試劑盒，購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。

Cence離心機(jī)CL5，購(gòu)自凱達(dá)湘儀離心機(jī)廠；HT312醫(yī)用折光儀，購(gòu)自ATC公司；MK3酶標(biāo)儀，購(gòu)自Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及處理

試驗(yàn)分兩階段進(jìn)行，I期試驗(yàn)在河北首農(nóng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技有限公司進(jìn)行，II期試驗(yàn)選擇新生犢牛發(fā)病率較高的河北某牧場(chǎng)進(jìn)一步驗(yàn)證。兩次試驗(yàn)各選擇40頭體重相近、健康狀態(tài)良好的1 日齡荷斯坦母犢納入試驗(yàn)，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20 頭。試驗(yàn)組犢牛自出生起，每天隨奶投服黃芪多糖5 g、銀黃可溶性粉3 g，每天1 次，連續(xù)給藥7 天。對(duì)照組犢牛不給藥，其他飼養(yǎng)條件一致。

1.3 數(shù)據(jù)收集及分析

自出生起連續(xù)觀察記錄兩組犢牛21 天內(nèi)健康狀況。按照美國(guó)威斯康辛大學(xué)犢牛健康評(píng)分表打分，記錄犢牛腹瀉、肺炎發(fā)生情況，如耳號(hào)、癥狀持續(xù)時(shí)間和死亡數(shù)，計(jì)算發(fā)病率、發(fā)病群體平均評(píng)分和死亡率。在給藥第7天時(shí)，I期試驗(yàn)40 頭犢牛采血，血清總蛋白使用醫(yī)用折光儀檢測(cè)，血清IgG、IL-2、TNF-α、CD3、CD4、CD8使用ELISA試劑盒檢測(cè)。

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 新生犢牛發(fā)病及死亡情況分析

I期試驗(yàn)兩組新生犢牛均未發(fā)生肺炎，腹瀉分1～7 天、8～21 天兩階段統(tǒng)計(jì)。兩階段內(nèi)試驗(yàn)組新生犢牛腹瀉發(fā)生率均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；試驗(yàn)1～7 天發(fā)病評(píng)分，試驗(yàn)組與對(duì)照組相同，8～21天，試驗(yàn)組低于對(duì)照組，但差異不顯著（表1）。試驗(yàn)組8～21 天發(fā)病率較1～7 天提高5%，對(duì)照組8～21天發(fā)病率較1～7 天提高25%。試驗(yàn)組8～21 天發(fā)病評(píng)分較1～7 天無(wú)變化，對(duì)照組8～21 天發(fā)病評(píng)分較1～7 天提高0.18（表1）。從腹瀉犢牛具體評(píng)分上看，試驗(yàn)1～7 天兩組腹瀉犢牛評(píng)分均為2分，8～21天，試驗(yàn)組腹瀉犢牛評(píng)分均為 2 分，而對(duì)照組有50%的腹瀉犢牛為2 分，50%的腹瀉犢牛為 3 分，表明試驗(yàn)組犢牛腹瀉發(fā)生嚴(yán)重程度輕于對(duì)照組犢牛（表2）。從腹瀉持續(xù)時(shí)間上看，試驗(yàn)1～7 天，試驗(yàn)組犢牛腹瀉持續(xù)時(shí)間為3～4 天，對(duì)照組均為4 天及以上；8～21 天，試驗(yàn)組犢牛腹瀉持續(xù)時(shí)間均為3 天，對(duì)照組持續(xù)3 天的犢牛僅占40.0%（表3）。

表1 試驗(yàn)期間犢牛腹瀉發(fā)生情況

表2 試驗(yàn)期間腹瀉犢牛評(píng)分情況 單位：頭

表3 試驗(yàn)期間犢牛腹瀉持續(xù)時(shí)間 單位：頭

II期試驗(yàn)犢牛腹瀉、肺炎均有發(fā)生。兩期試驗(yàn)犢牛腹瀉情況綜合分析表明，黃芪多糖和銀黃聯(lián)用可有效降低犢牛腹瀉發(fā)生率，降低腹瀉犢牛臨床癥狀的嚴(yán)重性，縮短腹瀉持續(xù)時(shí)間。將II期試驗(yàn)犢牛肺炎發(fā)病情況分成1～7 天、8～21 天兩階段統(tǒng)計(jì)。1～7天，試驗(yàn)組和對(duì)照組新生犢牛均無(wú)肺炎發(fā)生，10 天左右部分犢牛出現(xiàn)癥狀，輕微淚痕，單側(cè)眼睛少量黏稠分泌物，按照美國(guó)威斯康辛大學(xué)犢牛健康評(píng)分表計(jì)算總評(píng)分小于4 分；部分犢牛癥狀加重表現(xiàn)肺炎，持續(xù)性咳嗽、淚痕、雙側(cè)膿性鼻腔分泌物、單耳或雙耳下垂（中耳炎），采用長(zhǎng)效土霉素治療。試驗(yàn)8～21 天內(nèi)，試驗(yàn)組犢牛肺炎發(fā)病率顯著低于對(duì)照組，死亡率低于對(duì)照組但差異不顯著（表1）。犢牛肺炎發(fā)病評(píng)分，試驗(yàn)組1 頭犢牛評(píng)分為6 分，對(duì)照組7 頭犢牛評(píng)分4 分犢牛3 頭、6 分犢牛4 頭。試驗(yàn)組僅1 頭犢牛發(fā)生肺炎，持續(xù)3 天，最終死亡，而對(duì)照組7 頭發(fā)病犢牛中，持續(xù)3、4、5天時(shí)間各1 頭，4頭發(fā)病時(shí)間≥7 天，最終死亡3 頭。結(jié)果表明，黃芪多糖和銀黃聯(lián)用可降低犢牛肺炎發(fā)病率、縮短發(fā)病時(shí)間并減輕發(fā)病嚴(yán)重程度。

2.2 I期試驗(yàn)犢牛血清總蛋白、IgG、免疫因子及T細(xì)胞淋巴亞群評(píng)價(jià)

I期試驗(yàn)40 頭犢牛采血檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組犢牛出生第7天的TP值均高于5.50 g/dL，IgG均高于10.00 mg/mL，并且均在正常范圍內(nèi)，表明試驗(yàn)組和對(duì)照組新生犢牛均未出現(xiàn)被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)失敗。試驗(yàn)組犢牛的TP值較對(duì)照組高0.28 g/dL，IgG含量較對(duì)照組高0.24 mg/mL，均差異顯著（P＜0.05），表明黃芪多糖與銀黃聯(lián)用可在一定程度上促進(jìn)初乳免疫球蛋白被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，提高犢牛免疫力。試驗(yàn)組犢牛血清IL-2水平較對(duì)照組犢牛高3.4 pg/mL，差異不顯著；血清TNF-α水平較對(duì)照組低1.34 pg/mL，差異顯著（P＜0.05）。試驗(yàn)組犢牛CD3、CD4、CD8濃度均高于對(duì)照組，差異不顯著；試驗(yàn)組犢牛CD4/CD8值高于對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05），表明黃芪多糖和銀黃聯(lián)用可提高新生犢牛的免疫水平。

表4 試驗(yàn)期間犢牛肺炎發(fā)病情況

3 討論

I期試驗(yàn)中1～7 日齡犢牛腹瀉發(fā)生率較低、持續(xù)時(shí)間較短、糞便評(píng)分較輕微，牧場(chǎng)在犢牛出生1 h內(nèi)灌服4 L優(yōu)質(zhì)初乳提供了重要保障。試驗(yàn)組犢牛TP值及IgG含量均顯著高于對(duì)照組，腹瀉發(fā)生率顯著低于對(duì)照組，表明黃芪多糖和銀黃聯(lián)用在初乳灌服基礎(chǔ)上可進(jìn)一步提高初乳中免疫球蛋白的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。7 天后犢牛腹瀉發(fā)生率明顯上升，主要與天氣變化導(dǎo)致的環(huán)境病原微生物富集有關(guān)。試驗(yàn)于2020年9月進(jìn)行，第10天起經(jīng)歷數(shù)日陰雨天氣，犢牛島積水、圈舍清理不及時(shí)、病原微生物富集，導(dǎo)致腹瀉發(fā)生率升高。采集腹瀉犢牛糞便進(jìn)行輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿菌K99及隱孢子蟲(chóng)抗原檢測(cè)，結(jié)果顯示，輪狀病毒陽(yáng)性率75.0%、隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率12.5%，且存在合并感染。試驗(yàn)組新生犢牛8～21 天發(fā)病情況較對(duì)照組輕微，表明黃芪多糖和銀黃聯(lián)用能有效抵抗感染性因素以及環(huán)境因素的影響，降低停藥后犢牛發(fā)病率及發(fā)病嚴(yán)重程度。輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞）是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要一環(huán)，主要分泌IL-2、TNF-α等細(xì)胞因子。TNF-α升高時(shí)，可打破腸道促炎因子與抗炎因子之間的平衡引發(fā)腹瀉。T細(xì)胞淋巴亞群分布水平對(duì)于抗感染以及免疫調(diào)節(jié)起到重要作用。根據(jù)其表面標(biāo)志物，T淋巴細(xì)胞可分為CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞[5]，CD4/CD8值越高，表明機(jī)體免疫功能越強(qiáng)。黃芪多糖和銀黃聯(lián)用能有效調(diào)節(jié)新生犢牛細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞亞群分布情況，試驗(yàn)組TNF-α濃度較對(duì)照組降低13.7%，CD4/CD8值提高6.6%，均存在顯著差異，有助于提升新生犢牛免疫力，改善腸道健康，最終降低腹瀉的發(fā)生。

表5 試驗(yàn)期間肺炎犢牛評(píng)分情況 單位：頭

表6 試驗(yàn)期間肺炎犢牛發(fā)病持續(xù)時(shí)間 單位：頭

表7 I期試驗(yàn)犢牛被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫因子及T細(xì)胞淋巴亞群情況

II期試驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)犢牛腹瀉和肺炎發(fā)病率一直較高，可能與牧場(chǎng)產(chǎn)犢高峰期犢牛小群飼養(yǎng)密度較高（20頭/群）且群內(nèi)日齡相差較大有關(guān)。Svensson等[6]發(fā)現(xiàn)，犢牛從犢牛島轉(zhuǎn)至小群飼養(yǎng)后，12～18 頭/圈飼養(yǎng)犢牛較6～9 頭/圈犢牛呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率更高，但在腹瀉方面沒(méi)有明顯差異。Costa等[7]發(fā)現(xiàn)，小群飼養(yǎng)過(guò)程中日齡差距較大時(shí)，日齡偏小犢牛發(fā)病率增加。牧場(chǎng)可以通過(guò)增加犢牛島數(shù)量、犢牛圈數(shù)量、調(diào)整分群等方式降低發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。II期試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪多糖和銀黃聯(lián)用可有效減緩犢牛腹瀉發(fā)生率的升高以及臨床癥狀的加重，縮短腹瀉持續(xù)時(shí)間。

秋冬季節(jié)由于天氣變化、冷應(yīng)激等原因，犢牛抵抗力減弱易發(fā)生肺炎。II期試驗(yàn)8～21 天試驗(yàn)組犢牛肺炎發(fā)病率顯著低于對(duì)照組，降低30.0%。發(fā)病持續(xù)時(shí)間方面，試驗(yàn)組肺炎犢牛為3 天，對(duì)照組在3～8 天之間，57.1%的犢牛發(fā)病持續(xù)時(shí)間≥1 周。上述結(jié)果表明，黃芪多糖和銀黃聯(lián)用可降低肺炎發(fā)病率、縮短發(fā)病時(shí)間。黃芪多糖和銀黃聯(lián)用通過(guò)降低TNF-α濃度、提高CD4/CD8值等調(diào)節(jié)方式，維持機(jī)體促炎與抗炎因子平衡，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬作用，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖與分化，提升新生犢牛免疫力，減少肺炎發(fā)病[8，9]。死亡犢牛均集中在15～25日齡之間，剖檢顯示肺實(shí)變、淤血/出血、部分區(qū)域干酪樣壞死，肺臟病料實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確定為支原體感染。黃芪多糖和銀黃可溶性粉聯(lián)用可部分阻斷支原體感染，發(fā)生支原體肺炎時(shí)應(yīng)做到早診斷早治療，出現(xiàn)淚痕的犢牛要引起警惕，評(píng)分大于4 分的犢牛及時(shí)治療。兩期試驗(yàn)對(duì)照組發(fā)病情況對(duì)比發(fā)現(xiàn)，8～21天觀察期內(nèi)，I期試驗(yàn)對(duì)照組犢牛未出現(xiàn)犢牛肺炎，而II期試驗(yàn)對(duì)照組犢牛肺炎發(fā)病率為35.0%，這與飼養(yǎng)模式有關(guān)，小群飼養(yǎng)模式犢牛肺炎發(fā)病率要高于犢牛島飼養(yǎng)模式[6]，犢牛島單欄飼養(yǎng)是預(yù)防哺乳犢牛肺炎高發(fā)的有效管理手段。

4 結(jié)論

口服黃芪多糖和銀黃可溶性粉，可顯著提高新生犢牛血清總蛋白和IgG含量，提升初乳中免疫球蛋白被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)效率，顯著降低新生犢牛血清TNF-α濃度，顯著提高CD4/CD8值，改善T細(xì)胞淋巴亞群分布狀況，從而提升新生犢牛的整體免疫力，顯著降低出生21 天內(nèi)犢牛腹瀉及肺炎的發(fā)病率和死亡率。