氟咯草酮液相色譜質(zhì)譜分析方法構(gòu)建

李宗興，李 瑋

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016;3.青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

氟咯草酮(Flurochloridone,FLC)是一種吡咯烷酮類除草劑，分子式為C12H10Cl2F3NO。它對(duì)繁縷、婆婆納、馬齒莧、豬殃殃等闊葉類雜草中的胡蘿卜素、葉綠素合成有很大影響，從而達(dá)到除草的效果，多在播后苗前施用，對(duì)作物安全，在國內(nèi)外具有廣泛的應(yīng)用前景[1-3]。

馬鈴薯作為我國第四大糧食作物，是我國主要的增量作物之一，它作為一種耐寒作物，具有適應(yīng)性廣、抗旱性強(qiáng)等特征[4-5]。農(nóng)田中雜草過多生長會(huì)影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，青海高原地區(qū)主要還是以化學(xué)除草為主，當(dāng)前馬鈴薯田間國家登記生產(chǎn)的除草劑種類有二甲戊靈、乙草胺、精喹禾靈、異丙草胺等[6]。馬鈴薯田間的除草劑還是以氟樂靈等傳統(tǒng)除草劑為主，隨著雜草種類和密度的增加，傳統(tǒng)除草劑不能起到很好的防除效果，而且用量大，造成農(nóng)藥殘留，對(duì)環(huán)境也造成污染，需要一種新型除草劑來改變這種現(xiàn)狀。王恒智[7]等研究了氟咯草酮及其混劑在棉花田間的防治效果及安全性，但是氟咯草酮在馬鈴薯田間的防治效果及安全性少有報(bào)道，因此氟咯草酮被課題組應(yīng)用于青海高原馬鈴薯田間的防治效果和安全性研究[8]。結(jié)果表明：氟咯草酮在馬鈴薯田使用中的劑量推薦為350-650g a.i./hm2；對(duì)單雙子葉雜草綜合防效達(dá)到80%以上，增產(chǎn)10.15%以上，而且對(duì)馬鈴薯的營養(yǎng)價(jià)值和品值無影響。目前有報(bào)道研究了氟咯草酮的分析檢測(cè)方法[9]，但氟咯草酮在馬鈴薯田間基質(zhì)中的分析檢測(cè)方法較少。本文主要為氟咯草酮在青海高原馬鈴薯田間試驗(yàn)構(gòu)建殘留檢測(cè)方法，該方法采用改進(jìn)的QuEChERs前處理凈化法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè)，與單一的色譜法相比，色譜質(zhì)譜串聯(lián)法具有靈敏度高、高度專一等特點(diǎn)，成為一種農(nóng)藥殘留檢測(cè)的重要手段；QuChERs法具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效、安全、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，廣泛運(yùn)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)中樣品前處理與凈化過程[10-11]。兩種方法的聯(lián)用對(duì)馬鈴薯田中氟咯草酮?dú)埩舻臋z測(cè)提供了更加快捷、簡(jiǎn)單的技術(shù)支持，建立了馬鈴薯和土壤中氟咯草酮?dú)埩舻亩糠治龇椒ā?/p>

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

色譜甲醇、乙腈( 天津白石化工有限公司)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18固相分散劑、0.22μm有機(jī)濾膜(Agela Technologies,天津)；無水硫酸鎂、NaCl( 天津光福科技發(fā)展有限公司)。

氟咯草酮原農(nóng)藥由上海泰和集團(tuán)有限公司提供，供試的馬鈴薯土壤、葉、根、塊莖采自青海高原青薯九號(hào)實(shí)驗(yàn)田區(qū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(液相三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀，LCMS-8040，日本島津公司)；Shim-pack XR-ODSII柱(2.0mm×75mm，日本Shimadzu公司)；TGL-20B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.3 樣品前處理

馬鈴薯的葉、塊莖、根要打碎成泥狀，大顆粒土壤要粉碎。準(zhǔn)確稱取土壤、馬鈴薯塊莖、葉、根各10.0g于50ml離心管中，隨后加入10ml乙腈，振蕩渦旋5min，然后加入1gNaCl和4g無水MgSO4,振蕩1min后在5000r/min下離心5min。取土壤上清液1.5ml置于裝有50mg PSA和100mg無水MgSO4的2ml離心管中；取葉和莖上清液1.5ml于裝有150mg PSA、50mg GCB和100mg無水MgSO4的2ml的離心管中；取根上清液1.5ml于裝有100mg PSA、25mg GCB和100mg無水MgSO4的2ml的離心管中;塊莖上清液的取法與根的一樣，取完后，渦旋1min，12000r/min下離心2min,取上清液過0.22μm有機(jī)膜，待測(cè)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用純色譜乙腈溶解后配置成氟咯草酮的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液用純色譜乙腈逐漸稀釋成0.01、0.05、0.10、0.50和1.00mg/L備用標(biāo)準(zhǔn)溶液，在-20℃密封冷凍保存,備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)采用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜，三重四級(jí)桿檢測(cè)器檢定。電噴霧正離子電離源(ESI+)，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)，所用氣體為高純氮?dú)?；碰撞氣體為氬氣；碰撞氣體的壓力為3.0mbar;離子源溫度為120℃；溶劑化溫度為250℃；加熱塊溫度為450℃，溶劑化氣流量設(shè)置為10.0min/L，利用儀器對(duì)氟咯草酮進(jìn)行分析優(yōu)化，結(jié)果如表1所示。

表1 分析物的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)參數(shù)Table.1 Mass spectrometric experiment parameters of the analytes

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)考察了乙腈/含甲酸的水、乙腈/含乙酸的水、甲醇和水體系、還比較了含有0.02%(v/v)乙酸的甲醇/水和5mmol乙酸銨的組合作為流動(dòng)相時(shí)的色譜峰形。結(jié)果表明，在0.25ml/min的流速下，含有0.02%(v/v)乙酸的甲醇/水和5mmol乙酸銨的組合作為流動(dòng)相時(shí)顯示較好的峰形，峰形對(duì)稱，而且沒有其它的雜質(zhì)峰干擾，而且氟咯草酮具有較好的分離現(xiàn)象，色譜圖如圖1所示，故選其作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫的時(shí)間程序梯是在注射時(shí)以50%色譜甲醇開始，在2min內(nèi)增加到95%，并保持3min。然后，在5.01min內(nèi)降至50%，保持時(shí)間為3min。本試驗(yàn)還考察了不同柱溫箱溫度對(duì)目標(biāo)物影響，結(jié)果表明在30℃、35℃和40℃的柱溫下，40℃時(shí)的目標(biāo)物具有較好的響應(yīng)值。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取劑的優(yōu)化

本試驗(yàn)中考察乙腈和甲醇作為提取劑時(shí)的提取效率，結(jié)果表明在1.0mg/kg添加水平下，氟咯草酮在10ml的甲醇中的提取率低于70%，乙腈中的提取率分別為85.2%-90.5%，因此選用提取效果好的乙腈作為提取劑。試驗(yàn)對(duì)渦旋振蕩時(shí)間(2min、3min、5min)進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長，乙腈提取的效果越明顯，提取時(shí)間在5min以后，提取的效果不再隨時(shí)間的延長而增加，結(jié)果逐漸趨于穩(wěn)定，因此選用5min作為振蕩渦旋提取時(shí)間。

2.2.2 凈化劑的選擇優(yōu)化

QuEChERS前處理方法中C18、GCB、PSA、florisil等作為常見的凈化劑。C18主要去除非極性和脂肪性物質(zhì)；PSA主要去除基質(zhì)中的有機(jī)酸、糖類、脂肪酸和一些色素；GCB去除色素和非極性干擾物質(zhì)[12]。在本試驗(yàn)中，主要選擇C18、PSA、GCB作為吸附材料，考察了對(duì)目標(biāo)化合物的吸附情況。結(jié)果如圖2所示，在100 μg/kg的添加水平下，以乙腈作為提取劑，用相同質(zhì)量的凈化劑提取馬鈴薯各個(gè)基質(zhì)中的目標(biāo)物，做三組重復(fù)，以GCB作凈化劑時(shí)，平均回收率在46.2%-49.4%之間，達(dá)不到檢測(cè)要求。以C18、PSA作凈化劑時(shí)的平均回收率分別在79.5%-83.5%，86.0%-88.1%，能達(dá)到農(nóng)藥在農(nóng)作物中的殘留檢測(cè)要求[13]，根據(jù)回收率比較，試驗(yàn)最終決定用PSA作為凈化劑。

2.3 方法的線性及相關(guān)系數(shù)

2.3.1 溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

使用配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為y=807265x+7560.6，R2=0.9996見圖3。

2.3.2 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)

依次吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入取樣量相同的空白基質(zhì)樣品中，根據(jù)氟咯草酮出峰的保留時(shí)間定性，峰面積定量。再以氟咯草酮進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)得到四種基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，到線性回歸方程如表2所示，分別對(duì)這些不同的基質(zhì)進(jìn)行校正。結(jié)果表明，在0.01-1.00mg/L范圍內(nèi)，氟咯草酮在馬鈴薯不同基質(zhì)中有良好的線性關(guān)系，R2均大于0.9990，符合定量分析要求。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

本方法的準(zhǔn)確度和精密度通過添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來衡量。試驗(yàn)以馬鈴薯各個(gè)基質(zhì)為空白樣品，分別進(jìn)行3個(gè)水平的添加回收試驗(yàn)，在不同的三天內(nèi)制備樣品，每個(gè)水平重復(fù)5次，具體結(jié)果如表3。結(jié)果表明，在0.01mg/kg、0.10mg/kg、1.00mg/kg的添加水平下，氟咯草酮在馬鈴薯各基質(zhì)中日內(nèi)平均回收率分別為79.1%-91.6%，80.1%-89.5% 和80.7%-90.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在0.9%-4.3%,0.9%-4.1%和1.5%-3.6%之間；日間平均回收率為78.7%-91.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.7%-4.3%之間。此結(jié)果說明本方法的準(zhǔn)確性、精密性符合我國農(nóng)藥殘留分析的要求[13]。

表2 不同基質(zhì)中氟咯草酮校正曲線的線性回歸參數(shù)Table.2 Linear regression parameters of flurochloridone orrection curves in different matrices

表3 氟咯草酮在不同基質(zhì)中的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table.3 Recovery，RSDr and RSDR values obtained for flurochloridone in different matrices

3 結(jié)論

本研究參照胡天良等[14]對(duì)氟咯草酮高效液相色譜分析，用乙腈和甲醇分別配制溶液，發(fā)現(xiàn)在用乙腈配制標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)要比甲醇配的好，響應(yīng)值高，氟咯草酮原藥在乙腈中溶解度高于甲醇。結(jié)果表明在0.01-1.00mg/L范圍內(nèi)，氟咯草酮溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線良好的線性關(guān)系，R2為0.9996。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，添加水平在0.01-1.00mg/L范圍內(nèi)，調(diào)整離子源的位置，會(huì)對(duì)靈敏度有較大影響，對(duì)離子源加以校正，可以提高機(jī)器的靈敏度，獲得較低的檢出限和檢測(cè)限。總的來說，本試驗(yàn)建立了氟咯草酮在馬鈴薯各基質(zhì)中的殘留檢測(cè)方法，結(jié)果表明，在0.01-1.00mg/L范圍內(nèi)，氟咯草酮在馬鈴薯不同基質(zhì)中有良好的線性關(guān)系，R2均大于0.9990。在0.01mg/kg、0.10mg/kg、1.00mg/kg的添加水平下，氟咯草酮在馬鈴薯各基質(zhì)中3日內(nèi)平均回收率分別為79.1%-91.6%,平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在0.9%-4.3%,0.9%-4.1%和1.5%-3.6%之間；日間平均回收率為78.7%-91.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.7%-4.3%之間，優(yōu)化了QuEChERs法在馬鈴薯田間殘留檢測(cè)的應(yīng)用，該方法準(zhǔn)確性、精密性好，符合我國農(nóng)藥殘留分析要求[13]，為氟咯草酮在青海高原田間馬鈴薯的殘留檢測(cè)分析提供了技術(shù)支持。