現(xiàn)代傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中微生物資源的挖掘與應(yīng)用

李婷婷，程江華，張煥煥，錢 坤，蘇世廣，徐雅芫

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230061；2. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031；3. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031）

0 引言

發(fā)酵大豆食品是古人智慧結(jié)晶的代表，將大豆靜置于敞開(kāi)環(huán)境中自然發(fā)酵，在這一過(guò)程中大豆完成了從原料到發(fā)酵成品的轉(zhuǎn)化，形成了各具特色的調(diào)味品，如腐乳、豆醬、醬油及豆豉等，不僅改善了風(fēng)味，而且營(yíng)養(yǎng)更易被吸收[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵手工藝得到了廣泛的傳播和良好的傳承，目前民間手工作坊仍以傳統(tǒng)發(fā)酵為主。因受到地域和環(huán)境的影響，導(dǎo)致產(chǎn)品中關(guān)鍵微生物也不完全一致，形成了各具特色的風(fēng)味。這也為發(fā)酵豆制品的現(xiàn)代化企業(yè)打造了地域品牌，增加了產(chǎn)品特色。因此，發(fā)酵豆制品中關(guān)鍵微生物的挖掘和工藝的優(yōu)化成為了研究的重點(diǎn)。

近年來(lái)，發(fā)酵豆制品年銷售量年增長(zhǎng)率超過(guò)12%[2]，說(shuō)明市場(chǎng)對(duì)發(fā)酵豆制品的需求在逐年增加，傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品受到群眾廣泛的喜愛(ài)，隨著現(xiàn)代化技術(shù)的進(jìn)步，大豆發(fā)酵過(guò)程中微生物資源的研究取得了很大的進(jìn)展，關(guān)鍵微生物的現(xiàn)代化應(yīng)用也取得了一定的成果。目前，發(fā)酵豆制品中關(guān)鍵微生物主要包括以霉菌和酵母菌為典型代表的真菌類，以枯草芽孢桿菌和乳酸菌為典型代表的細(xì)菌類[3-4]，對(duì)主要發(fā)酵豆制品中菌種資源的挖掘和發(fā)酵工藝的改良展開(kāi)論述，探討了發(fā)酵豆制品中微生物最新研究現(xiàn)狀，包括對(duì)發(fā)酵菌種選育和混菌發(fā)酵組合進(jìn)行歸納，為發(fā)酵豆制品的產(chǎn)業(yè)化水平提升提供了改進(jìn)方向。

1 腐乳

1.1 腐乳生產(chǎn)中的關(guān)鍵菌種

腐乳是一種具有抗氧化生理活性功能的發(fā)酵食品。研究發(fā)現(xiàn)，微生物的種類和數(shù)量是決定腐乳風(fēng)味及品質(zhì)主要因素[5-7]。研究人員通過(guò)傳統(tǒng)分離篩選方法與先進(jìn)的分子生物技術(shù)領(lǐng)域變性梯度凝膠電泳（DGGE）、高通量測(cè)序（HTS） 等技術(shù)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)腐乳發(fā)酵過(guò)程始終伴隨著微生物種類和數(shù)量的變化，在發(fā)酵各階段有著不同關(guān)鍵微生物。學(xué)者通過(guò)分離、篩選及鑒定等手段對(duì)腐乳菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)霉菌、酵母菌和乳酸菌等是腐乳發(fā)酵環(huán)節(jié)的關(guān)鍵菌種[8-10]。

1.1.1 霉菌

霉菌是傳統(tǒng)腐乳最重要的優(yōu)勢(shì)菌種，其種類和豐度不僅受地域影響，還受到輔料添加、生產(chǎn)過(guò)程控制等因素的干預(yù)。Gu J 等人[11]選擇5 個(gè)地區(qū)的青腐乳作為樣品進(jìn)行菌種的分離篩選，共得到微生物116 株，經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)鑒定確定為26 個(gè)種，結(jié)果表明霉菌是各地腐乳中主要的優(yōu)勢(shì)菌群，種類和豐度具有優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)的2 種自然發(fā)酵的腐乳，輔料的不同影響著腐乳中微生物的菌群結(jié)構(gòu)差異，曲霉是夾江香辣腐乳和白菜腐乳的優(yōu)勢(shì)菌群，但在夾香辣腐乳中含量更具優(yōu)勢(shì)[12]。有研究人員通過(guò)對(duì)后酵120 d 輻照3 h 并于25 ℃下貯藏60 d 的腐乳與未輻照處理的腐乳進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)前者霉菌總數(shù)減少了25%～33%，結(jié)果表明在發(fā)酵結(jié)束后一定程度的輻照處理可以減少關(guān)鍵微生物的數(shù)量，保證品質(zhì)最佳。近些年研究者紛紛對(duì)各地腐乳的優(yōu)勢(shì)菌種資源進(jìn)行挖掘，袁華偉等人[13]從宜賓腐乳中分離篩選得到生產(chǎn)效果良好的優(yōu)勢(shì)毛霉SH12 菌株，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)其生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酶性能進(jìn)行研究，將毛霉接種于豆腐坯上，在pH 值7.5，溫度為26 ℃最佳條件下培養(yǎng)48 h 時(shí)，中性蛋白酶活力達(dá)到最大。程昌澤等人[14]在貴州地區(qū)的腐乳中篩選出20 株菌株，經(jīng)過(guò)復(fù)篩最終得到一株產(chǎn)蛋白酶活性較高的優(yōu)勢(shì)雅致放射毛霉MGC317 菌株，在自然pH 值、常溫下接種于豆腐坯中培養(yǎng)48 h 時(shí)，產(chǎn)蛋白酶活力最高可達(dá)到13.82 μL，在腐乳前酵時(shí)期菌絲最長(zhǎng)可達(dá)3.1 cm，發(fā)酵性能表現(xiàn)最好。

1.1.2 酵母菌

酵母菌是傳統(tǒng)發(fā)酵腐乳中優(yōu)勢(shì)菌種之一，尤其是對(duì)腐乳的后酵風(fēng)味的形成起著至關(guān)重要的決定作用[15]，產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)主要包括2 - 苯乙醇、乙酸、乙酯類、脂肪酸和其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、奧默柯達(dá)酵母（Kodamaea ohmeri） 和魯氏酵母（Saccharomyces rouxii） 為潛在風(fēng)味關(guān)聯(lián)菌株。其中，與發(fā)酵畢赤酵母呈顯著正相關(guān)的風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量最多，為25 種。據(jù)報(bào)道，發(fā)酵畢赤酵母可生成2 - 苯乙醇，已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品的改善中。此外，當(dāng)發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母共同發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵畢赤酵母可明顯提高乙酸、乙酯類、脂肪酸和其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量。研究者為了提高風(fēng)味活性物質(zhì)含量，對(duì)酵母菌的最佳添加量進(jìn)行了研究，從自然發(fā)酵的腐乳坯上分離得到一株形狀優(yōu)良的酵母菌，通過(guò)正交試驗(yàn)和均勻試驗(yàn)得出酵母菌添加量為0.27%時(shí)腐乳發(fā)酵劑中風(fēng)味物質(zhì)活性最高[16]。

1.1.3 細(xì)菌

細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生乳酸等滋味物質(zhì)改善腐乳品質(zhì)，其中腐乳優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要包括乳酸菌、芽孢桿菌和藤黃微球菌等。許家威等人[17]對(duì)腐乳前期微生物進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，結(jié)果表明，腐乳生產(chǎn)的3 個(gè)階段（白坯階段、腌坯階段、后酵階段） 中腌坯時(shí)期的微生物數(shù)量呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，但總量仍比白坯時(shí)期高一個(gè)水平，其中乳酸菌數(shù)量在腌坯時(shí)期達(dá)到最高值9.11(lg(CFU/g))，此時(shí)總酸含量也呈現(xiàn)峰值，乳酸菌對(duì)生產(chǎn)中期腐乳品質(zhì)的形成具有重要意義。不同品種的腐乳種乳酸菌優(yōu)越性存在差異，Han B Z 等人[9]對(duì)23 個(gè)腐乳市售樣品中微生物種類及數(shù)量進(jìn)行了研究得出樣品中的乳酸菌占需氧菌總數(shù)的80%，數(shù)量級(jí)可達(dá)到106～107CFU/g，其中白腐乳中乳酸菌數(shù)量明顯高于青腐乳和紅腐乳。腌坯時(shí)期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌根據(jù)腐乳產(chǎn)地表現(xiàn)出多樣性，F(xiàn)eng Y 等人[18]采用聚合酶鏈反應(yīng)- 變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）的方法對(duì)克東腐乳的菌落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，腌坯時(shí)期藤黃微球菌、鳥(niǎo)腸球菌、糞腸球菌、肉葡萄球菌為優(yōu)勢(shì)菌群。

1.2 腐乳發(fā)酵菌種改良及工藝優(yōu)化

隨著技術(shù)的進(jìn)步，研究者對(duì)關(guān)鍵菌種進(jìn)行深入研究，發(fā)酵中菌種采用單菌或混菌組合的添加方式，在生產(chǎn)中高新技術(shù)的應(yīng)用也為發(fā)酵工藝提供一臂之力。挖掘優(yōu)勢(shì)菌種的最大潛力并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，以提高發(fā)酵效率、改善產(chǎn)品品質(zhì)及縮短生產(chǎn)周期。

1.2.1 菌種定向選育

劉芳等人[19]對(duì)腐乳中產(chǎn)蛋白酶的毛霉進(jìn)行紫外誘變得到酶活高、耐熱性好的誘變菌株SCLG——毛霉16，經(jīng)單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株在32 ℃下能正常生長(zhǎng)，蛋白酶活力較出發(fā)菌株高出51.4%，釀制的腐乳時(shí)間縮短，經(jīng)感官評(píng)定，腐乳品質(zhì)明顯提高。研究人員對(duì)克東腐乳后酵時(shí)期高產(chǎn)蛋白酶的藤黃微球菌進(jìn)行紫外誘變處理得到突變菌株T4，其產(chǎn)蛋白酶活力是出發(fā)菌株的1.54 倍。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了突變菌株的最佳發(fā)酵條件為接種量6%，pH 值7.5，35 ℃下靜置培養(yǎng)36 h，在此工藝下縮短克東腐乳發(fā)酵周期，減低生產(chǎn)投入成本[20]。

1.2.2 混菌改良發(fā)酵

研究人員通過(guò)不同方法摸索混菌發(fā)酵最佳組合及組合比例，以達(dá)到優(yōu)化產(chǎn)品的目的。張斌等人[21]采用正交試驗(yàn)對(duì)浙江地區(qū)腐乳中優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行分離純化，篩選出2 株霉菌分別為2 #魯氏毛霉和1 #米根霉，并按7∶3 比例混合，在28 ℃下發(fā)酵72 h，可有效改善腐乳品質(zhì)。羅曉妙等人[16]通過(guò)均勻試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探索腐乳接菌量，結(jié)果表明在含水量為51%的麩皮、米粉和豆粉的混合物中接入2.45%霉菌、0.27%的乳酸菌和0.27%酵母菌混合菌液，25 ℃下培養(yǎng)5 d 的發(fā)酵劑可得到高品質(zhì)腐乳。李順等人[22]應(yīng)用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法探索總狀毛霉（Mucorracemosus） 和米根霉（Rhizopusoryzae） 雙菌按1∶1 混合在28 ℃下發(fā)酵56 h，其產(chǎn)生的蛋白酶和糖化酶活力分別為50.5 U/mL 和15.2 U/mL，比單菌最優(yōu)條件下含量高10.1%～52.1%。

2 豆醬

2.1 豆醬生產(chǎn)中的關(guān)鍵菌種

制曲和發(fā)酵是豆醬生產(chǎn)發(fā)酵的2 個(gè)階段。微生物在制曲階段產(chǎn)生的酶活大小直接影響豆醬的發(fā)酵周期，在這發(fā)酵階段產(chǎn)生的酯類是構(gòu)成豆醬香氣的主要成分。2 個(gè)環(huán)節(jié)缺一不可，發(fā)揮的作用不同，關(guān)鍵菌種也不同，研究表明制曲階段以霉菌和芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)菌種，乳酸菌主要是后酵時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌種。

2.1.1 霉菌

霉菌是豆醬制曲階段的優(yōu)勢(shì)真菌，Kim D Y 等人[23-24]利用DGGE 測(cè)序方法對(duì)韓國(guó)市售的5 份傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中微生物多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中主要微生物為青霉屬和毛霉屬。安飛宇等人[25]利用MiSeq 測(cè)序方法得到制曲階段中優(yōu)勢(shì)菌為毛霉菌（Mucor）。張鵬飛等人[26]對(duì)制曲的醬醅和發(fā)酵成熟的豆醬成品中微生物關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明產(chǎn)品的2 個(gè)階段中優(yōu)勢(shì)微生物基本相同，以毛霉菌和青霉菌為代表的優(yōu)勢(shì)真菌。Jung J Y 等人[27]利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)制曲中微生物多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示豆醬制曲中毛霉菌屬（Mucor）、青霉菌屬（Penicillium） 為主要優(yōu)勢(shì)真菌屬。

2.1.2 芽孢桿菌

芽孢桿菌為制曲階段優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，Jung J Y 等人[27]利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)制曲中微生物多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明豆醬制曲中芽孢桿菌屬是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者對(duì)制曲中微生物多樣性進(jìn)行研究，姜靜等人采用Miseq 測(cè)序法研究制曲階段關(guān)鍵微生物，結(jié)果表明優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌屬以乳桿菌屬（Lactobacillus）為主。張鵬飛等人[26]對(duì)制曲的醬醅和發(fā)酵成熟的豆醬成品中微生物關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明產(chǎn)品的制曲和發(fā)酵階段中優(yōu)勢(shì)微生物基本相同，芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。

2.1.3 乳酸菌

乳酸菌是豆醬生產(chǎn)中的優(yōu)勢(shì)微生物，主要包括魏斯氏菌、嗜鹽四聯(lián)球菌及植物乳桿菌等，豆醬發(fā)酵全過(guò)程乳酸菌都發(fā)揮優(yōu)越性作用，不同地域的豆醬中乳酸菌種類存在差異。陳浩等人[28]對(duì)南京地區(qū)2 份傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬不同階段的優(yōu)勢(shì)原核微生物進(jìn)行篩選，研究表明優(yōu)勢(shì)菌種是乳酸菌中的魏斯氏菌（Weissella cibaria，Weissella confusa，Weissella paramesenteroides） 和嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）。對(duì)河北地區(qū)傳統(tǒng)豆醬后酵時(shí)期優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行篩選，經(jīng)16S rDNA 鑒定菌株xj008 為植物乳桿菌[29]。不同生產(chǎn)方式的豆醬中乳酸菌含量存在差異，乳酸菌主要通過(guò)產(chǎn)生乳酸提升腐乳品質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵豆醬中乳酸含量高于商品豆醬，感官評(píng)定中自然發(fā)酵豆醬的香味和滋味相比較商品豆醬都更勝一籌[30]。

2.2 豆醬發(fā)酵菌種改良及工藝優(yōu)化

2.2.1 菌種定向選育

研究者利用紫外誘變和化學(xué)誘變技術(shù)對(duì)菌種進(jìn)行定向選育，王海曼等人[31]以東北豆醬中一株高產(chǎn)纖溶酶芽孢桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)亞硝基胍化學(xué)誘變得到突變菌株HDBF-DJ3N7，其纖溶酶活力為368.78 IU/mL，是出發(fā)菌株的2.1 倍。米曲霉是豆醬生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用、發(fā)酵性能優(yōu)良的工業(yè)發(fā)酵菌種，琥珀酸是米曲霉主要代謝產(chǎn)物也是人體所需的必要化合物。于江[32]利用紫外誘變選育一株產(chǎn)琥珀酸米曲霉菌株ASQ-1，在高鹽稀態(tài)條件下發(fā)酵90 d，應(yīng)用ASQ-1 接種的豆醬中琥珀酸含量比米曲霉AS3.042原始菌種接種的豆醬高出6.5 倍。

2.2.2 混菌改良發(fā)酵

隨著科技的進(jìn)步，各類生物組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用逐步揭示了豆醬中微生物相互作用及作用機(jī)理，結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)為工業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)依據(jù)?，F(xiàn)階段，工業(yè)化生產(chǎn)中逐步利用混合菌種制曲發(fā)酵。古小露[33]通過(guò)3 種發(fā)酵方式（單菌種發(fā)酵、分開(kāi)制曲復(fù)合發(fā)酵和混合菌種發(fā)酵） 通過(guò)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)米曲霉3.042、黑曲霉AS3.35、枯草芽孢桿菌3 種菌株分開(kāi)制曲，再按1∶2∶1 比例進(jìn)行混合發(fā)酵，蛋白酶活力、總酯、氨基酸態(tài)氮含量最高，且感官評(píng)價(jià)分值接近市售豆醬。

3 醬油

3.1 醬油生產(chǎn)中的關(guān)鍵菌種

自1990 年起，隨著科技的不斷進(jìn)步，研究者采用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)醬油釀造中關(guān)鍵微生物進(jìn)行深入挖掘[34]。微生物在醬油釀造的制曲和醬醪發(fā)酵工藝環(huán)節(jié)中發(fā)揮著不同的作用，霉菌在制曲階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，乳酸菌在醬油釀造全過(guò)程均發(fā)揮著重要作用，芽孢桿菌在醬醪發(fā)酵及風(fēng)味形成時(shí)期發(fā)揮著重要作用[35-36]。

3.1.1 霉菌

霉菌在醬油制曲階段發(fā)揮主要作用，霉菌數(shù)量受到醬油含鹽量的影響。Zhang L 等人[37]利用PLFA法對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵醬油的不同狀態(tài)（高鹽稀態(tài)和低鹽液態(tài)） 下醬醪過(guò)程中優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行研究，結(jié)果表明發(fā)酵全過(guò)程中，高鹽稀態(tài)醬醪的霉菌數(shù)量高于低鹽液態(tài)，于發(fā)酵60 d 達(dá)到峰值。釀造過(guò)程中霉菌種類豐富且功能不同，趙謀明等人[38]在醬醪中分離篩選得到18 株霉菌，經(jīng)18S rDNA 鑒定后，曲霉屬主要包括黑曲霉、米曲霉和紅綬曲霉。對(duì)霉菌進(jìn)行霉系分析發(fā)現(xiàn)，黑曲霉的β - 葡萄糖苷酶含量最高，米曲霉和紅綬曲霉的中性蛋白酶活力突出，為優(yōu)質(zhì)霉菌的篩選提供理論依據(jù)。

3.1.2 乳酸菌

乳酸菌對(duì)醬油的風(fēng)味形成至關(guān)重要，在醬油釀造各階段都表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。Wei Y 等人[39]采集了中國(guó)和日本醬油，對(duì)其發(fā)酵過(guò)程中微生物的群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明醬油制曲階段優(yōu)勢(shì)菌群是乳酸菌，醬醪階段優(yōu)勢(shì)菌群仍是乳酸菌，但數(shù)量不足制曲階段的1/3。Tanasupawat S 等人[40]對(duì)泰國(guó)醬油醬醪階段中微生物種類和數(shù)量進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌種為乳酸菌中的Lactobacillus acidipisis 和Tetragenococcus halophilus。許延濤等人[41]采用高通量測(cè)序?qū)︶u油釀造過(guò)程中風(fēng)味細(xì)菌與風(fēng)味物質(zhì)生成進(jìn)行研究，醬油形成的有機(jī)酸依靠乳酸菌作用使得醬油口感更加綿延絲滑。

3.1.3 芽孢桿菌

芽孢桿菌影響著醬油的滋味形成，吳博華等人[42]對(duì)傳統(tǒng)釀造醬油中篩選出產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶的3 株芽孢桿菌分別為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），3 株菌產(chǎn)吡嗪類風(fēng)味物質(zhì)具有優(yōu)勢(shì)，給后續(xù)醬油中風(fēng)味因子的研究提供依據(jù)。許延濤等人[41]采用高通量測(cè)序?qū)︶u油釀造過(guò)程中風(fēng)味細(xì)菌與風(fēng)味物質(zhì)生成進(jìn)行研究，保障了醬油的醇香風(fēng)味，研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和葡萄球菌具有一定代謝L - 谷氨酰胺酶的能力，醬油品質(zhì)不僅依賴米曲霉，還離不開(kāi)滋味因子的關(guān)鍵菌保障了醬油的品質(zhì)。

3.2 醬油發(fā)酵菌種改良及工藝優(yōu)化

3.2.1 菌種定向選育

吳博華等人[42]對(duì)工業(yè)使用的米曲霉3.042 經(jīng)過(guò)連續(xù)復(fù)合誘變得到一株高產(chǎn)蛋白酶的突變菌株UCD4，蛋白酶含量較出發(fā)菌株提高了2 倍。張偉等人[43]通過(guò)在醬醪中添加適宜的高水平鹽含量來(lái)定向選育高耐鹽乳酸菌，利用其產(chǎn)乳酸特性降低醬醪pH 值達(dá)到改善品質(zhì)的目的，在醬油醬醪中分別添加耐鹽乳酸菌突變體，醬醪的乳酸含量相比對(duì)照組增加了57.7%，風(fēng)味物質(zhì)相比對(duì)照組增加4 種，有機(jī)酸的峰面積比對(duì)照組增加了82.9%，結(jié)果表明高耐鹽乳酸菌對(duì)高鹽稀態(tài)醬油的風(fēng)味和滋味有明顯改善作用。張夢(mèng)寒等人[44]對(duì)解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行化學(xué)誘變、等離子誘變及定向馴化方法得到多個(gè)可高效利用精氨酸的突變菌株，結(jié)果顯示紫外誘變的突變體菌株C12 利用精氨酸能力較出發(fā)菌株提高了18%。

3.2.2 混菌改良發(fā)酵

盛明健等人[45]發(fā)現(xiàn)米曲霉2174 和2339 菌之間無(wú)拮抗作用，將兩菌等比例混合制曲以達(dá)到優(yōu)化制曲工藝的目的，獲得的種曲酶活力相較于單菌純種發(fā)酵均衡，初步應(yīng)用于醬油的低鹽固態(tài)生產(chǎn)并取得了良好的成效。鐘方權(quán)等人[46]通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)醬油中篩選出的優(yōu)勢(shì)乳酸菌和米曲霉混合制曲的最佳工藝進(jìn)行研究，結(jié)果顯示雙菌按2∶5 的比例混合置于33.5 ℃條件下發(fā)酵40 h 生產(chǎn)的醬油酶活性最高。研究人員先以米曲霉、黑曲霉菌種混合制坯，輔以乳酸菌和酵母菌等進(jìn)行發(fā)酵，在不同發(fā)酵時(shí)期依次添加混合菌種的創(chuàng)新方式，大大改善了釀造醬油風(fēng)味。米曲霉和黑曲霉以3∶1 最佳比例制曲后，發(fā)酵時(shí)7 d 添加乳酸菌，10 d 添加球擬酵母，20 d添加4 號(hào)魯氏酵母的為最佳菌株組合和最佳添加時(shí)間，發(fā)酵40 d 醬油的品質(zhì)高，風(fēng)味和色澤得到提升，特征香味物質(zhì)豐富[47-48]。

4 豆豉

4.1 豆豉生產(chǎn)中的關(guān)鍵菌種

研究人員采用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)臘豆發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵微生物進(jìn)行深度挖掘。臘豆發(fā)酵工藝環(huán)節(jié)包括制曲和后酵，其中制曲又包含前期、中期和后期，酵母菌在制曲初期為優(yōu)勢(shì)菌種，霉菌在制曲中后期發(fā)揮關(guān)鍵作用，細(xì)菌在后酵期成為優(yōu)勢(shì)菌種。

4.1.1 霉菌

霉菌是臘豆制曲的中后期的優(yōu)勢(shì)菌種，以根霉、曲霉和毛霉為主。陳麗艷等人[49]對(duì)臘豆的4 個(gè)發(fā)酵時(shí)期的優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示霉菌在制曲中期及后期快速增長(zhǎng)并抑制了酵母菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)成為此階段的優(yōu)勢(shì)菌種，后酵期霉菌受到細(xì)菌抑制，在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中霉菌呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)。石聰?shù)热薣50]采用454 高通量焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)瀏陽(yáng)傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉的微生物多樣性進(jìn)行動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，在后15 d 真菌顯著增加，制曲中關(guān)鍵微生物為根霉和曲霉。樊敏等人[51]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)- 變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE） 技術(shù)對(duì)貴州地區(qū)4 種豆豉樣本進(jìn)行發(fā)酵微生物的篩選，結(jié)果顯示霉菌屬曲霉菌（Aspergillus） A1bC-4 和沙門柏干酪青霉（Penicillium camemberti） 為優(yōu)勢(shì)真菌。倪慧等人[52]采用MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)苗族自治州的傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中關(guān)鍵真菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉優(yōu)勢(shì)微生物多樣性較高，曲霉（Asperhillus） 和米根霉（Rhizopus） 是主酵微生物。李薇等人[53]對(duì)永川毛霉型豆豉傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵微生物進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的分析及動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律總結(jié)，結(jié)果顯示在制曲階段，以毛霉屬、曲霉屬為主的真菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

4.1.2 酵母菌

酵母菌在制曲初期占發(fā)酵優(yōu)勢(shì)，陳麗艷等人[49]對(duì)臘豆的4 個(gè)發(fā)酵時(shí)期的優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示制曲初期以酵母菌為優(yōu)勢(shì)菌種，制曲中后期細(xì)菌處于劣勢(shì)，后酵期酵母菌再度成為優(yōu)勢(shì)菌種并對(duì)豆豉的風(fēng)味物質(zhì)形成起到關(guān)鍵作用。酵母菌通過(guò)提高風(fēng)味物質(zhì)含量改善產(chǎn)品品質(zhì)，萬(wàn)明等人[54]利用TCC培養(yǎng)基對(duì)豆豉微生物進(jìn)行分離篩選后的一株高產(chǎn)酒精的菌株，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后，確定該菌株為釀酒酵母，提高風(fēng)味物質(zhì)羥基丙酮、丙醇和琥珀酸等含量，這對(duì)于豆豉獨(dú)特風(fēng)味的形成具有非常重要的貢獻(xiàn)。

4.1.3 細(xì)菌

豆豉后酵時(shí)期細(xì)菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，石聰?shù)热薣50]采用454 高通量焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)瀏陽(yáng)傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉的微生物多樣性進(jìn)行動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)酵全過(guò)程中芽孢桿菌屬的含量和種類均處于高水平。樊敏等人[51]采用PCR-DGGE 技術(shù)對(duì)貴州地區(qū)4 種豆豉樣本進(jìn)行發(fā)酵微生物的篩選，結(jié)果顯示芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，以地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌為主。李薇等人[53]對(duì)永川毛霉型豆豉傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵微生物進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的分析及動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律總結(jié)，結(jié)果顯示產(chǎn)品生產(chǎn)全過(guò)程細(xì)菌多樣性高于真菌，制曲階段細(xì)菌含量較少，但在后酵階段產(chǎn)品中微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，芽孢桿菌屬、乳球?qū)?、葡萄球菌屬等?xì)菌在這一階段有較為穩(wěn)定的豐度，細(xì)菌總數(shù)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。細(xì)菌產(chǎn)生的物質(zhì)是風(fēng)味物質(zhì)的組成成分，后酵階段是風(fēng)味物質(zhì)形成的重要時(shí)期。

4.2 豆豉發(fā)酵菌種改良及工藝優(yōu)化

目前，臘豆發(fā)酵多為傳統(tǒng)發(fā)酵，主要以家庭式生產(chǎn)為主，工業(yè)化程度低，近年來(lái)有較多學(xué)者致力于改良菌種發(fā)酵工藝，包括菌種優(yōu)化和混菌組合發(fā)酵等，以期提高豆豉風(fēng)味和品質(zhì)，并推廣致力于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。

4.2.1 菌種定向選育

劉敏等人[55]通過(guò)在臘豆制曲階段分別添加總狀毛霉和米曲霉滬釀3.042 發(fā)酵對(duì)生物胺含量變化的研究，結(jié)果顯示曲霉和毛霉組的產(chǎn)品在發(fā)酵后期生物胺含量分別增加3.40，3.05 倍。卞承蔭等人[56]對(duì)豆豉中產(chǎn)溶栓酶的蠟狀芽孢桿菌LD-8547 為出發(fā)菌種，通過(guò)紫外線和甲基磺酸乙酯的雙重誘變復(fù)篩后，最終得到一株發(fā)酵性能優(yōu)良且傳代穩(wěn)定的高產(chǎn)枯草芽孢桿菌，經(jīng)純化5 代后，發(fā)現(xiàn)酶活力能夠保持相對(duì)穩(wěn)定的水平，維持在16 351 U/mL。

4.2.2 混菌改良發(fā)酵

孫成行等人[57]分別對(duì)枯草芽孢桿菌和曲霉菌純種制曲工藝進(jìn)行優(yōu)化，前者在制曲階段接種量為1%，置于37 ℃下發(fā)酵50 h，后者接種量為4%，置于35 ℃下發(fā)酵48 h，根據(jù)前期純種制曲條件選定混菌制曲發(fā)酵正交試驗(yàn)取值范圍，試驗(yàn)結(jié)果顯示，制曲最佳條件為兩菌按1∶4 的比例混勻置于36 ℃下發(fā)酵50 h。高澤鑫等人[58]利用正交試驗(yàn)法對(duì)枯草芽孢桿菌BN-05 和毛霉菌MS-7 雙菌混合發(fā)酵進(jìn)行工藝優(yōu)化，結(jié)果顯示二者按2∶1 制得混合發(fā)酵液，接種量為6%置于30 ℃下發(fā)酵20 h 為最佳發(fā)酵條件，降低了豆豉產(chǎn)品中氨臭味，改善了豆豉風(fēng)味。龐超[59]通過(guò)利用Design Expert 8.06 軟件對(duì)枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和清酒乳酸桿菌混合比例進(jìn)行研究，結(jié)果表明，三者按照0.533∶0.367∶0.100 的比例配制凍干粉應(yīng)用于臘豆發(fā)酵可達(dá)到最佳品質(zhì)，說(shuō)明臘豆發(fā)酵過(guò)程中枯草芽孢桿菌在品質(zhì)提升中占主導(dǎo)作用。

5 結(jié)語(yǔ)

20 世紀(jì)90 年代以來(lái)，人們對(duì)加工大豆?fàn)I養(yǎng)成分的認(rèn)識(shí)逐漸深入，優(yōu)異的大豆加工工藝方式不僅大大減輕了大豆自身的酸苦氣味，還降低了各種抗藥性、抗?fàn)I養(yǎng)因子。發(fā)酵豆制品受到廣泛喜愛(ài)，其研發(fā)生產(chǎn)及加工過(guò)程引起研究人員的重視，致力于解決產(chǎn)品品質(zhì)不優(yōu)良、產(chǎn)品的安全無(wú)保障和生產(chǎn)工藝周期漫長(zhǎng)、缺乏統(tǒng)一的食品生產(chǎn)流程和產(chǎn)品配方。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)積極展開(kāi)對(duì)發(fā)酵豆制品工業(yè)化生產(chǎn)的相關(guān)研究，就目前的研究工作現(xiàn)狀情況來(lái)看分析，生產(chǎn)一種高品質(zhì)的加工發(fā)酵豆制品建議從以下幾個(gè)方面進(jìn)行入手。

5.1 菌種定向選育

研究者從傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中通過(guò)紫外誘變技術(shù)、化學(xué)誘變技術(shù)、耐鹽耐高溫等物理?xiàng)l件改良菌種，摸索菌種最佳發(fā)酵條件，發(fā)揮其功能特性最大化，以提高產(chǎn)品品質(zhì)，從而能夠保護(hù)地方產(chǎn)品特色優(yōu)勢(shì)，改善發(fā)酵工藝、提高生產(chǎn)效率、節(jié)約成本投入及提高產(chǎn)品品質(zhì)等。

5.2 優(yōu)化菌種組合

傳統(tǒng)發(fā)酵的食品主要是一系列自然微生物的共同作用下歷經(jīng)漫長(zhǎng)的時(shí)間發(fā)酵而形成，發(fā)酵環(huán)境不可控，給生產(chǎn)帶來(lái)局限性。因此，除了對(duì)菌種改良優(yōu)化外，還應(yīng)該探索混合菌種組合發(fā)酵。分離出高質(zhì)量菌種，并進(jìn)行組合優(yōu)化，組合菌種共同作用于豆制品中發(fā)揮最大的作用，提高發(fā)酵豆制品所需生物量含量，使發(fā)酵過(guò)程提前完成，縮短生產(chǎn)周期。添加混合菌種的最佳組合比例和菌種的添加量一直是問(wèn)題研究的一個(gè)重點(diǎn)。

5.3 嚴(yán)控雜菌污染

發(fā)酵豆制品的品質(zhì)主要取決于優(yōu)勢(shì)菌種的有效作用，發(fā)酵食品也最易受到雜菌污染導(dǎo)致產(chǎn)品敗壞。一方面，控制食鹽的添加量，食鹽過(guò)量會(huì)減少雜菌污染但不利于產(chǎn)品風(fēng)味和消費(fèi)者飲食健康。研究人員認(rèn)為需要在有效減少自制發(fā)酵豆制品污染風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)，也要能滿足人們對(duì)低油低鹽均衡膳食的健康追求，不斷尋求一個(gè)綜合平衡點(diǎn)的方法；另一方面，嚴(yán)格控制污染源，污染源主要來(lái)源于生產(chǎn)者手部、發(fā)酵器皿、生產(chǎn)設(shè)備、車間環(huán)境、輔味配料等，需要從多方面制定系統(tǒng)的操作規(guī)范，嚴(yán)格控制雜菌的污染，有效防范降低損失。

5.4 制定工藝標(biāo)準(zhǔn)

發(fā)酵豆制品品質(zhì)不僅取決于微生物的作用，同時(shí)發(fā)酵過(guò)程的加工工藝也極其重要。傳統(tǒng)生產(chǎn)方式都是祖祖輩輩傳授，各家各戶的生產(chǎn)工藝都不完全相同。發(fā)酵豆制品的品質(zhì)與當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境、生產(chǎn)制作的手藝和制作時(shí)間都息息相關(guān)。不同地域的人們往往訂制更適宜地區(qū)口味喜好的生產(chǎn)工藝，增加了發(fā)酵、釀造的復(fù)雜性和安全性。為了有效保證發(fā)酵豆制品的品質(zhì)穩(wěn)定性和安全性，逐步完善發(fā)酵原材料選購(gòu)、技術(shù)人員上崗培訓(xùn)，舉辦產(chǎn)業(yè)交流、制定產(chǎn)品成分指標(biāo)、規(guī)范生產(chǎn)環(huán)境和設(shè)施，完善并落實(shí)健全的生產(chǎn)體系，為發(fā)酵豆制品工業(yè)和千家萬(wàn)戶居民提供一套可嚴(yán)格參照的生產(chǎn)工藝標(biāo)準(zhǔn)。