間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體促進(jìn)軸突再生和突觸重塑的研究進(jìn)展

王倩 綜述 余昌胤 審校

遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563000

神經(jīng)突觸參與了大腦信息的處理及傳輸，是神經(jīng)元細(xì)胞之間交換信息的重要紐帶。大腦中神經(jīng)元突觸損害可引發(fā)認(rèn)知功能障礙等一系列神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)MSCs外泌體由于其自身的性質(zhì)和特點(diǎn)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)細(xì)胞軸突再生和突觸重塑中發(fā)揮重要作用。

1 外泌體的概念

外泌體初次在成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是細(xì)胞向外界排放廢物的載體。后續(xù)研究鑒定出外泌體中含有mRNA、miRNA、DNA、蛋白質(zhì)和信號(hào)復(fù)合物等物質(zhì)，并證實(shí)外泌體可被靶細(xì)胞攝取傳遞細(xì)胞信息并產(chǎn)生一系列生物學(xué)活性[1]。

1.1 外泌體的起源、結(jié)構(gòu) 外泌體來(lái)源于晚期胞內(nèi)體，是胞外囊泡的一種類(lèi)型。作為囊泡運(yùn)輸?shù)妮d體，外泌體的形成主要經(jīng)歷3個(gè)過(guò)程：首先形成早期內(nèi)涵體(early endosome)，隨后以?xún)?nèi)生芽的方式形成囊泡小體(multivesicular bodies，MVBs)，最后部分MVBs與細(xì)胞膜融合釋放到胞外，形成大小均一的囊泡，即外泌體[2]。電鏡下，外泌體大小30～100 nm，呈雙凹圓盤(pán)狀或杯口狀，并能在細(xì)胞間相互運(yùn)輸，介導(dǎo)相鄰細(xì)胞或全身范圍內(nèi)細(xì)胞之間的信息交換[3]。體內(nèi)多數(shù)細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞均能分泌外泌體，且普遍存在于腦脊液、尿液、乳汁和血液等多種體液中。

1.2 外泌體的分子組成與生物功能 外泌體內(nèi)富含多種類(lèi)型蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，如蛋白膜轉(zhuǎn)運(yùn)、融合蛋白、跨膜蛋白、熱休克蛋白以及脂質(zhì)蛋白等。其外層為脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)，富含多種脂類(lèi)，可以保護(hù)其內(nèi)含物不被降解，從而維持外泌體的形態(tài)。外泌體還攜帶多種RNA，通過(guò)與細(xì)胞受體結(jié)合或與質(zhì)膜融合的方式作用于靶細(xì)胞并發(fā)揮其功能。STATELLO等[4]研究證實(shí)，外泌體RNA可以在受體細(xì)胞和調(diào)節(jié)基因中表達(dá)，從而發(fā)揮一定的生物效應(yīng)。

1.3 外泌體可通過(guò)血腦屏障 中樞神經(jīng)血管單元(neurovascular unit，NVU)由細(xì)胞外基質(zhì)、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元組成，維持血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的功能。外泌體在NVU細(xì)胞間起著關(guān)鍵作用，以影響神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)血管生成和少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生，調(diào)節(jié)NVU中的細(xì)胞通信。外泌體能夠通過(guò)BBB從中樞神經(jīng)系統(tǒng)到外周或外周到中樞神經(jīng)系統(tǒng)并調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)有兩種可能機(jī)制：被內(nèi)皮細(xì)胞攝取，通過(guò)細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)最后轉(zhuǎn)移到大腦內(nèi)的受體細(xì)胞；或跨越內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞間連接，直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。LIU等[6]證實(shí)外泌體可將腦脊液中的miR-135a通過(guò)血腦屏障傳遞至外周血，在循環(huán)血液中發(fā)揮生物學(xué)作用。在大鼠脊髓損傷模型中，研究發(fā)現(xiàn)BMSCs外泌體也可以影響中樞系統(tǒng)周細(xì)胞的NFκB通路活性，減少VEGF分泌，從而穩(wěn)定血腦屏障，減輕神經(jīng)功能損害，改善預(yù)后[7]。

1.4 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)源性外泌體 MSCs是一群具有自我更新、多向分化和免疫調(diào)節(jié)功能的成體干細(xì)胞群。由于其來(lái)源廣、再生能力強(qiáng)、多向分化能力及免疫抑制性，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于多種疾病。目前，人們普遍傾向于間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)旁分泌發(fā)揮其主要作用，可通過(guò)吞噬、胞膜融合、受體接觸等方式將內(nèi)容物釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)?？稍谠S多實(shí)驗(yàn)中觀察到MSCs的旁分泌作用[8]。

MSCs源性外泌體是攜帶和傳遞分子到靶向細(xì)胞的理想載體，包括治療基因、藥物、酶或RNA[9]。同其他細(xì)胞類(lèi)型的外泌體，MSCs源性外泌體也可運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)和miRNA，參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)及周期調(diào)控。相比，MSCs具有更為廣泛的組織分化能力，可分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等；其來(lái)源廣泛，可以從骨髓、脂肪組織、牙髓及妊娠組織(胎盤(pán)、羊水、臍帶膠質(zhì)、臍血、絨毛膜)等獲??；因其缺乏HLA-DR的表達(dá)，其免疫原性明顯低于其他細(xì)胞類(lèi)型；且MSCs源性外泌體可通過(guò)血腦屏障，參與生物活性分子的傳遞。目前研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌外泌體能力最強(qiáng)，并且可通過(guò)Fas/Fap-1/Cav-1復(fù)合物來(lái)調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的分泌，加速傷口創(chuàng)面愈合[10]。還可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞參與從而發(fā)揮其免疫作用，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)，以維持組織穩(wěn)態(tài)和平衡。

此外，MSCs外泌體的治療效果已在多種疾病中得到證實(shí)。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，研究證明MSCs在體外特定條件誘導(dǎo)下或機(jī)體受損后可以分化為雪旺氏樣細(xì)胞，與其他細(xì)胞來(lái)源外泌體相比，MSCs源性外泌體更能介導(dǎo)受損神經(jīng)元組織的修復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞間的信息傳遞和抗原呈遞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答[11-12]。在一項(xiàng)缺血模型研究中，骨髓來(lái)源MSCs的外泌體通過(guò)抑制促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)蛋白、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-1β的表達(dá)，增強(qiáng)抗凋亡蛋白的表達(dá)，改善神經(jīng)行為表現(xiàn)，并通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化而表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用[13]。RUPPERT等[14]還報(bào)道了MSCs源性外泌體可以減輕脊髓組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥并改善功能恢復(fù)。這些結(jié)果表明，MSCs源性外泌體可以改善神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀。

2 MSCs外泌體介導(dǎo)軸突再生與突觸重塑

神經(jīng)元不可再生，神經(jīng)突起(包括軸突和樹(shù)突)再生是神經(jīng)系統(tǒng)損傷后功能恢復(fù)的主要方式。神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞之間互相作用，協(xié)調(diào)軸突和髓鞘形成。神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞釋放的外泌體參與了這些過(guò)程，分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以維持受損的神經(jīng)元存活并促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物刺激靶細(xì)胞進(jìn)行研究，包括骨和軟骨再生、神經(jīng)疾病、肝臟損傷、急性腎臟損傷和心血管疾病等都證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞所分泌的分子既可以直接激活靶細(xì)胞又能刺激臨近細(xì)胞分泌活性因子，并且在動(dòng)物疾病模型中發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)、神經(jīng)元再生、神經(jīng)元形成、突觸可塑性等重要作用。此外，研究證實(shí)外泌體除含有遺傳物質(zhì)、多種蛋白質(zhì)外，還含有對(duì)軸突生長(zhǎng)有著關(guān)鍵性作用的肌動(dòng)蛋白、微管蛋白細(xì)胞等骨架蛋白[15]。

CHIVET等[16]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時(shí)，突觸離子型谷氨酸受體亞型N-甲基-D-天冬氨酸受體被激活，神經(jīng)細(xì)胞釋放的外泌體含有Synaptotagmin蛋白，作用于其他神經(jīng)元后可以調(diào)節(jié)軸突生長(zhǎng)的逆行信號(hào)，且這些囊泡體優(yōu)先在突觸前部位結(jié)合，證實(shí)外泌體參與突觸功能的調(diào)節(jié)。此外，經(jīng)視黃酸受體β2(RARβ)激動(dòng)劑處理的神經(jīng)元外泌體對(duì)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞失活PTEN信號(hào)具有雙重作用，導(dǎo)致突觸生長(zhǎng)增強(qiáng)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖[17]。TANG等[18]研究證明外泌體可以通過(guò)PTEN-mTOR通路增強(qiáng)損傷神經(jīng)元軸突再生。從寡糖樹(shù)狀細(xì)胞瘤中提取的攜帶髓鞘相關(guān)蛋白的外泌體，有助于髓鞘化和維持神經(jīng)元的完整性[19]。因此，神經(jīng)元外泌體通過(guò)神經(jīng)元之間的突觸轉(zhuǎn)運(yùn)及與細(xì)胞之間的聯(lián)系，介導(dǎo)突觸和軸突的可塑性。

2.1 MSCs外泌體與卒中后神經(jīng)細(xì)胞突觸重塑 腦卒中是影響人類(lèi)健康的重大疾病，外泌體在其病理生理過(guò)程中傳遞細(xì)胞物質(zhì)，調(diào)節(jié)卒中后細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的髓鞘蛋白與髓鞘的正常形態(tài)和功能密切相關(guān)。因此，腦損傷后少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化成熟以及軸突的生長(zhǎng)對(duì)神經(jīng)功能的修復(fù)起著重要作用。研究證實(shí)外泌體可以促進(jìn)軸突再生以及少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化，并促進(jìn)軸突的髓鞘形成，改善腦損傷后的神經(jīng)功能。在大鼠模型中，富含miR-219的外泌體刺激少突膠質(zhì)細(xì)胞前體分化成髓鞘細(xì)胞，并促進(jìn)髓鞘在CNS中的形成[20]。研究證實(shí)腦卒中時(shí)將顯著下調(diào)腦中miR-133b，通過(guò)使用過(guò)表達(dá)miR-133b的MSCs外泌體，可以促進(jìn)短暫性腦缺血模型小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞外泌體的二次釋放，顯著增加大腦動(dòng)脈閉塞小鼠大腦神經(jīng)突分支數(shù)量和神經(jīng)元的長(zhǎng)度[21]。ZHANG等[22]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)，可能與miRNA-17-92有關(guān)：他們轉(zhuǎn)染miRNA-17-92至MSC后發(fā)現(xiàn)，外泌體中高表達(dá)的miRNA-17-92可進(jìn)一步促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。

同樣，也有研究報(bào)道m(xù)iRNA-17-92可靶向作用于信號(hào)通路蛋白AKT、mTOR、GSK-3β，促進(jìn)其磷酸化，激活相應(yīng)的信號(hào)通路，促進(jìn)軸突重建。CHEN等[23]研究結(jié)果顯示，脂肪MSCs外泌體內(nèi)含有的神經(jīng)因子能促進(jìn)受損神經(jīng)元軸突再生。這些研究表明，MSCs外泌體通過(guò)神經(jīng)元之間的突觸轉(zhuǎn)移和與星形膠質(zhì)細(xì)胞的通信來(lái)介導(dǎo)腦卒中神經(jīng)細(xì)胞軸突和突觸重塑。

2.2 MSCs源性外泌體與阿爾茲海默病神經(jīng)細(xì)胞突觸重塑 阿爾茨海默病(AD)是一種高致殘率和普遍流行的神經(jīng)退行性疾病。其病理特征主要是β淀粉樣蛋白(amyloidβ，Aβ)形成淀粉樣斑塊和tau蛋白高度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)。淀粉樣β肽的可溶性寡聚體(AβOs)被認(rèn)為是參與早期神經(jīng)元氧化應(yīng)激和突觸損傷的神經(jīng)毒素，最終導(dǎo)致AD的神經(jīng)變性和記憶障礙。MARIANA等[24]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MSCs及其外泌體能夠保護(hù)神經(jīng)元免受AβOs引起的氧化應(yīng)激和突觸損傷，從而保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)元和突觸，減少腦內(nèi)Aβ斑塊沉積和水平。ZHAO等[25]研究表明，通過(guò)MSC傳遞外源蛋白可以調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞功能，增強(qiáng)海馬神經(jīng)發(fā)生，改善突觸相關(guān)蛋白表達(dá)，顯著減輕學(xué)習(xí)記憶障礙。ZALDIVAR等[26]研究還評(píng)估了MSCs外泌體和MSCs在側(cè)腦室室下區(qū)促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的作用，與AD組相比，用MSCs和MSCs外泌體處理的小鼠增加了SVA唾液酸神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(PSA-NCAM)和雙皮質(zhì)素/微管相關(guān)蛋白(DCX)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，其中PSA-NCAM和DCX被廣泛應(yīng)用于新生未成熟神經(jīng)元和神經(jīng)元前體的鑒定，評(píng)價(jià)神經(jīng)發(fā)生，表明MSCs和MSC外泌體都可以有效地促進(jìn)阿爾茨海默病模型腦室下區(qū)的神經(jīng)發(fā)生。

2.3 MSCs源性外泌體與周?chē)窠?jīng)損傷后細(xì)胞突觸重塑 MSC源性外泌體作為細(xì)胞旁分泌產(chǎn)物，可能在周?chē)窠?jīng)損傷(PNI)后的恢復(fù)中起主要作用。VERRILLI等[27]報(bào)道了不同來(lái)源的MSC外泌體，包括人月經(jīng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MenSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)，都可以促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元的突起生長(zhǎng)。另一項(xiàng)研究表明，人脂肪干細(xì)胞源性外泌體(ASC-exos)在被雪旺細(xì)胞(SCs)內(nèi)化后，通過(guò)優(yōu)化SCs功能，減少SCs凋亡、減輕自噬作用，體外上調(diào)相應(yīng)的基因促進(jìn)周?chē)窠?jīng)軸突再生[28]。同時(shí)，ZHANG等[29]證明大鼠注射骨髓干細(xì)胞源性外泌體(BMSC-Exosome)可激活ERK1/2、STAT3 和CREB信號(hào)通路蛋白，這些信號(hào)通路蛋白參與神經(jīng)損傷后的神經(jīng)元生長(zhǎng)和軸突再生。在大鼠脊髓損傷模型中，損傷區(qū)域NF200染色少于遠(yuǎn)端區(qū)域。注射BMSC-外泌體組損傷區(qū)NF200染色減少遠(yuǎn)低于對(duì)照組，Western blot也顯示BMSC-外泌體組NF200的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，表明BMSC-外泌體促進(jìn)外傷性脊髓損傷后的軸突再生[30]。此外，特異性表達(dá)的miRNA參與MSC的增殖和表型轉(zhuǎn)換、神經(jīng)發(fā)生、軸突外生長(zhǎng)和巨噬細(xì)胞遷移。例如，特異性miRNA的過(guò)表達(dá)(miR-23a，miR-200，miR-133b，miR-17-92簇)可以促進(jìn)軸突基因的發(fā)生和髓鞘化[31-34]。同時(shí)最近的研究表明，MSCs源性外泌體分泌的miRNA-126也可以保護(hù)脊髓損傷大鼠神經(jīng)元，從而介導(dǎo)神經(jīng)的可塑性，改善損傷后神經(jīng)的恢復(fù)[35]。MSCs源性外泌體可能通過(guò)傳遞外泌體miRNA來(lái)靶向神經(jīng)源生態(tài)位中的神經(jīng)細(xì)胞，從而促進(jìn)突起的生長(zhǎng)。除了傳遞遺傳成分外，MSCs外泌體還含有許多神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在軸突再生中也起著關(guān)鍵作用。因此，MSCs外泌體中與神經(jīng)修復(fù)相關(guān)的生物活性分子的存在提供了調(diào)節(jié)去神經(jīng)肌肉萎縮、神經(jīng)存活和軸突生長(zhǎng)恢復(fù)的可能性。

3 外泌體治療應(yīng)用的當(dāng)前挑戰(zhàn)

由于人群的異質(zhì)性和神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制的復(fù)雜性，只有少數(shù)藥物在臨床試驗(yàn)中取得了成功，適合治療患者。外源性給藥具有嚴(yán)重副作用的風(fēng)險(xiǎn)，如惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤產(chǎn)生或微血管阻塞[36]?；贛SC細(xì)胞治療的治療效果可以通過(guò)分泌可溶性因子，如外泌體等來(lái)介導(dǎo)。LAURA等[37]證明MSCs外泌體的治療效果與MSCs一致，并且通過(guò)增強(qiáng)腦修復(fù)機(jī)制和發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用來(lái)治療神經(jīng)疾病。MSCs外泌體的低免疫原性、低毒性、生物降解性和跨越血腦屏障的能力是作為外源性疾病治療的優(yōu)點(diǎn)。盡管如此，一些問(wèn)題必須解決，才能在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用MSCs外泌體：一是開(kāi)發(fā)技術(shù)，以低成本大規(guī)模獲得外泌體；二是需要標(biāo)準(zhǔn)的分離技術(shù)來(lái)獲得高純度的外泌體；三是如何通過(guò)外泌體遞送來(lái)提高靶向藥物治療的準(zhǔn)確性。

4 展望

綜上，外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理和生理過(guò)程及治療中發(fā)揮重要作用。間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體可以通過(guò)調(diào)節(jié)基因、蛋白質(zhì)和RNA在靶細(xì)胞和組織中的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞突觸再生和重塑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。在不同分泌外泌體的細(xì)胞類(lèi)型中，MSCs外泌體較其他細(xì)胞來(lái)源外泌體介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞突觸再生功能在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用潛力受到了廣泛關(guān)注，其大致具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：免疫原性，降低了免疫細(xì)胞對(duì)受體細(xì)胞的識(shí)別及吞噬；可自由通過(guò)血腦屏障；脂質(zhì)雙分子層可以運(yùn)輸和保護(hù)腔內(nèi)的物質(zhì)免受細(xì)胞外環(huán)境的破壞；外泌體治療為無(wú)細(xì)胞治療，降低了MSC移植所引起的致瘤及栓塞的風(fēng)險(xiǎn)。但是，MSCs外泌體的研究還面臨諸多挑戰(zhàn)，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷和治療方面的研究仍任重道遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步探尋其臨床治療的研究策略。