貴州花紅離體再生體系的建立與優(yōu)化

鄒思艷， 田 田， 吳敏芳， 文曉鵬

1. 貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴陽(yáng) 550025

花紅(Malusasiatica)屬薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)落葉小喬木，既可以作為果實(shí)開發(fā)，也可以作為蘋果的良好砧木，同時(shí)也是貴州省重要的蘋果種質(zhì)資源[1]，但其繁殖效率較低．高效的離體再生體系對(duì)于苗木快繁具有重要意義[2]，也是開展遺傳轉(zhuǎn)化研究的前提[3]．外植體的選擇對(duì)于植物離體再生體系的建立至關(guān)重要，葉片是蘋果屬植物離體再生常用的外植體，此外，子葉、莖尖和下胚軸等均可通過(guò)組織培養(yǎng)誘導(dǎo)出完整植株[4]．花紅的離體再生研究較早，蔣啟林等[5]利用花紅幼胚成功誘導(dǎo)成苗并建立快繁體系，萬(wàn)瑩[6]和陳鑫[7]以來(lái)安花紅莖段為外植體建立了快繁體系，但易受胚發(fā)育程度和數(shù)量的限制，也會(huì)受莖段木質(zhì)化程度所影響，致其繁殖系數(shù)相對(duì)較低．由于葉片和子葉不受材料發(fā)育階段及數(shù)量的限制，本研究以花紅葉片和子葉為外植體誘導(dǎo)再生，探究不同因子對(duì)其直接再生不定芽頻率的影響，以期建立高效的花紅離體再生體系，為花紅轉(zhuǎn)基因工作奠定理論基礎(chǔ)，也為花紅新品種培育和砧木遺傳改良提供新途徑．

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以貴州省黔西縣本地品種花紅的幼胚、子葉(成熟胚)及組培苗葉片為材料．

1.2 研究方法

1.2.1 外植體的獲得

幼胚：取花后40 d的花紅幼果，自來(lái)水沖洗1 h，于超凈工作臺(tái)上用75%的酒精滅菌30 s，無(wú)菌水洗2～3次，再用0.1%的升汞溶液加2滴吐溫20滅菌10 min，無(wú)菌水清洗3～4次，吸水紙吸干水分，切除果肉，取出幼胚備用．

子葉：選取成熟飽滿、顆粒均一的花紅種子，用無(wú)菌水浸泡10 min后，于超凈工作臺(tái)上用75%的酒精消毒30 s，無(wú)菌水洗2～3次，再用10%的次氯酸鈉溶液處理10 min，無(wú)菌水洗3～4次，吸水紙吸干水分后，剝除種皮，取出兩片子葉，頂端胚芽切除，另一端切去1/3備用．

葉片：取本實(shí)驗(yàn)室繼代保存的花紅組培苗上部幼嫩的葉片，將葉片邊緣和葉柄切除，用手術(shù)刀垂直主葉脈將背面(遠(yuǎn)軸面)劃傷備用．

1.2.2 外植體類型對(duì)不定芽再生的影響試驗(yàn)

取上述幼胚和成熟胚的子葉為外植體，正面朝上分別接種于以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、添加2.0 mg/L TDZ和0.1 mg/L NAA的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；葉片外植體背面朝上接種到葉片不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(MS+3.0 mg/L TDZ+0.20 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA)．暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)，光照時(shí)間為12 h/d，培養(yǎng)溫度(25±1) ℃，光照強(qiáng)度 2 000～2 500 lx．每個(gè)處理接種20個(gè)，重復(fù)3次．

1.2.3 暗培養(yǎng)時(shí)間及子葉部位對(duì)不定芽再生的影響試驗(yàn)

將上述成熟胚的子葉斜切近胚芽端，正切另一端，接種于再生培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L NAA)上，分別進(jìn)行不同時(shí)間(0 d，7 d，14 d)的暗培養(yǎng)處理．每個(gè)處理接種20個(gè)，重復(fù)3次．

1.2.4 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)不定芽再生的影響試驗(yàn)

為篩選誘導(dǎo)不定芽分化的最佳組合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)(Plant Growth Regulator，PGR)，將上述成熟胚的子葉分別接種于16個(gè)含有不同濃度的TDZ(1.0，2.0，3.0，4.0 mg/L)，NAA(0.05，0.10，0.20，0.40 mg/L)，IBA(0，0.05，0.10，0.20 mg/L)不定芽再生培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)50 d．每個(gè)處理接種20個(gè)子葉，重復(fù)3次．光下培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)各處理下不定芽的誘導(dǎo)率．

1.2.5 不定芽增殖培養(yǎng)

待子葉誘導(dǎo)出叢芽之后(50 d)，切除多余子葉，將叢芽分別轉(zhuǎn)入到含有0.05 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2周后，切取長(zhǎng)勢(shì)一致的單株芽分別接種于9個(gè)不同濃度6-BA(1.0，2.0，4.0 mg/L)和NAA(0.1，0.2，0.3 mg/L)的增殖培養(yǎng)基中，每瓶接種4株，重復(fù)5次．光下培養(yǎng)40 d后，觀察記錄不定芽的生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)．

1.2.6 生根培養(yǎng)

待不定芽生長(zhǎng)至1.5～2.5 cm時(shí)，用解剖刀切取單株的苗接種于含有不同激素濃度的生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基采用 1/2 MS+ 20 mg/L蔗糖+6 mg/L瓊脂作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的IBA(0.5，1.0，2.0 mg/L)和NAA(0，0.1，0.2 mg/L)．每個(gè)處理接種4株增殖苗，重復(fù)5次，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)各處理的生根情況．

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均采用Excel軟件進(jìn)行處理，采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)及差異顯著性分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體類型對(duì)不定芽再生的影響

不同外植體對(duì)花紅離體再生有很大的影響．結(jié)果表明，花紅子葉與幼胚和葉片在再生培養(yǎng)基上的再生率有差異，幼胚和葉片均無(wú)不定芽形成，成熟胚的子葉培養(yǎng)于MS+2.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中，不定芽再生率為11.67%．

2.2 暗培養(yǎng)時(shí)間及子葉部位對(duì)不定芽再生的影響

前期暗培養(yǎng)對(duì)植物再生不定芽有一定的促進(jìn)作用，暗培養(yǎng)7 d能夠顯著促進(jìn)子葉再生不定芽．結(jié)果表明，子葉暗培養(yǎng)后變黃，且體積膨大至原來(lái)的2倍時(shí)，未經(jīng)暗培養(yǎng)的子葉無(wú)明顯變化(表1)．暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)13 d，子葉開始產(chǎn)生不定芽(圖1a)；暗培養(yǎng)0 d和暗培養(yǎng)14 d的子葉均無(wú)不定芽產(chǎn)生．

暗培養(yǎng)7 d后的子葉轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)，子葉迅速轉(zhuǎn)綠，近軸面近胚芽端切口處出現(xiàn)疑似不定芽雛形，接種20 d后開始出現(xiàn)不定芽，并陸續(xù)發(fā)育成小植株．50 d時(shí)不定芽再生率達(dá)到最高(圖1b)，子葉再生的不定芽大部分發(fā)生于近軸面近胚端切口處，再生率達(dá)36.7%，相較遠(yuǎn)胚端增高約11倍(表1)，表現(xiàn)出明顯的極性效應(yīng)．

表1 培養(yǎng)時(shí)間及子葉部位對(duì)誘導(dǎo)再生不定芽的影響

2.3 PGR濃度對(duì)子葉再生不定芽的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)花紅子葉再生不定芽有很大影響．結(jié)果表明，在添加了1.0 mg/L TDZ和0.05 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上，子葉誘導(dǎo)不定芽的再生率最高達(dá)38.9%，再生芽數(shù)最多，平均11.7個(gè)(表2)．

表2 PGR濃度對(duì)花紅子葉再生不定芽的影響

2.4 6-BA和NAA濃度對(duì)花紅不定芽增殖的影響

不同6-BA和NAA濃度配比對(duì)花紅不定芽的增殖系數(shù)及增殖效果影響較大(表3)，培養(yǎng)基MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的不定芽增殖系數(shù)最高，為7.73，但芽細(xì)弱，長(zhǎng)勢(shì)差，呈玻璃化狀．從芽的長(zhǎng)勢(shì)及健康程度來(lái)看，培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA中不定芽生長(zhǎng)狀態(tài)最好，伸長(zhǎng)明顯(圖1c)，增殖系數(shù)較高，為最佳增殖培養(yǎng)基．

表3 6-BA和NAA濃度對(duì)不定芽增殖的影響

2.5 生根培養(yǎng)

增殖后的花紅不定芽在含有不同濃度IBA(0.5，1.0，2.0 mg/L)和不同濃度NAA(0，0.1，0.2 mg/L)的1/2MS生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，一段時(shí)間后不同濃度組合的生根率有明顯差異．結(jié)果表明，1/2 MS+1.0 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA生根培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)生根率(60%)最高，且根系粗壯，須根多(圖1f)．

表4 IBA和NAA濃度對(duì)花紅不定芽生根的影響

圖1 花紅子葉誘導(dǎo)不定芽再生過(guò)程

3 討 論

以往對(duì)花紅組織培養(yǎng)的研究中，多以幼胚和帶芽莖段為外植體建立快繁體系，但是繁殖系數(shù)受胚發(fā)育程度和莖段木質(zhì)化影響較大[5-7]．二球懸鈴木再生研究表明，子葉再生體系較葉片再生體系受基因型影響較小、組織肥厚不易褐化、再生效率更加穩(wěn)定[8]，并且子葉具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，作為外植體被廣泛應(yīng)用于不定芽再生體系中[9-10]．幼胚發(fā)育至接近子葉期才有不定芽發(fā)生的能力[11]，且成熟胚子葉作為外植體再生不定芽誘導(dǎo)率較高，再生能力較強(qiáng)[12]．本試驗(yàn)研究了花紅的幼胚、成熟胚的子葉和葉片離體再生不定芽的能力，結(jié)果僅有花紅成熟胚的子葉作為外植體，成功建立了花紅的離體再生體系．楊海峰[13]認(rèn)為全光照是獲得高效再生的關(guān)鍵技術(shù)之一，但也有研究指出，前期暗培養(yǎng)有利于不定芽的再生[14-16]．本研究的結(jié)果表明，暗培養(yǎng)7 d比直接光照培養(yǎng)更有利于花紅子葉再生不定芽，且近胚端再生率顯著高于遠(yuǎn)胚端，導(dǎo)致該結(jié)果的主要因素可能是與子葉近胚端到遠(yuǎn)胚端IAA(吲哚乙酸)信號(hào)逐漸減弱、生長(zhǎng)素差異分布有關(guān)[17]．

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和含量對(duì)植物離體再生植株的影響極大[18]，其對(duì)植物器官直接發(fā)生途徑的影響首先表現(xiàn)在對(duì)不定芽的誘導(dǎo)上[19]．前人的研究結(jié)果[20-21]表明，TDZ較6-BA更有利于離體不定芽的再生，TDZ能顯著促進(jìn)較難誘導(dǎo)分化的植物的離體培養(yǎng)，能有效改善其誘導(dǎo)率[22-23]．有研究證實(shí)，適宜濃度的TDZ是誘導(dǎo)西瓜外植體分化的關(guān)鍵，低濃度NAA也有利于西瓜外植體的分化[24]．TDZ與NAA的適宜濃度比能促進(jìn)花紅不定芽的分化，但高濃度TDZ會(huì)明顯抑制不定芽的再生，且誘導(dǎo)出的不定芽失綠，生長(zhǎng)緩慢，后期褐化死亡．

當(dāng)NAA濃度高于1.0 mg/L時(shí)會(huì)加重組培苗玻璃化效應(yīng)，而低濃度的6-BA能有效降低玻璃化效應(yīng)[25]．在花紅增殖培養(yǎng)過(guò)程中，高濃度6-BA和NAA的組合使得組培苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，葉片變脆，叢芽難以分離成單株等問(wèn)題．宋常美等[26]的研究表明，壯苗培養(yǎng)可適當(dāng)加入赤霉素(GA)，GA不僅能促進(jìn)增殖，還能促進(jìn)生根，縮短了壯苗的時(shí)間．萬(wàn)瑩[6]的研究由于激素用量、基本培養(yǎng)基不適及品種性能等原因，導(dǎo)致在來(lái)安花紅離體快繁的研究中未獲得生根試管苗．本試驗(yàn)綜合“錫金海棠”和“青砧一號(hào)”的生根培養(yǎng)基[27]，通過(guò)IBA和NAA適宜的濃度配比成功獲得了花紅生根苗．

綜上所述，本研究以花紅成熟子葉作為外植體，接種于含有1.0 mg/L TDZ和0.05 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中，可高效誘導(dǎo)出花紅不定芽．經(jīng)生根培養(yǎng)后可獲得完整再生植株，實(shí)現(xiàn)花紅再生體系的優(yōu)化．再生體系的建立為進(jìn)一步開展花紅的細(xì)胞工程及基因工程遺傳育種奠定了技術(shù)基礎(chǔ)．