高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法鑒定拉薩大黃化學(xué)成分

孫玉明，徐 蒙，李文慧，王 靜，張 華，王玉林

(1.大連理工大學(xué)分析測試中心，遼寧 大連 116024；2.大連理工大學(xué)化工學(xué)院， 遼寧 大連 116024；3.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116044)

大黃是中藥發(fā)展中最古老、使用頻率最高、最重要的草藥之一。該藥材不僅可以食用，還具有重要的經(jīng)濟(jì)價值[1]。在全球范圍內(nèi)，大黃屬植物共有60多種，我國有41種和4個變種，不同產(chǎn)地、品種、采收時節(jié)的不同，會造成大黃化學(xué)成分的不同，功效也有所差異[2]。我國2020版藥典中收錄的大黃為蓼科植物掌葉大黃(RheumpalmatumL)、唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.exBalf)、藥用大黃(RheumofficinaleBaill)的干燥根和根莖。本研究的拉薩大黃(RheumlhasaenseA.J.LietP.K.Haiao)為蓼科大黃屬多年生高大草本植物，是藏族民間常用草藥，名曲札。拉薩大黃的干燥根不僅具有治療便秘、腹脹腹痛、消腫愈創(chuàng)、清熱解毒、破積滯、行淤血等功效[3]，還可以通過改善微循環(huán)和冠狀動脈流量、降低血壓、抑制血小板聚集和消除自由基來治療高血脂癥及心腦血管疾病[4]。近期，Hu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，拉薩大黃可以降低血液中冠狀病毒，進(jìn)而治療病毒性肺炎。

拉薩大黃與一般大黃的化學(xué)成分有所不同，Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分中含有2種白藜蘆醇三聚體rheumlhasol A和rheumlhasol B，4種白藜蘆醇二聚體，而不含蒽醌類化合物。龔云麟等[7]采用UV、MS、1H NMR、13C NMR以及薄層色譜法分離并鑒定拉薩大黃乙醇提取物中的去氧土大黃苷、曲札茋苷、虎杖苷、白藜蘆醇、白皮杉醇和土大黃苷元-3′-O-β-D-葡萄糖苷等6種成分，其中茋類成分居多。目前，關(guān)于拉薩大黃化學(xué)成分分析的文獻(xiàn)報道較少[6-7]，一般多采用分離、純化、鑒定的方法，且僅檢測到12種化合物，無法有效完成拉薩大黃的藥材質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(HPLC-HRMS)具有高分離效率、高選擇性及高靈敏度的檢測優(yōu)勢，可以解決中藥成分復(fù)雜性、多樣性和微量性帶來的分析困難，在中藥材化學(xué)成分分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[8-11]。

本研究擬采用HPLC-HRMS法分析拉薩大黃提取物的化學(xué)成分，通過綜合分析各化合物的色譜和質(zhì)譜行為，為拉薩大黃的質(zhì)量評價及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

LTQ-Orbitrap XL高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品，配有Thermo Xcalibur 2.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Accela液相色譜系統(tǒng)、Accela 1250四元梯度泵及Accela AS自動進(jìn)樣器；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；BS124S萬分之一天平：德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；KQ-200DB數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水機(jī)：美國Merck Millipore公司產(chǎn)品；CS-700中藥材粉碎機(jī)：五億海納電器有限公司產(chǎn)品；GL-88B旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.2 試劑與材料

拉薩大黃：來源于香格里拉高山植物園，由大連醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥劑科主任中藥師李永杰鑒定并確認(rèn)。

無水乙醇：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；乙酸(色譜純)：迪馬科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈(色譜純)：賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；超純水：實驗室自制。

去氧土大黃苷(HPLC≥98%,LOT:P13S9F70275)、曲扎茋苷(HPLC≥98%,LOT:P14D7F26825)、白皮杉醇(HPLC≥98%,LOT:Y15A8C33972)：上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；兒茶素(HPLC≥98%,LOT:C11263757)、表兒茶素(HPLC≥98%,LOT:C10376713)、虎杖苷(HPLC≥95%,LOT:C10083549)、丹葉大黃素(HPLC≥98%,LOT:C11251823)、沒食子酸(HPLC=99%,LOT:C11062421)、4-香豆酸(HPLC=98%,LOT:C11334633)：上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗部分

1.3.1拉薩大黃的提取 取10 g粉碎的拉薩大黃干燥根粉末，加入90%乙醇，加熱回流2次，每次2 h，真空抽濾，合并2次所得濾液，65 ℃減壓濃縮至浸膏狀。在拉薩大黃的提取和樣品制備過程中均須避光操作以防止樣品降解。

1.3.2樣品制備 稱取適量的拉薩大黃浸膏，加入無水乙醇，經(jīng)超聲溶解配制成400 g/L溶液；取適量的上述溶液，加入甲醇稀釋，配制成20 g/L溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣量2 μL。

取適量的對照品，加入甲醇溶解稀釋，配制成約20 mg/L溶液，進(jìn)樣量2 μL。

1.3.3實驗條件 色譜條件：Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)，柱溫為室溫；流動相A為乙腈，B為水；梯度洗脫程序為0～5 min(10%～30%A)，5～10 min(30%～70%A)，10～12 min(70%～100%A)，12～15 min(100%A)，15～15.1 min(100%～10%A)，15.1～20 min(10%A)；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量2.0 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正、負(fù)離子模式；源噴霧電壓分別為3.5 kV(正離子模式)和3.0 kV(負(fù)離子模式)；鞘氣和輔助氣均為氮氣，流速分別為15、5 L/min；加熱毛細(xì)管溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓35 V；分辨率30 000，最大允許偏差±5×10-6；一級和多級全掃描方式。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測條件的選擇

本實驗采用HPLC-HRMS法在正、負(fù)離子模式下分析鑒定拉薩大黃的化學(xué)成分。結(jié)果表明，負(fù)離子模式下檢測到的化合物種類較多，且質(zhì)譜響應(yīng)強度相對較大，這與化合物結(jié)構(gòu)中均含有酚羥基或羧基等酸性基團(tuán)有關(guān)。為提高化合物的分離度，分別以純水和0.3%乙酸水溶液作為流動相中的水相進(jìn)行梯度洗脫，在水相中添加酸性改性劑后，部分化合物的峰形和分離度得到了一定程度的改善，但由于酸性改性劑在負(fù)離子模式下的離子抑制作用，導(dǎo)致18種化合物(化合物2，3，4，8，18，22，23，28，31，33，36，45，46，48，49，56，57，58)無法被檢測，示于圖1。因此，采用以純水為流動相中的水相進(jìn)行梯度洗脫。

2.2 化學(xué)成分分析

本實驗采用HPLC-HRMS法分離鑒定拉薩大黃提取物的化學(xué)成分，分別對樣品進(jìn)行(+)-ESI-MSn和(-)-ESI-MSn檢測。通過綜合分析各化合物的保留時間、精確分子質(zhì)量和多級質(zhì)譜信息，并與文獻(xiàn)[10-19]數(shù)據(jù)或?qū)φ掌穼Ρ龋矙z測出鞣質(zhì)類、茋類、黃酮類、苯丙酸類、苯丁酮類等63種化合物，各化合物的相關(guān)數(shù)據(jù)列于表1。

2.2.1鞣質(zhì)類 鞣質(zhì)又稱單寧，是一類水溶性多元酚類化合物，其在大黃中分為水解鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)兩類，這兩類鞣質(zhì)的單體分別為沒食子酸和d-兒茶素[20]，也有報道將這兩種類型鞣質(zhì)的結(jié)合體稱為復(fù)合鞣質(zhì)[21]。本研究在拉薩大黃中檢測到22種鞣質(zhì)類化合物，其中10種水解鞣質(zhì)，分別為化合物1、2、3、5、6、9、10、11、13、18；7種縮合鞣質(zhì)，分別為化合物12、16、17、21、26、29、41；5種復(fù)合鞣質(zhì)，分別為化合物24、30、34、40、43。下面以化合物12、16、21、29為例進(jìn)行分析。

注：a.負(fù)離子模式下，以乙腈-水為流動相；b.正離子模式下，以乙腈-水為流動相；c.負(fù)離子模式下，以乙腈-0.3%乙酸水為流動相圖1 拉薩大黃提取物的典型色譜圖Fig.1 Typical chromatograms of Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao extract

化合物12(tR=5.65 min)、16(tR=6.17 min)、21(tR=6.60 min)和29(tR=7.38 min)在ESI-模式下產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z577.135 1。根據(jù)高分辨數(shù)據(jù)擬合其元素組成均為C30H26O12，在ESI+模式下同樣有質(zhì)譜響應(yīng)，數(shù)據(jù)列于表1，初步推斷為(表)兒茶素二聚體結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步確定結(jié)構(gòu)，對m/z577進(jìn)行二級全掃描質(zhì)譜分析，產(chǎn)生的主要碎片離子有m/z559、451、425、407、289，與文獻(xiàn)[15]報道一致。其中，m/z559相比于m/z577減少了18 u，推斷為該化合物脫掉1分子H2O形成的[M-H-H2O]-碎片離子；m/z451與m/z559相比減少了108 u，推測為C—C鍵斷裂進(jìn)一步脫去1分子鄰苯二酚形成的[M-H-H2O-C6H4O2]-碎片離子；m/z425與母離子相比減少了125 u，推斷為母離子發(fā)生逆Dials-Alder開環(huán)反應(yīng)脫掉1分子C8H8O3形成的[M-H-C8H8O3]-碎片離子；m/z407與m/z425相比減少了18 u，為進(jìn)一步脫去1分子H2O形成的[M-H-C8H8O3-H2O]-碎片離子；m/z289比母離子減少288 u，推斷為C—C鍵斷裂脫去1分子兒茶素形成[M-H-C15H12O6]-碎片離子，其質(zhì)譜圖及可能的裂解途徑分別示于圖2、圖3。結(jié)合裂解碎片信息，并對比相關(guān)文獻(xiàn)[15]，確定化合物12、16、21和29為(表)兒茶素二聚體，因其結(jié)構(gòu)中含有多個手性碳原子，所以可形成多個非對映異構(gòu)體。研究發(fā)現(xiàn)，縮合鞣質(zhì)類化合物的裂解規(guī)律為易在脫水后母核兒茶素分子上C—C鍵斷裂脫去1分子鄰苯二酚形成[M-H-H2O-C6H4O2]-碎片離子，母離子發(fā)生逆Dials-Alder開環(huán)反應(yīng)脫掉1分子C8H8O3形成[M-H-C8H8O3]-碎片離子，且易脫去兒茶素單體形成[M-H-C15H12O6]-碎片離子。水解鞣質(zhì)易脫去葡萄糖分子形成[M-H-C6H10O5]-碎片離子，而得到的母核離子易脫去1分子CO2，葡萄糖分子上易脫去1分子C2H4O2。其他鞣質(zhì)類化合物也有相似的裂解規(guī)律。

2.2.2茋類 茋類化合物是對具有二苯乙烯母核一類化合物的總稱，主要存在于植物的木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中[22]，是大黃的主要成分。茋類化合物中苷類化合物易水解得到苷元，其苷元上的苯環(huán)易發(fā)生裂解脫去乙炔和乙炔醇。本研究共檢測到28種茋類化合物，以化合物27和32為例進(jìn)行分析。

注：a.一級質(zhì)譜圖；b.二級質(zhì)譜圖圖2 化合物12的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of compound 12

圖3 化合物12可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 Proposed fragmentation pathways of compound 12

化合物27(tR=7.14 min)和化合物32(tR=7.65 min)在ESI-模式下產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z405.119 0，根據(jù)高分辨數(shù)據(jù)擬合其元素組成均為C20H22O9，m/z441為加合離子[M-H+HCl]-，初步推斷為白皮杉醇葡萄糖苷。為進(jìn)一步確定結(jié)構(gòu)，對m/z405進(jìn)行二級全掃描質(zhì)譜分析，產(chǎn)生的主要碎片離子為m/z243，推測為糖苷鍵斷裂脫去1分子葡萄糖形成的[M-H-C6H10O5]-碎片離子。為進(jìn)一步確定苷元結(jié)構(gòu)，對m/z243進(jìn)行三級質(zhì)譜分析，其主要碎片離子為m/z243、225、201、175、159。其中，m/z225為m/z243脫去1分子水形成的[M-H-H2O]-碎片離子，m/z201為m/z243脫去1分子乙炔醇得到的[M-H-C2H2O]-碎片離子，m/z175是由m/z243脫去1分子乙炔醇和1分子乙炔得到的[M-H-C2H2O-C2H2]-碎片離子，m/z159是由m/z243脫去2分子乙炔醇得到的[M-H-2C2H2O]-碎片離子。通過與對照品比對，發(fā)現(xiàn)化合物32與對照品曲扎茋苷的色譜和質(zhì)譜行為一致，確定化合物32為曲札茋苷，而化合物27為白皮杉醇葡萄糖苷?；衔?2的質(zhì)譜圖及可能的裂解途徑分別示于圖4、圖5。其他茋類化合物也有相似的裂解規(guī)律。

注：a.一級質(zhì)譜圖；b.二級質(zhì)譜圖；c.三級質(zhì)譜圖圖4 化合物32的質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of compound 32

2.2.3苯丁酮類 苯丁酮類化合物是大黃的活性成分之一。苯丁酮衍生物的苯環(huán)4位上易被葡萄糖苷化，葡萄糖的2、6位羥基易與沒食子酸或苯丙酸衍生物縮合形成酯。本研究共檢測到2種苯丁酮類化合物，下面對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定分析。

化合物23(tR=6.94 min)和化合物35(tR=8.01 min)在ESI-模式下產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z477.140 4，根據(jù)高分辨數(shù)據(jù)推測其元素組成均為C23H26O11。這2種化合物在ESI+模式下同樣有質(zhì)譜響應(yīng)，數(shù)據(jù)列于表1，推測其可能為蓮花掌苷或異蓮花掌苷。為進(jìn)一步確定結(jié)構(gòu)，對m/z477進(jìn)行二級全掃描質(zhì)譜分析，產(chǎn)生的主要碎片離子有m/z433、313、169，與文獻(xiàn)[11,13-14]報道一致。m/z433相比于m/z477減少44 u，推斷為苯丁酮所在部分C—C鍵斷裂脫掉1分子CH3CHO形成的[M-H-C2H4O]-碎片離子；m/z313比m/z477減少164 u，推測為糖苷鍵斷裂脫去1分子苯丁酮得到的[M-H-C10H12O2]-碎片離子；m/z169與沒食子酸的準(zhǔn)分子離子相同，推測為C—O鍵斷裂脫去苯丁酮葡萄糖苷部分形成的[M-H-C16H20O6]-碎片離子，其質(zhì)譜圖及可能的裂解途徑分別示于圖6、圖7。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[11]報道，在反相色譜系統(tǒng)中異蓮花掌苷的保留時間相對較短，結(jié)合裂解碎片信息，推測化合物23為異蓮花掌苷，化合物35為蓮花掌苷。

圖5 化合物32可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 Proposed fragmentation pathways of compound 32

注：a.一級質(zhì)譜圖；b.二級質(zhì)譜圖圖6 化合物35的質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectra of compound 35

圖7 化合物35可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.7 Proposed fragmentation pathways of compound 35

2.2.4黃酮類 黃酮類化合物是一類以2-苯基色原酮為母核的化合物，因其結(jié)構(gòu)不同，種類繁多，具有多種藥理作用。黃酮類化合物典型的裂解方式是逆Dials-Alder裂解，本研究共檢測到6種黃酮類化合物，以化合物58為例進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定分析。

化合物58(tR=10.57 min)在ESI-模式下產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z287.056 1，該化合物在ESI+模式下同樣有質(zhì)譜響應(yīng)，根據(jù)高分辨數(shù)據(jù)擬合其元素組成為C15H12O6，初步推斷為圣草酚。為進(jìn)一步確定結(jié)構(gòu)，對m/z287.056 1進(jìn)行二級全掃描質(zhì)譜分析，產(chǎn)生的主要碎片離子有m/z269、151，與文獻(xiàn)[16]報道一致。其中，m/z269與m/z287相比減少了18 u，推測為脫掉1分子H2O形成的[M-H-H2O]-碎片離子；m/z151比m/z287減少136 u，推測是黃酮類化合物典型的逆Dials-Alder裂解途徑，脫掉1分子C8H8O2形成的[M-H-C8H8O2]-碎片離子。綜合考慮元素組成及碎片信息，推斷化合物58為圣草酚，其質(zhì)譜圖及可能的裂解途徑示于圖8、圖9。

本研究在負(fù)離子模式下檢測到63種化合物，正離子模式下檢測到54種化合物，其中包括22種鞣質(zhì)類化合物，28種茋類化合物，3種苯丙酸類化合物，6種黃酮類化合物，2種苯丁酮類化合物及2種有機(jī)酸類化合物。除化合物32、37、50、53、54、56、59、60、61、62外，其余均為首次在拉薩大黃提取物中發(fā)現(xiàn)，對拉薩大黃的成分進(jìn)行了較全面的分析和補充。拉薩大黃中的主要有效成分為茋類化合物，且Hu等[5]發(fā)現(xiàn)，純化的曲扎茋苷、虎杖苷等組合物和拉薩大黃的總提取物都具有抑制冠狀病毒活性的作用，但拉薩大黃總提取物的效果比組合物的預(yù)防效果好。

注：a.一級質(zhì)譜圖；b.二級質(zhì)譜圖圖8 化合物58的質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectra of compound 58

圖9 化合物58可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.9 Proposed fragmentation pathways of the compound 58

3 結(jié)論

本文建立了HPLC-HRMS法分析鑒定拉薩大黃提取物的主要化學(xué)成分，共鑒定出63種化合物，其中有53種化合物是在該藥材中首次發(fā)現(xiàn)，但未發(fā)現(xiàn)蒽醌類成分。本研究為拉薩大黃藥材的鑒定及質(zhì)量控制提供了有效方法，也為其在臨床應(yīng)用及藥理研究奠定了基礎(chǔ)。

致謝：感謝大連醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥劑科主任中藥師李永杰對中藥材拉薩大黃的鑒定。