不同方法提取釀酒酵母總RNA的比較

安佳星，伍時(shí)華，曾令杰，黃錦翔，豐丕雪，梁天林，易 弋*

（1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西科技大學(xué)，廣西 柳州 545006；3.廣西科技大學(xué) 廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為重要的模式生物[1]，在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究中都有重要的應(yīng)用。然而釀酒酵母細(xì)胞壁呈甘露聚糖-蛋白質(zhì)-葡聚糖的三明治結(jié)構(gòu)[2-4]，非常堅(jiān)韌，難以破碎，導(dǎo)致胞內(nèi)遺傳物質(zhì)難以釋放[5]，干擾核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的提取。而在進(jìn)行Northern印跡及雜交分析、轉(zhuǎn)錄組分析、信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）純化用于體外構(gòu)建互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）文庫等分子生物學(xué)研究時(shí)，都需要高質(zhì)量的RNA。因此，獲得高純度、高質(zhì)量、完整性好的RNA是酵母進(jìn)行分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。雖然研究學(xué)者已經(jīng)建立了多種生物特異性RNA分離和提取方法[6-8]，開發(fā)了多種RNA分離和提取試劑盒[9-10]，如十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[11]、改進(jìn)總RNA提取試劑（Trizol）法[12-13]、甲酰胺法[14]等，但不同方法在提取效果、試劑組成和操作步驟等方面都存在差異，從而使RNA提取的效果也不盡相同。

雖然有研究通過不同破壁方法來提高RNA的提取效率，如易弋等[15]在提取酵母菌總RNA的試驗(yàn)中認(rèn)為反復(fù)凍融和液氮研磨是較為有效且簡便的酵母菌破壁方法。商安全等[16]通過在Trizol試劑溶液中加鋼珠勻漿振蕩輔助破壁，提取的白假絲酵母菌總RNA濃度好、質(zhì)量高，提取效果優(yōu)于溶菌酶法，尚鮮見將不同提取RNA方法放在同一體系下進(jìn)行比較，因此，本研究選擇試劑盒法、Trizol 法、熱酚法3種方法提取釀酒酵母總RNA，為解決破壁問題，選用酵母破壁酶輔助破壁，并進(jìn)行菌體用量的條件優(yōu)化，比較了不同方法提取釀酒酵母總RNA的效果，以期為酵母總RNA的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GGSF16：廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所；RNA提取酚（分析純）、酵母破壁酶溶液：北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑：賽默飛世爾科技公司；RNA提取試劑盒（非酵母專用總RNA提取試劑盒）：市售；焦炭酸二乙酯（分析純）：上海吉至生化科技有限公司；三氯甲烷（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；異丙醇（分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司。

0.1%焦炭酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理水：取1 mL DEPC溶液，用超純水定容至1 L，處于振蕩狀態(tài)下過夜放置，121 ℃滅菌40 min；三羥甲基甲胺基乙磺酸溶液（2-（tris（hydroxymethyl）methylamino）ethane-1-sulphonic acid，TES）：取1 mL 1 mol/L的三（羥甲基）氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris-HCl）（pH為7.5），2 mL 0.5 mol/L的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（pH為8.0），5 mL 10%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），用0.1% DEPC處理水定容至100 mL備用。

0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）：稱取氯化鈉8.0 g，氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鈉1.44 g，磷酸二氫鉀0.24 g，加0.1% DEPC處理水溶解并定容至1 L，pH調(diào)至7.4，121 ℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H2100R低溫高速離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HH 系列數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；B-500超微量分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；JY02S紫外分析儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DYY-6D電泳儀：北京市六一儀器廠；ZWYR-C2402C疊式恒溫調(diào)速搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)器材預(yù)處理

在本次試驗(yàn)中，所有實(shí)驗(yàn)器材均用0.1%的DEPC水過夜浸泡，121 ℃滅菌40 min。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作中始終佩戴一次性手套，并及時(shí)更換，以避免RNA污染。

1.3.2 釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)

接種釀酒酵母GGSF16于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)10 h，得到種子液。按10%種子液接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm值為1.0，得到酵母菌GGSF菌懸液。

1.3.3 不加酵母破壁酶處理下三種方法的比較

（1）試劑盒法

取750 μL酵母菌菌懸液，4 ℃、12 000 r/min條件下離心2 min，棄去培養(yǎng)基，利用試劑盒法提取酵母總RNA。TaKaRa試劑盒提取過程詳見其說明書。產(chǎn)物用于電泳分析或-80 ℃保存。

（2）Trizol法

取750 μL酵母菌菌懸液，4 ℃、12 000 r/min條件下離心2 min，棄去培養(yǎng)基。在菌體中加入750 μL Trizol溶液，冰浴5 min后加入150 μL三氯甲烷，劇烈振蕩15 s，冰浴2～3 min，4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min。取水相至另一個(gè)離心管，并加入500 μL的異丙醇，上下顛倒，混勻后冰浴10 min，4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，棄上清。在白色沉淀中加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇，上下顛倒混勻，4 ℃、7 500r/min條件下離心5 min，棄上清。在室溫下晾曬5 min后加50 μL的0.1% DEPC處理水溶解。產(chǎn)物用于電泳分析或-80 ℃保存。

（3）熱酚法

取750 μL酵母菌菌懸液，4 ℃、12 000 r/min條件下離心2 min，棄去培養(yǎng)基。在菌體中加入1 mL PBS重懸，4 ℃、12 000 r/min條件下離心2 min，棄上清。加入400 μL TES溶液和400 μL RNA提取酚，劇烈振蕩混勻后65 ℃水浴10 min，期間每隔2 min混勻一次，冰浴5 min后，4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min。將水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入400 μL RNA提取酚/三氯甲烷/異丙醇（25∶24∶1，V/V）抽提一次，4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min。將水相轉(zhuǎn)移至新管，加入1/10體積的乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇，冰浴3 min，4 ℃、12 000 r/min條件下離心5 min，棄上清。用1 mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇洗滌，上下顛倒混勻，4 ℃、7 500 r/min條件下離心5 min，棄上清。在室溫下晾曬5 min后加50 μL的0.1% DEPC處理水溶解。產(chǎn)物用于電泳分析或-80 ℃保存。

1.3.4 酵母破壁酶處理下三種方法的比較

在1.5 mL離心管中分別加入100 μL、250 μL、500 μL、750 μL、1.0 mL、1.5 mL、3.0 mL的酵母菌菌懸液，4 ℃、12 000 r/min條件下離心2 min，棄去培養(yǎng)基。在離心管中加入25 μL的酵母破壁酶溶液，30 ℃培養(yǎng)45 min。利用1.3.3中所述的3種方法分別提取酵母總RNA。

1.3.5 總RNA濃度及純度檢測

利用超微量分光光度計(jì)測定總RNA溶液在波長260 nm和280 nm處的吸光度值（A260nm和A280nm），并計(jì)算總RNA的濃度，并以A260nm/A280nm，A260nm/A230nm的大小判斷RNA樣品純度。

1.3.6 總RNA完整性檢測

取1 μL提取得到的RNA，加入1 μL的上樣緩沖液和4 μL的0.1% DEPC處理水混勻后加入到1%凝膠的加樣孔中，于1×TBE緩沖液中180 V電泳10 min。電泳完成后，用紫外分析儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不加酵母破壁酶提取酵母總RNA

取750 μL釀酒酵母培養(yǎng)液，按1.3.3所述的3種方法分別提取總RNA，并進(jìn)行濃度、純度和電泳分析，結(jié)果分別見表1和圖1。

圖1 不同方法提取酵母總RNA電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of total RNA extracted from yeast by different methods

表1 不同提取方法獲得的RNA濃度和純度Table 1 RNA concentration and purity obtained by different extraction methods

由表1可知，試劑盒法和Trizol法提取的RNA核酸濃度低，且A260nm/A280nm和A260nm/A230nm均＜2.0，這說明酵母菌細(xì)胞壁較厚，直接用裂解液處理不容易破壞酵母菌的細(xì)胞壁，從而無法釋放細(xì)胞內(nèi)容物，需要借助外力來輔助破壁，提高酵母菌總RNA的提取效率。

由圖1可知，泳道1和泳道2中沒有出現(xiàn)條帶。采用熱酚法提取的RNA濃度很高，A260nm/A280nm和A260nm/A230nm均在2.0左右，說明RNA中很少有蛋白質(zhì)、鹽類等雜質(zhì)的污染。電泳圖顯示泳道3有兩條明顯的條帶，條帶美觀且清晰，沒有明顯的小分子彌散帶，且28S rRNA和18S rRNA條帶亮度接近2∶1。結(jié)果表明，熱酚法是一種適用于酵母菌RNA提取的方法。

2.2 酵母破壁酶對于酵母總RNA提取結(jié)果的影響

2.2.1 試劑盒法

取不同菌體量的釀酒酵母培養(yǎng)液，按1.3.4所述的試劑盒法提取總RNA，并進(jìn)行濃度、純度和電泳分析，結(jié)果見分別見表2和圖2。

由表2可知，菌體量≥750 μL時(shí)得到的核酸質(zhì)量濃度較高均在500 ng/μL以上，A260nm/A280nm在2.0左右的范圍，說明RNA中蛋白質(zhì)污染小，A260nm/A230nm在2.0左右的范圍，說明RNA的純度較高，鹽類的污染較小。

表2 破壁酶輔助試劑盒法獲得的RNA濃度和純度Table 2 Concentration and purity of RNA obtained by lyticase assisted with kit method

由圖2可知，泳道4、5、6、7有兩條較為明顯的條帶，但也有明顯的小片段RNA的彌散帶。菌體量≤500 μL時(shí)得到的核酸濃度較低，A260nm/A230nm過小，雜質(zhì)污染嚴(yán)重，導(dǎo)致泳道1、2、3沒有任何可見的條帶。

圖2 破壁酶輔助試劑盒法提取酵母總RNA電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of total RNA extracted from yeast by lyticase assisted with kit method

結(jié)果表明，加入酵母破壁酶后利用試劑盒法可以破除酵母菌的細(xì)胞壁，菌體量≥750 μL的提取效果較好。原因可能是由于菌體量過少導(dǎo)致酵母釋放出的RNA少，提取效果不佳。

2.2.2 Trizol法

取不同菌體量的釀酒酵母培養(yǎng)液，按1.3.4所述的Trizol法提取總RNA，并進(jìn)行濃度、純度和電泳分析，結(jié)果分別見表3和圖3。

由表3可知，菌體量在750 μL時(shí)得到的核酸質(zhì)量濃度較高為1 056.967 ng/μL，A260nm/A280nm為2.07，說明RNA中蛋白質(zhì)污染小。由圖3可知，泳道4中有較亮的28S rRNA和18S rRNA條帶，并伴有輕微的降解。菌體量＞750 μL之后，核酸濃度較高，但在電泳圖中對應(yīng)的泳道5、6、7中的RNA降解嚴(yán)重，說明酵母破壁酶雖然可以有效的破壞酵母細(xì)胞壁，提高RNA的提取效率，但是菌體量過大，所釋放出的大量胞內(nèi)物也會(huì)影響RNA的提取質(zhì)量。

表3 破壁酶輔助Trizol法獲得的RNA濃度和純度Table 3 Concentration and purity of RNA obtained by lyticase assisted with Trizol method

圖3 破壁酶輔助Trizol法提取酵母總RNAFig.3 Electrophoretogram of total RNA extracted from yeast by lyticase assisted with Trizol mrthod

2.2.3 熱酚法

取不同菌體量的釀酒酵母培養(yǎng)液，按1.3.4所述的熱酚法提取總RNA，并進(jìn)行濃度、純度和電泳分析，結(jié)果分別見表4和圖4。

圖4 破壁酶輔助熱酚法提取酵母總RNA電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of total RNA extracted from yeast by lyticase assisted with hot-phenol method

表4 破壁酶輔助熱酚法獲得的RNA濃度和純度Table 4 Concentration and purity of RNA obtained by lyticase assisted with hot-phenol method

由表4可知，除了3.0 mL菌體量，其余菌體量的核酸濃度均不高，在500 ng/μL以下；不同菌體量下測得的RNA中A260nm/A280nm均在2.0以下，說明RNA中有蛋白質(zhì)污染。

由圖4也驗(yàn)證了這種觀點(diǎn)，泳道4、5、6、7都出現(xiàn)了28S rRNA和18S rRNA條帶，但仍有降解現(xiàn)象，其中泳道6、7降解較嚴(yán)重，泳道3依稀可以看到兩條條帶，但降解比較嚴(yán)重，泳道1、2 沒有出現(xiàn)任何條帶。結(jié)果表明，加入酵母破壁酶后利用熱酚法提取酵母總RNA可獲得較好的效果，但不如不添加破壁酶直接使用熱酚法提取。

3 討論

本研究比較了3種常用的總RNA提取方法，結(jié)果表明，用熱酚法提取釀酒酵母總RNA的效果較好，RNA完整性高，可能原因是用RNA提取酚進(jìn)行抽提后，再使用氯仿進(jìn)行再次的抽提，使酵母細(xì)胞壁在能很好的被破碎的同時(shí)還能使RNA分離的更徹底。張琰等[17]認(rèn)為用改良熱酸性酚法是提取白色念珠菌早期生物膜RNA的理想方法。本研究中，在加酶條件下使用熱酚法提取得到的RNA濃度和純度都很低，究其原因，可能是在加酶后的溫浴過程中，細(xì)胞內(nèi)容物已經(jīng)釋放，導(dǎo)致RNA酶水解RNA，從而影響RNA的提取質(zhì)量。

本研究嘗試了用市售普通總RNA提取試劑盒提取釀酒酵母總RNA，沒有得到理想的結(jié)果。試劑盒的說明書一般指出本產(chǎn)品適合提取植物組織、動(dòng)物組織、懸浮細(xì)胞、細(xì)菌、酵母細(xì)胞的總RNA。但事實(shí)上直接使用試劑盒提取酵母總RNA的效果并不好，需要一些輔助破壁的方法[18-19]配合使用來提高RNA的提取效果。龍燕等[20]使用溶菌酶搭配專門的酵母RNA提取試劑盒可以提取到高質(zhì)量的熱帶假絲酵母總RNA。本課題組也曾使用TaKaRa酵母菌專門的總RNA提取預(yù)處理試劑配合試劑盒提取酵母總RNA，也能得到高質(zhì)量的RNA，不足之處是費(fèi)用偏高。本研究加入酵母破壁酶后，雖然核酸濃度大大增加，但只有在菌體量大的情況下才有28S rRNA和18S rRNA條帶，且條帶出現(xiàn)降解，可能是由于使用酶進(jìn)行破壁會(huì)延長RNA的提取時(shí)間，從而導(dǎo)致后續(xù)的提取效果不佳。

Trizol法是一種常用的總RNA提取方法[21]，但本研究發(fā)現(xiàn)此方法也不適合直接用于提取釀酒酵母總RNA，也需要配合一些輔助破壁的方法來提高提取效果。潘琤等[22]通過液氮研磨改進(jìn)Trizol法提取的白色念珠菌總RNA質(zhì)量高，完整性優(yōu)于Trizol法和超聲粉碎法。本研究采用的是酵母破壁酶溶液進(jìn)行的破壁，用Trizol法只有在750 μL菌體量下才能提取到RNA，但并未提取到高質(zhì)量的RNA，猜測酶解法破壁雖然條件比較溫和，但受溫度、處理時(shí)間、pH等條件的影響，從而對RNA的抽提產(chǎn)生影響，因此，要想獲得此方法下完整性高的RNA，還需要對酶解條件進(jìn)行更加深入的探索。

4 結(jié)論

研究表明，普通的總RNA提取試劑盒和Trizol法不適合直接用于釀酒酵母總RNA的提取，但通過添加酵母破壁酶，可以提高提取效果。采用熱酚法提取釀酒酵母總RNA，菌體量為750 μL時(shí)得到的RNA質(zhì)量濃度為1 759.602 ng/μL，A260nm/A280nm為2.06，A260nm/A230nm為2.27，達(dá)到后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。該方法不用加酵母破壁酶，減少了操作時(shí)間，且具有操作簡單、成本低、高質(zhì)、高效等優(yōu)點(diǎn)，有較高的使用價(jià)值。