蜜蜂殘翅病研究進(jìn)展

王紅坤，王藝樺，周丹銀，張 炫

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院蜂學(xué)系，云南 昆明 650201）

飼養(yǎng)蜜蜂對農(nóng)作物的增產(chǎn)作用是維護(hù)全球糧食安全的重要保障，并有不可替代的生態(tài)和社會價值。蜜蜂蜂群受到來自細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等多種病原的危害，全球化的蜜蜂蜂群和蜂產(chǎn)品貿(mào)易，加速區(qū)域性蜜蜂病蟲害的擴(kuò)散，給現(xiàn)代養(yǎng)蜂生產(chǎn)帶來新的挑戰(zhàn)[1]。第一個蜜蜂病毒- 蜜蜂囊狀幼蟲病毒（Sac brood virus） 于1913 年被首次報道，隨后百年間有近30 余種蜜蜂病毒被報道，但并未引起足夠的重視[2]。直至2006 年蜜蜂蜂群崩潰綜合征（Colony Collapse Disorder，以下簡稱CCD） 在北美及歐洲大范圍暴發(fā)后，蜜蜂病毒病才引發(fā)廣泛關(guān)注[3]。歷史數(shù)據(jù)顯示20 世紀(jì)50 年代以來，歐洲和北美飼養(yǎng)蜂群數(shù)量的持續(xù)下降與蜜蜂病毒危害相關(guān)[4]。蜜蜂病毒多為RNA 病毒，有種類多、易變異、多因素聯(lián)合致病，多寄主寄生的特性，可在同生境條件下進(jìn)行相互交叉?zhèn)鞑ィ瑢?dǎo)致在致病機理研究和疾病防控上依然知之甚少，也一直是蜜蜂病害研究的熱點[5]。

DWV 誘發(fā)的蜜蜂殘翅病具典型發(fā)病特征和極強致病性，常被作為一種代表性的蜜蜂病毒病研究模型受到科學(xué)家的重視。本文以蜜蜂DWV 為代表，從蜜蜂殘翅病的病原學(xué)、流行病學(xué)、臨床癥狀及防控方面多個角度的論述蜜蜂病毒病的發(fā)展歷史、危害和研究方向。

1 病原學(xué)

DWV 屬小核糖核酸病毒目（Picornavirales）、傳染性軟化病毒科（Iflaviridae）、傳染性軟腐病病毒屬（Iflavirus）[6]。DWV 為10 Kb 大小的單順反子RNA 病毒，因缺少校對機制極易變異，伴隨不斷擴(kuò)大的寄主范圍， 不斷演化出新的變異體： DWV-A、DWV-B 和DWV-C[7]。 DWV最初基因（DWV-A）， 包括先前大部分DWV 序列和Kakugo 病毒(KV)。DWV 病毒直徑約為30 nm，由無被膜的二十面體蛋白衣殼和衣殼內(nèi)的一個正義單鏈RNA 組成。基因組5’端較長的非翻譯區(qū)域（5’UTR） 和3’端較短的高度保守的非翻譯區(qū)域（3’UTR） 對基因組翻譯和復(fù)制調(diào)節(jié)非常重要[8]。通過低溫電子顯微鏡確定DWV 病毒粒子的結(jié)構(gòu)為3.5 的分辨率，通過X 射線晶體學(xué)確定為3.8 的分辨率[9]。DWV病毒粒子由排列在二十面體不對稱衣殼中的VP1、VP2 和VP3 亞基構(gòu)成，主要的衣殼蛋白具有β- 折疊結(jié)構(gòu)，并根據(jù)β- 折疊慣例命名為B 至I β- 折疊（如圖1）。DWV 殼層的低溫電鏡和X 射線結(jié)構(gòu)相似。

圖1 DWV 的二十面體不對稱單位及其病毒粒子在交替構(gòu)象中的結(jié)構(gòu)

多聚蛋白的氨基末端從前導(dǎo)肽（Lp） 開始，接下來分別是結(jié)構(gòu)衣殼蛋白VP2、假設(shè)的VP4 和VP1 和VP3；其羧基端含有非結(jié)構(gòu)蛋白、RNA 解旋酶的保守基序、假設(shè)基因組連接蛋白（VPg）、3C- 蛋白酶和依賴于RNA 的RNA 聚合酶[10]。Lp 具有蛋白酶活性，在氨基酸水平高度可變。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)DWV 與其變異體VDV-1 差異最大的位置是Lp，同源性只有73.9%；而解旋酶似乎是基因組中保守度最高的區(qū)域，同源性至少為87.9%；第二保守區(qū)是3'UTR （87.2%）， 這表明該非編碼區(qū)在DWV 病毒中起重要作用[11]。

結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2 和VP3 的亞基排列成原聚體，每5 個原聚體在衣殼蛋白上形成一個單位，其封閉和開放控制著病毒的釋放過程[12]。Picornavirales 的多數(shù)病毒基因組編碼的小蛋白VP4 參與細(xì)胞膜通透性的改變過程，能夠影響膜的滲透性。 如吸血獵椿病毒(Triatoma Virus，TrV)的小蛋白VP4 插入膜中形成新的蛋白通道，膜的滲透性隨pH 值升高而升高[13]。

DWV VP3 亞基包含C 端延伸，形成一個病毒粒子表面P 域定位，其位置取決于周圍溶液的組成。DWV VP3 亞基的P 結(jié)構(gòu)域為球形，直徑為30，具有高流動性。而DWV 結(jié)構(gòu)中的殘基可能提供病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞所需的酯酶、脂肪酶或蛋白酶活性或參與受體結(jié)合[9]。

2 流行病學(xué)

自1977 年從無發(fā)病癥狀的埃及成年蜜蜂病毒（Egypt bee virus，EBV） 體內(nèi)得到DWV。1982 年通過血清學(xué)試驗從日本畸形的成蜂內(nèi)得到一株與EBV 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的病毒，因分離病毒的成蜂翅膀畸形明顯，稱之為蜜蜂殘翅病病毒。

2.1 宿主范圍

DWV 寄主分布廣泛。多個熊蜂種（BombusSpp.）、胡蜂（VespidaeSpp.）和6 個蜜蜂種及多種蜂巢寄生蟲中均能檢測到DWV[14]；DWV 在開花植物中，蜜蜂、花粉負(fù)載和其他非蜜蜂膜翅目傳粉者中存在；且蜂房內(nèi)儲存的花粉和蜂蜜中的病毒可以保持感染能力6 個月[15]。DWV的宿主涵蓋了10 個目的68 種節(jié)肢動物，其中64 種節(jié)肢動物屬于昆蟲綱Insecta[16]，包括膜翅目Hymenoptera、 半翅目Hemiptera、 鞘翅目Coleoptera、 雙翅目 Diptera、鱗翅目Lepidotera、 革翅目Dermaptera 和蜚蠊目Blattodea 7 個目。4 種節(jié)肢動物屬于蛛形綱Arachnida，包括蜱螨目Arachnoidea、蜘蛛目Araneae 和盲蛛目Opiliones 3 個目。

DWV 是中國主要的非本土歐洲蜜蜂病。從中國錦州和秦皇島分離出的DWV-A 型毒株China1-2017 和China2-2018， 與 日 本 的KV-2001 毒株密切相關(guān)。分別顯示出96.7%的核苷酸同一性和98.1%的氨基酸同一性[17]。從錦州地區(qū)患病蜜蜂中擴(kuò)增出編碼蜜蜂殘翅病毒Helicase 蛋白酶的基因片段DWV-JZ，與Gen-Bank 中的DWV-JL1 同源性達(dá)到95%[18]。

DWV-A 在西方蜜蜂中的流行率高于東方蜜蜂。DWV-B 在西方蜜蜂中罕見，在東方蜜蜂中沒有出現(xiàn)[19]。DWV-B 變體在英國和威爾士的蜂群中普遍存在并占主導(dǎo)地位， 而DWV-A 在美國普遍存在并且占主導(dǎo)地位。其中DWV-B 還是英國長期存活的耐瓦螨蜜蜂種群中的主要變異體，表明該變異體通過重復(fù)感染排除了更多致命的DWV-A[20]。

2.2 傳播途徑

2.2.1 水平傳播

DWV 存在于蜜蜂大腦、中腸上皮、脂肪體以及成年蜜蜂的糞便、飼喂蜂的腺體分泌物中。蜜蜂通過取食、喂食、護(hù)理幼蟲或清理巢房、訪問花朵及梳理毛發(fā)[21]進(jìn)行水平傳播。有癥狀個體中，病毒普遍存在于各個部位，尤其在消化道上皮細(xì)胞中聚集，大量病毒顆粒脫落進(jìn)入內(nèi)腔[22]。另外，狄斯瓦螨—病毒聯(lián)合危害西方蜜蜂飼養(yǎng)蜂群。在泰國的蜂箱中，DWV感染率也高于其他蜜蜂病毒，蛹中流行率高于成年蜜蜂。表明存在除狄斯瓦螨以外的其他傳播途徑的可能性[23]。而小蜂螨（Tropilaelaps mercedesae） 的不斷擴(kuò)散，也將造成DWV 傳播從而對蜂群產(chǎn)生威脅[24]。

2.2.2 垂直傳播

垂直傳播是由親代傳播到子代的一種傳播方式。DWV 存在于健康蜜蜂的精液和受感染蜂王的受精囊、卵巢和卵中[22]，可能說明DWV具有增強其垂直傳播的適應(yīng)性傾向。通過人工授精方式直接證明了DWV 通過雄蜂和蜂王垂直傳播的路徑[25]。有研究證明跨卵傳播是垂直傳播的主要形式，但不能排除低水平的卵巢傳播[26]。而蜂王交配后的DWV 載量明顯提高，并且主要存在于腹部和胸腔，而頭部、卵巢、精囊和精子的病毒載量較低，暗示DWV 存在垂直傳播，但主要依賴水平傳播[27]。

寄主在感染DWV 后，體內(nèi)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)會發(fā)生變化，如通過免疫系統(tǒng)基因的表達(dá)或抑制，進(jìn)而適應(yīng)DWV 不同的傳播方式。對相關(guān)基因的定量檢測，更有利于探索DWV 傳播途徑對宿主的影響[28]。

3 臨床癥狀和致病過程

3.1 臨床癥狀

DWV 是少數(shù)幾種會導(dǎo)致寄主表現(xiàn)典型發(fā)病癥狀的蜜蜂病毒，發(fā)病成蜂羽化出房時翅殘缺、畸形、褶皺，腹部萎縮和褪色[29]，幼蜂喙突出，出房時間延長，死亡率增加，下咽腺和下頜腺發(fā)育不全[30]，失去飛行能力，只能爬行，1～2 日后死亡。DWV 可以侵染所有蜜蜂種群和性別(蜂王、工蜂和雄蜂)以及所有發(fā)育階段(精子、卵、幼蟲、蛹、成蜂)的個體。

DWV 還損傷蜜蜂神經(jīng)元，促使工蜂過早從內(nèi)勤蜂轉(zhuǎn)變?yōu)椴杉鋄31]。有癥狀的蜜蜂觸角中含有大量的DWV，病毒衣殼在蜜蜂觸角上皮區(qū)域聚集呈晶體狀，且感染區(qū)域完整性也受到破壞，表明觸角的功能受損，影響蜜蜂的交流[32]。DWV 對卵、蛹表現(xiàn)出低毒性，其死亡率較低。但缺乏關(guān)于蜜蜂免疫防疫系統(tǒng)的相關(guān)研究。

已證實DWV 是引發(fā)蜂群崩潰失調(diào)癥(CCD)和越冬群體損失(OCL)的主要病原體，且3 種變異體均有影響，但DWV-C 在流行性和病毒載量方面相對較弱[33]。美國飼養(yǎng)蜂群2010年至2016 年DWV-B 陽性檢出率由3%升至66%[34]。

病毒病的危害程度是寄主與病原體在分子和細(xì)胞水平相互作用結(jié)果的表現(xiàn)形式[35]。無癥狀DWV 感染在蜂群受到壓力或遇到一定的環(huán)境條件時，可引起明顯的疾病癥狀。其中，瓦螨和DWV 組合會引起蜜蜂的免疫抑制和增加其他致病菌的易感性，被認(rèn)為是蜂群崩潰癥的顯著因子。

3.2 致病機制

相較許多高毒力的病毒（如CBPV、ABPV、BQCV、SBV 和SPV），DWV 的弱毒性讓宿主的卵、幼蟲及蛹期不被殺死而使瓦螨能夠寄生存活，并將病毒傳播給新宿主，使其成為與瓦螨密切相關(guān)的主要病毒[36]。

病毒有長期共生和應(yīng)急性侵染2 種生存策略，可通過調(diào)節(jié)其在宿主體內(nèi)的病毒顆粒數(shù)量達(dá)到長期潛伏或急性致死目的。健康蜂和殘翅蜂之間不同的病毒濃度表明病毒滴度是成年工蜂中出現(xiàn)殘翅現(xiàn)象的一個關(guān)鍵因素。但病毒在寄主個體或種群內(nèi)的復(fù)制動態(tài)也依賴于寄主的健康狀況及外界生物或非生物因素的影響。研究證明DWV 侵染瓦螨后，能在瓦螨體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制增殖，再將高濃度殘翅病毒變異毒株注射到寄生蜂蛹體內(nèi)[37]。但通過蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)狄斯瓦螨體內(nèi)并沒有進(jìn)行DWV 的復(fù)制，病毒顆粒通過淋巴補血的方式積聚在狄斯瓦螨腸道中。而狄斯瓦螨的唾液毒性蛋白(Varroa toxic protein，VTP)重組表達(dá)時能增加DWV 滴度，促進(jìn)封蓋幼蟲發(fā)育為殘翅蜂[38]。

迄今為止，DWV 的具體致病過程仍未得到明確揭示，通過構(gòu)建重組DWV 基因組并在起始位置加上綠色熒光蛋白（eGFP） 標(biāo)記，可以在熒光顯微鏡下觀察DWV 的去向以及復(fù)制增殖[39]。為進(jìn)一步研究DWV 治病過程提供了方向。

4 DWV 的防控與展望

由于缺乏在病毒傳播動力學(xué)、發(fā)病機制、流行病學(xué)和寄主免疫學(xué)方面的知識及相關(guān)數(shù)據(jù)，蜜蜂病毒病的流行與傳播機制仍未得到完全揭示，主要根據(jù)臨床癥狀來診斷和防治蜜蜂殘翅病[40]。目前尚無有效預(yù)防和治療手段；加上蜜蜂的新引進(jìn)和國際交流，蜜蜂病毒在全球范圍內(nèi)迅速傳播[41]。DWV 防控可從以下2 個方面著手：一是提高蜂群群體免疫力；二是利用RNAi 技術(shù)抑制DWV 的增殖。

為了提高蜂群群體免疫力，生產(chǎn)實踐中應(yīng)加強防控，注重衛(wèi)生，采取合并弱群、維持強群，及時補充花粉[42]的管理措施，維持蜂群對病蟲害的較強抗性。另一方面，通過人工育種培育篩選具備抗DWV 特性的蜂種，包括具備在不同季節(jié)以及不同類型的蜂箱中均表現(xiàn)出高效衛(wèi)生能力的蜂種[43]，以及適當(dāng)引進(jìn)抗螨蜂種。抑制DWV 的增殖主要基于RNAi 介導(dǎo)和基因編輯敲除VTP 受體基因的有效抗螨方法，保護(hù)蜂群健康[44]。

隨著對DWV 的深入研究，未來有望利用RNA 基因組中的堿基與DWV 衣殼在五重軸附近相互作用的結(jié)構(gòu)開發(fā)抗病毒化合物[5]。另有一種假說：瓦螨和DWV 病毒誘導(dǎo)蜂群發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，釋放化學(xué)信號，引起蜜蜂的衛(wèi)生反應(yīng)[45]，為DWV 防治提供了一種新的思路。但DWV 的防治應(yīng)是多種方式的結(jié)合，從而達(dá)到更加高效、安全的目的，未來的養(yǎng)蜂業(yè)也將向環(huán)境友好型不斷邁進(jìn)[46]。