分子標(biāo)記技術(shù)在水稻品種改良中的應(yīng)用

張金霞 劉賀梅 孫建權(quán) 殷春淵 王和樂 胡秀明 田芳慧 王書玉

（河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，新鄉(xiāng) 453002）

水稻是人類的主要食物來源之一，全球有20億以上人口以稻米為主食，水稻在我國的種植面積和產(chǎn)量均居各種作物之首。據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局公報(bào)顯示，2019年我國水稻種植面積達(dá)2969萬hm2，總產(chǎn)量2.1億t，水稻育種技術(shù)的創(chuàng)新顯著提升了我國在水稻育種領(lǐng)域的國際地位，稻米品質(zhì)和產(chǎn)量得到極大地提高。我國既是稻谷生產(chǎn)大國，也是稻米消費(fèi)大國，稻米及其制品在日常生活中占有重要地位。目前，我國仍面臨糧食生產(chǎn)剛性需求與耕地、水資源短缺的矛盾，供給結(jié)構(gòu)性矛盾，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本高與經(jīng)濟(jì)效益低等矛盾；因此，不斷提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)仍是育種的主要任務(wù)。近些年來，我國的水稻育種工作取得較大進(jìn)展，從最初的矮化育種，經(jīng)歷了三系到兩系的雜種優(yōu)勢利用、超級(jí)稻的培育及目前的綠色優(yōu)質(zhì)超級(jí)稻，育種技術(shù)也從常規(guī)育種發(fā)展到綜合運(yùn)用常規(guī)育種和現(xiàn)代分子育種技術(shù)。在品種選育過程中更加注重產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性、適應(yīng)性等要素的綜合協(xié)調(diào)。

分子標(biāo)記輔助選擇育種（MAS）從DNA水平上直接鑒定基因型，通過與目標(biāo)性狀基因型緊密連鎖的分子標(biāo)記，進(jìn)行目標(biāo)基因的篩選。在苗期或者低世代就可直接對目標(biāo)基因進(jìn)行檢測，幾乎不受環(huán)境條件的影響，無需再進(jìn)行測交和自交檢驗(yàn)，顯著提高了準(zhǔn)確性和選擇效率。隨著更多水稻高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲等基因被克隆，分子標(biāo)記輔助選擇育種將在遺傳改良方面發(fā)揮重要作用。

1 分子標(biāo)記技術(shù)

分子標(biāo)記技術(shù)通過檢測與目標(biāo)基因存在緊密連鎖標(biāo)記的帶型，篩選含有目標(biāo)基因的個(gè)體，與常規(guī)育種技術(shù)相比具有準(zhǔn)確性高、周期短、目的性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。常用的SSR標(biāo)記數(shù)量豐富，均勻分布于整個(gè)基因組中，在品種間具有廣泛的位點(diǎn)變異，且具有共顯性，可同時(shí)鑒別雜合子和純合子。隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，測序成本大幅度降低，水稻全序列的測定和EST數(shù)據(jù)庫的開發(fā)為SNP標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用提供了條件。基因芯片是檢測SNP的重要手段，利用DNA芯片技術(shù)，將大量探針固定于玻/硅片上，然后用熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行大量分子雜交，可比較不同組織或器官的基因表達(dá)水平，篩選突變基因，分析基因表達(dá)模式。目前，水稻高密度基因芯片技術(shù)通過檢測樣品中目標(biāo)基因的SNP變異位點(diǎn)，可快速準(zhǔn)確檢測水稻重要的功能基因，從而發(fā)掘優(yōu)良性狀，了解品種特性，加快育種研究進(jìn)程。

2 分子標(biāo)記的應(yīng)用

2.1 分子標(biāo)記在水稻抗病蟲育種中的應(yīng)用

2.1.1 抗稻瘟病稻瘟病是由稻瘟病菌（Pyricularia oryzaeCav.）引起的在水稻全生育期都會(huì)發(fā)生的真菌性病害，其中，穗頸瘟和葉瘟影響較重。在水稻品種審定時(shí)，稻瘟病抗性是一項(xiàng)重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，多數(shù)地區(qū)要求稻瘟病抗性綜合指數(shù)達(dá)到中抗以上。目前已有110多個(gè)稻瘟病抗性基因、500多個(gè)QTLs被鑒定[1]，分布于水稻12條染色體上的不同位點(diǎn)，且已被克隆的稻瘟病抗性基因至少有26個(gè)，其中Pi9、Pigm、Pi7、pi21、Pi50、Pi57和Ptr等為廣譜抗性基因[2]。已克隆的稻瘟病抗性基因相關(guān)分子標(biāo)記陸續(xù)被開發(fā)并應(yīng)用于水稻抗性育種中。

抗稻瘟病常規(guī)育種方法是將抗病基因通過雜交轉(zhuǎn)入目標(biāo)株系，或?qū)⒍鄠€(gè)具有廣譜抗性的稻瘟病基因聚合到一個(gè)株系上，進(jìn)而培育持久抗病品種。單基因的抗病性會(huì)隨著病原菌生理小種的變化逐漸喪失，采取聚合育種的方法可將多個(gè)抗稻瘟病基因?qū)胪黄贩N中，同時(shí)抵抗多種生理小種的侵害，從而提高品種的廣譜抗性。張羽等[3]在研究稻瘟病抗性基因數(shù)目與水稻抗病性的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，品種的抗病性隨著水稻抗性基因位點(diǎn)數(shù)目的增多也相應(yīng)提高，多個(gè)抗性基因共同作用可以有效提高水稻對稻瘟病的抗性。近幾年來，根據(jù)稻瘟病抗性基因所在區(qū)域的序列變異開發(fā)了多種分子標(biāo)記，如Pita，Pi9（與Piz-t、Pi2、Piz-5、Pi50、Piz、Pigm、Pizh位點(diǎn)相同），Pik，Pi-kh（與Pi54、Pi54rh位點(diǎn)相同），Pi5（與PiCO39、RGA5、Os11gRGA位 點(diǎn)相同），Pia（與RGA4、Os11gRGA4位點(diǎn)相同），Pi-d2（與Pid2位點(diǎn)相同），Pid3（與Pi25位點(diǎn)相同）[4]。

王曉玲等[5]利用11個(gè)抗瘟基因的標(biāo)記，對28份骨干粳稻和54份骨干秈稻進(jìn)行抗性分析，明確了這些材料攜帶的抗稻瘟病基因種類及分布，為廣譜持久抗性秈粳材料創(chuàng)制及骨干親本的選擇與配組提供了參考。鄭祥正[6]開發(fā)了一種基于PCR技術(shù)的Pik基因座的InDel標(biāo)記，該標(biāo)記能準(zhǔn)確地將Pik上功能基因與其他非抗病基因座區(qū)分開來，為篩選水稻抗稻瘟病種質(zhì)資源提供了一種簡便有效的方法。趙國超等[7]利用Wx基因第四外顯子+693處突變建立檢測軟米特性的CAPS（NlaIII）分子標(biāo)記，以及利用4種抗稻瘟病基因Pi9、Pita、Pib、Pigm分子標(biāo)記培育出含有這4種稻瘟病抗性基因及軟米基因（Wxmq），同時(shí)還表現(xiàn)出高柱頭外露率的兩系不育系水稻新品系2179S，為培育具有稻瘟病抗性的兩系雜交稻提供了優(yōu)良的不育系親本。馬作斌等[8]以攜帶抗稻瘟病基因Pib的遼粳9234和攜帶抗稻瘟病基因Pita的鐵粳7號(hào)為親本，從后代中鑒定到聚合抗稻瘟病基因Pita和Pib的新品種鐵粳16，該品種較其親本抗譜寬、綜合抗性更強(qiáng)。李友發(fā)等[9]將花藥培養(yǎng)選育出的晚粳類型不育系TS849與攜帶稻瘟病抗性基因Pigm的遲熟中粳水稻品種1350雜交，利用花藥培養(yǎng)創(chuàng)制一批加倍單倍體，通過分子標(biāo)記選擇攜帶Pigm基因的不育系，成功選育抗稻瘟病的晚粳類型光溫敏不育系JF35-2，其稻瘟病抗性水平達(dá)到高抗級(jí)別，可作為抗原應(yīng)用于抗稻瘟病雜交晚粳育種中。郭震華等[10]通過高分辨熔解曲線（HRM，high-resolution melting curve）技術(shù)，利用Pita及pik的HRM功能型分子標(biāo)記Pita-G/T、Pik2-C/T，對67份黑龍江省主栽品種及優(yōu)異種質(zhì)資源進(jìn)行基因分型，明確了Pita及pik在黑龍江省的分布情況，為抗稻瘟病育種提供了理論基礎(chǔ)。李虎等[11]利用香味基因Badh2-E7和廣譜抗稻瘟病基因Pi5、Pita、Pi2的功能標(biāo)記對分離世代單株材料進(jìn)行檢測，育成含Pi5、Pita、Pi2的優(yōu)質(zhì)香稻新品種桂香99，滿足了市場對抗稻瘟病優(yōu)良食味稻米的需求。柳絮等[12]以帶有廣譜高抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的空育131為供體，以粳稻為遺傳背景的抗蟲轉(zhuǎn)基因（Cry1C）水稻新品系濟(jì)抗10號(hào)為受體，通過分子標(biāo)記輔助選擇創(chuàng)制出了4個(gè)既抗蟲又抗稻瘟病的新材料SK01、SK02、SK03、SK04，為黃淮稻區(qū)抗病蟲水稻育種奠定了基礎(chǔ)。

2.1.2 抗白葉枯病水稻白葉枯病是由稻黃單胞菌稻致病變種Xanthomonas oryzae引起的水稻重要病害。白葉枯病菌是革蘭氏陰性菌，通過水稻的水孔為害葉片，也可侵染葉鞘。病斑呈短條狀，多發(fā)生于中下部葉片的尖端和邊緣，隨著斑點(diǎn)的擴(kuò)大，葉色變黃，擴(kuò)展后成長條斑，當(dāng)病斑繼續(xù)蔓延，葉色逐漸由白轉(zhuǎn)灰。目前，科學(xué)家已鑒定了46個(gè)水稻白葉枯抗性基因，其中11個(gè)基因已被克隆，并以此開發(fā)了重要基因的功能標(biāo)記，如Xa5、Xa10、Xa13、Xa21、Xa23和Xa27[13-18]。

牛付安等[19]利用水稻高密度基因芯片技術(shù)成功選育了聚合白葉枯病抗性基因Xa21和抗稻瘟病基因Pi2、Pita、Pib、Pi9、Pi54、Pikm、Pit的早熟、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、易于制種的雜交粳稻新品系申優(yōu)28，對優(yōu)質(zhì)雜交粳稻的選育具有重要的參考意義。湯劍豪等[20]利用回交和分子標(biāo)記輔助選擇，將供體親本MD12086-1351中的抗白葉枯病基因Xa23，抗稻瘟病基因Pi9和抗褐飛虱基因Bph14、Bph15滲入到優(yōu)質(zhì)兩系雜交稻恢復(fù)系香5背景中，育成了3個(gè)同時(shí)攜帶Xa23、Pi9、Bph14、Bph15基因的新株系，是聚合育種典型的成功范例。陳志偉等[21]通過分子標(biāo)記輔助選擇和系譜法相結(jié)合，選育出同時(shí)帶有抗白葉枯病基因Xa21、Xa23和抗稻瘟病基因Pi-2、Pi-1、Pi-kh的優(yōu)良兩系不育系禾9S，該不育系的育性轉(zhuǎn)換起點(diǎn)溫度低（約23℃）、可繁性好、柱頭外露率高、米質(zhì)優(yōu)，目前利用禾9S已組配出禾兩優(yōu)676等10多個(gè)雜交稻新品種，具有良好的推廣應(yīng)用前景。

2.1.3 抗褐飛虱褐飛虱具有生長周期短、繁殖力強(qiáng)、易遷飛等生活習(xí)性，廣泛分布于亞洲各國的稻產(chǎn)區(qū)，主要通過刺吸危害，造成水稻減產(chǎn)或絕收。褐飛虱還通過傳播各種病毒，如叢矮病毒、齒葉矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒等，給水稻生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。目前，已定位的抗褐飛虱基因有40多個(gè)，分布在第2、3、4、6、10、11和12染色體上，第4染色體上有16個(gè)抗性位點(diǎn)。其中，20個(gè)抗褐飛虱基因來源于栽培稻，24個(gè)抗性基因來源于7種野生稻。目前，已經(jīng)被克隆的褐飛虱抗性基因有7個(gè)，分別為Bph3、Bphi008a、Bph14、BPH18、Bph26、BPH29、Bph32[22-28]。其中，Bph3來源于栽培稻Ptb33，對褐飛虱有廣譜抗性，已被成功克隆，該基因位點(diǎn)與分子標(biāo)記RM586和RM588緊密連鎖。

馮銳等[29]利用與褐飛虱抗性基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記M4-10和INDEL標(biāo)記M4-228，從BC1F1世代開始進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，獲得4個(gè)抗褐飛虱恢復(fù)系與3個(gè)不育系，其配制的12個(gè)雜交組合中11個(gè)組合的抗性均達(dá)中抗及以上水平，為抗褐飛虱雜交稻育種提供了優(yōu)良種質(zhì)材料。李進(jìn)波等[30]利用分子標(biāo)記MRG4766、AP22、76-2和MS5檢測，培育出聚合抗褐飛虱基因Bph14、Bph15和抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的恢復(fù)系R650，對褐飛虱和稻瘟病的抗性均表現(xiàn)為抗。李孝瓊等[31]通過回交選育、分子標(biāo)記輔助選擇和田間抗性鑒定相結(jié)合的方法，篩選獲得3份聚合了稻飛虱抗性基因Wbph9、Bph14、Bph15和稻瘟病抗性基因Pi1的水稻材料，為選育抗病蟲害水稻恢復(fù)系提供了種質(zhì)資源。

2.2 分子標(biāo)記在水稻農(nóng)藝性狀改良中的應(yīng)用水稻Hd3a基因編碼的成花素是調(diào)控水稻抽穗通路中的關(guān)鍵因子，在短日照下促進(jìn)抽穗，長日照下延遲抽穗。Hd3a包含多個(gè)等位基因，其中，hd3aKasa的功能強(qiáng)于Hd3aNip。hd3aKasa是高光效基因型，一般攜帶hd3aKasa的水稻品種產(chǎn)量更高，但會(huì)導(dǎo)致水稻開花延遲。雜合態(tài)的Hd3aNip/Hd3aKasa則表現(xiàn)出產(chǎn)量高、抽穗延遲適中等特性，比兩種純合基因型更具育種利用價(jià)值。常遠(yuǎn)等[32]利用擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)（ARMS，amplification refractory mutation system）的原理，開發(fā)了包含4條引物的共顯性分子標(biāo)記hd3afnp，鑒定Hd3a的單核苷酸多態(tài)性，hd3afnp與表型完全連鎖，1次PCR反應(yīng)可以精確區(qū)分兩種純合基因型和雜合基因型，為水稻的高光效分子育種提供了一種高效的檢測方法。陳國鑫等[33]利用ARMS原理開發(fā)出包含4條引物的控制秈粳稻分蘗角度差異的主效基因TAC1的共顯性分子標(biāo)記tac1fnp，鑒定TAC1的功能單核苷酸多態(tài)性。相比TAC1xian，發(fā)生在tac1geng的A/G突變影響了粳稻的株型。兩個(gè)等位基因分別屬于單株高光效基因型和整體高光效基因型，處于雜合狀態(tài)時(shí)可以互補(bǔ)。通過一次PCR反應(yīng)可以簡便準(zhǔn)確區(qū)分兩種等位基因的純合及雜合，有助于水稻的高光效分子標(biāo)記輔助選擇育種。卿冬進(jìn)等[34]根據(jù)窄粒雜交稻親本美B的GW8基因序列與寬粒親本GW8序列第二內(nèi)含子的2個(gè)堿基缺失差異，結(jié)合五引物擴(kuò)增受阻突變體系技術(shù)，開發(fā)GW8基因熒光分子標(biāo)記PM-GW8。該標(biāo)記能快速檢測水稻GW8基因是否存在2個(gè)堿基缺失，為利用分子標(biāo)記輔助選擇改良水稻粒寬提供了高效可靠的基因分型技術(shù)。周雷等[35]通過分子標(biāo)記對7個(gè)長粒粳稻品種的7個(gè)粒長基因GS3、LGY3、qGL3、GL7、SLG7、TGW6、GS9和3個(gè)粒寬基因GS5、GW8、GW5進(jìn)行了基因型分析，該結(jié)果對優(yōu)質(zhì)粳稻品種粒型基因型提供了較全面的信息，為分子標(biāo)記輔助選育優(yōu)質(zhì)長粒粳稻新品種和親本組配提供重要的基因型參考。伍豪等[36]根據(jù)短粒雜交稻親本美B與長粒親本宜香B在GS3基因序列的差異，開發(fā)GS3基因的功能分子標(biāo)記M-GS3，該標(biāo)記能有效檢測出水稻親本及育種群體中的GS3長粒等位基因，從而為水稻粒長和千粒重的改良提供了便捷的檢測方法。王復(fù)標(biāo)等[37]利用60對分布于水稻12條染色體組的SSR標(biāo)記對190份水稻材料進(jìn)行遺傳多樣性分析與群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，鑒定出8個(gè)與穗長、一次枝梗數(shù)、一次枝梗穗粒數(shù)、二次枝梗數(shù)、二次枝梗穗粒數(shù)、總穗粒數(shù)和飽滿穗粒數(shù)等性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，對表型變異的解釋率在0.0378～0.0648，這8個(gè)與農(nóng)藝性狀相關(guān)的分子標(biāo)記可以應(yīng)用于高產(chǎn)水稻品種的選育過程中。

2.3 分子標(biāo)記在水稻品質(zhì)改良中的應(yīng)用水稻香味是稻米品質(zhì)的一項(xiàng)重要性狀，隨著人們生活水平的提高，香稻品種因其大米香味濃郁受到人們喜愛，并且種植香稻的經(jīng)濟(jì)效益更高。水稻香味主要由位于第8號(hào)染色體上編碼甜菜堿脫氫酶的Badh2基因控制，該基因的缺失或插入突變導(dǎo)致功能的喪失，從而促使米香物質(zhì)2-乙?；?吡咯啉（2AP）的積累，使水稻表現(xiàn)為有香味。羅世友等[38]將香味基因Badh2導(dǎo)入贛晚秈30號(hào)中，利用分子標(biāo)記Badh2-E7進(jìn)行檢測，選育出含有香味基因Badh2的優(yōu)質(zhì)香稻品種九香粘，米質(zhì)達(dá)國標(biāo)優(yōu)質(zhì)3級(jí)。李榮田等[39]通過功能性SNP-fgr標(biāo)記輔助選擇香味基因，同時(shí)利用34個(gè)雙親間具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記進(jìn)行背景選擇，培育出除香味以外其他性狀與空育131相似或相同的早粳稻空育131（fgr）導(dǎo)入系。呂軍等[40]利用自主開發(fā)的香味基因fgr的功能標(biāo)記與抗稻瘟病基因Pita的分子標(biāo)記的基因聚合到一起，篩選到4個(gè)綜合性狀優(yōu)良的抗稻瘟病香稻新品系遼粳香1-4號(hào)。胡蘭等[41]以香型軟米水稻松早香1號(hào)作為香味基因和軟米基因供體親本，以非香非軟長粒型水稻嘉禾218為轉(zhuǎn)育親本，利用香味基因和軟米基因的CAPS分子標(biāo)記EheⅠ和Nla Ⅲ輔助選擇，成功選育出長粒香型軟米水稻品系上師大19號(hào)，該品系為上海地區(qū)推廣長粒香型軟米水稻奠定基礎(chǔ)。王康愷[42]采用3個(gè)SSR標(biāo)記RM342、RM515、RM3600對后代進(jìn)行基因型檢測，發(fā)現(xiàn)基因組合類型與γ-氨基丁酸含量之間呈極顯著相關(guān)。通過對γ-氨基丁酸含量與基因組合類型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為利用分子標(biāo)記輔助選擇篩選富含γ-氨基丁酸品系提供參考。

3 展望

隨著分子生物學(xué)和功能基因組的發(fā)展，水稻分子育種技術(shù)逐漸成為植物育種的重要輔助手段，通過連鎖標(biāo)記進(jìn)行基因型和表型篩選，實(shí)現(xiàn)將多個(gè)抗病蟲基因以及品質(zhì)相關(guān)基因聚合到一個(gè)水稻品系中，形成性狀優(yōu)良的多抗聚合品種，是未來分子標(biāo)記輔助選擇的重點(diǎn)方向。

目前，分子標(biāo)記多集中于質(zhì)量性狀，尚未定位或連鎖不緊密的基因所控制的性狀以及數(shù)量性狀發(fā)展滯后、大量遺傳信息處于零散狀態(tài)以及育種群體達(dá)不到遺傳作圖的要求等問題制約著分子育種的發(fā)展。在未來，隨著生物技術(shù)不斷進(jìn)步，分子育種將更加精準(zhǔn)、高效，將轉(zhuǎn)基因以及基因編輯等技術(shù)與分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)相結(jié)合，將會(huì)加快水稻育種的研究進(jìn)程。