基于NF-κB∕ICAM-1通路探討右美托咪定對子癇前期大鼠的神經保護作用

張雷，朱詠儀，趙年章，梁少玲

妊娠期高血壓疾病是臨床上導致孕婦和圍生兒患病率和死亡率增高的主要原因之一，子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期高血壓疾病最嚴重的狀態(tài)［1］。目前，終止妊娠是治療PE唯一有效的治療措施［2］。PE與母體對妊娠的過度炎癥反應密切相關，重度PE患者全身小血管痙攣性收縮，高血壓、免疫反應、手術應激、手術操作及麻醉等均可誘發(fā)患者的血管內皮細胞功能異常，進而導致神經系統(tǒng)功能異常［3］。研究表明，核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）∕細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）信號通路可介導淋巴細胞、血小板黏附到內皮細胞，從而引起炎癥級聯(lián)反應，加重腦損傷，在早期腦損傷炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用［4］。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）可減少圍術期血壓波動，降低PE并發(fā)癥發(fā)生率，具有一定的腦保護作用［5］。然而，其是否基于NF-κB∕ICAM-1通路實現(xiàn)對腦神經的保護作用有待進一步探究。本研究通過構建PE大鼠模型，探究右美托咪定對PE大鼠的神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康成年雌性SD大鼠50只購自廣東省動物中心，體質量220～240 g。大鼠飼養(yǎng)于本院動物房，環(huán)境清潔、安靜，通風良好，溫度25℃，相對濕度50%～60%，自由飲食，嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》進行飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑與儀器 DEX購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司（批號12122501，規(guī)格2 mL∕200μg）；S100B、鐵蛋白、白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒，TUNEL染色試劑盒，TTC染色試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；兔源GAPDH、ICAM-1、NF-κB、p-NF-κB一抗購自美國Abcam公司（貨號：ab206386、ab171123、ab218533、ab247871）；BCA標準蛋白試劑盒購自美國Thermo Scientific Piece公司。RM2035輪轉切片機（德國Leica公司）；SMZ745光學顯微鏡（日本尼康公司）；-80℃低溫冰箱購自美國Thermo公司；Synergy2多功能酶標儀購自美國Bio Tek公司；1658033小型蛋白垂直電泳轉印系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；GelSMART凝膠成像儀（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠模型制備及分組給藥 將確定妊娠的50只SD大鼠按隨機數字表法分為：對照組，模型組，DEX低、中、高劑量組，每組10只。除對照組外，其余孕鼠參照文獻［6］制備PE大鼠模型：于妊娠第10～20天，每日腹腔注射200 mg∕kg的同型半胱氨酸（Hcy，美國Sigma公司），隔日背部皮下注射1 g∕kg的谷氨酸單鈉（MSG，美國Sigma公司）；對照組按照上述方法注射10 mL∕kg體積的生理鹽水。

在妊娠第10～20天，DEX低、中、高劑量組分別腹腔注射7.5、15.0、30.0μg∕kg DEX（給藥時間在Hcy及MSG給藥后2 h），模型組和對照組腹腔注射10 mL∕kg體積的生理鹽水，每日1次，持續(xù)10 d。

1.2.2 行為學缺損評分 末次給藥結束24 h，參照文獻［7］采用改良神經功能缺損評分法對大鼠行為學變化進行雙盲評分?？偡?8分，分數越高，其神經功能損傷越嚴重。

1.2.3 樣本采集 末次給藥結束24 h，麻醉大鼠，取每只大鼠的腦脊液（150μL），然后迅速斷頭處死，取出左右海馬組織，分成2部分，一部分固定于4%甲醛溶液中備用，另一部分置于-80℃保存。

1.2.4 腦脊液中S100B、鐵蛋白及腦組織中炎性因子水平檢測 ELISA法檢測腦脊液中S100B和鐵蛋白表達水平，取1.2.3中冷凍海馬組織，勻漿后分離上清液，ELISA法檢測大鼠海馬組織炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達水平，嚴格按照說明書操作步驟進行。

1.2.5 TUNEL染色法檢測腦組織細胞凋亡情況 取1.2.3中固定的腦組織，常規(guī)制備石蠟切片，TUNEL試劑盒染色后，在顯微鏡下（×200）觀察細胞凋亡情況，棕黃色細胞為凋亡細胞。Image-Pro Plus 6.0軟件分析每視野下凋亡細胞數目，根據公式計算細胞凋亡比例，凋亡比例=凋亡細胞數目∕總細胞數目×100%。

1.2.6 Western blot檢測腦組織NF-κB∕ICAM-1通路蛋白表達水平 取1.2.3中冷凍海馬組織，加入裂解液充分裂解，勻漿后，4℃離心20 min，收集上清液，得到蛋白樣品液，利用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，煮沸變性后，各組分別取含相同質量總蛋白的樣品液上樣，進行SDS-PAGE，分離蛋白，濕轉，將全部蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入兔源GAPDH、ICAM-1、NF-κB、p-NF-κB一抗溶液中，4℃孵育過夜，TBST漂洗，加入羊抗兔二抗室溫孵育2 h，TBST再次漂洗，采用增強化學發(fā)光法顯色，將條帶置于凝膠成像儀中拍照，并以Image J軟件分析圖片，得出各蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數據采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DEX對大鼠行為學的影響 對照組，模型組，DEX低、中、高劑量組行為學評分（單位：分）分別為0.56±0.18、7.12±1.14、5.15±1.23、3.74±1.24、2.45±0.95，差異有統(tǒng)計學意義（n=10，F(xiàn)=59.528，P＜0.01），與對照組相比，模型組大鼠行為學缺損評分顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，DEX低、中、高劑量組大鼠行為學缺損評分依次降低（P＜0.05）。

2.2 DEX對大鼠腦脊液中S100B和鐵蛋白水平的影響 與對照組相比，模型組大鼠腦脊液中S100B與鐵蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX低、中、高劑量組大鼠腦脊液中S100B與鐵蛋白表達水平依次降低（P＜0.05）。見表1。

Tab.1 Comparison of the levels of S100B and ferritin in the cerebrospinal fluid between the five groups of rats表1 各組大鼠腦脊液中S100B和鐵蛋白水平比較（n=10，ng∕L，±s）

Tab.1 Comparison of the levels of S100B and ferritin in the cerebrospinal fluid between the five groups of rats表1 各組大鼠腦脊液中S100B和鐵蛋白水平比較（n=10，ng∕L，±s）

**P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與DEX低劑量組比較，d與DEX中劑量組比較，P＜0.05

組別對照組模型組DEX低劑量組DEX中劑量組DEX高劑量組F S100B 298.34±12.16445.21±18.64a 413.25±16.22ab 375.38±17.34abc 330.14±15.27bcd 137.838**鐵蛋白1021.66±85.471558.32±108.63a 1426.54±112.39ab 1302.96±98.26abc 1165.24±89.32bcd 45.133**

2.3 DEX對大鼠腦組織細胞凋亡的影響 與對照組（1.07%±0.08%）相比，模型組大鼠腦組織細胞凋亡比例（37.22%±3.11%）顯著增高（P＜0.05），DEX低（29.77%±2.07%）、中（18.56%±1.55%）、高（9.09%±1.14%）劑量組較模型組明顯下降（n=10，F(xiàn)=614.013，P＜0.05），高劑量組細胞凋亡比例最低。見圖1。

2.4 DEX對大鼠腦海馬組織炎性因子的影響 與對照組相比，模型組大鼠腦組織中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達水平顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，DEX低、中、高劑量組大鼠腦組織中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達水平依次下降（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Comparison of the expression levels of inflammatory factors in brain tissues of rats between thefive groups表2 各組大鼠腦組織中炎性因子表達水平比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels of inflammatory factors in brain tissues of rats between thefive groups表2 各組大鼠腦組織中炎性因子表達水平比較（n=10，±s）

**P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與DEX低劑量組比較，d與DEX中劑量組比較，P＜0.05

組別對照組模型組DEX低劑量組DEX中劑量組DEX高劑量組F IL-1β（ng∕L）210.64±27.25416.82±28.59a 382.88±25.33ab 350.45±26.24abc 315.32±25.85bcd 88.097**TNF-α（μg∕L）1.22±0.252.96±0.63a 2.45±0.34ab 1.95±0.36abc 1.48±0.23bcd 33.081**IL-6（ng∕L）235.36±30.24394.35±28.46a 358.41±27.56ab 316.38±27.61abc 276.72±29.43bcd 48.581**

Fig.1 Comparison of TUNEL staining of rat brain tissue between the five groups(×200)圖1 各組大鼠腦組織TUNEL染色比較（×200）

2.5 DEX對大鼠腦組織NF-κB∕ICAM-1通路蛋白表達的影響 與對照組相比，模型組大鼠腦組織p-NF-κB∕NF-κB、ICAM-1蛋白表達水平顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，DEX低、中、高劑量組大鼠腦組織p-NF-κB∕NF-κB、ICAM-1蛋白表達水平依次下降（P＜0.05）。見圖2、表3。

Fig.2 Western blot detection of NF-κB∕ICAM-1 pathway related protein expression in brain tissue of the five groups圖2 Western blot檢測各組大鼠腦組織NF-κB∕ICAM-1通路相關蛋白表達

Tab.3 Comparison of protein expression levels of NF-κB/ICAM-1 pathway in brain tissue of rats between the five groups表3 各組大鼠腦組織NF-κB/ICAM-1通路蛋白表達水平比較 （n=10，±s）

Tab.3 Comparison of protein expression levels of NF-κB/ICAM-1 pathway in brain tissue of rats between the five groups表3 各組大鼠腦組織NF-κB/ICAM-1通路蛋白表達水平比較 （n=10，±s）

**P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與DEX低劑量組比較，d與DEX中劑量組比較，P＜0.05

組別對照組模型組DEX低劑量組DEX中劑量組DEX高劑量組F p-NF-κB∕NF-κB 0.28±0.051.21±0.08a 0.88±0.06ab 0.54±0.04abc 0.32±0.03bcd 520.367**ICAM-1∕GAPDH 0.23±0.041.34±0.09a 1.13±0.08ab 0.68±0.04abc 0.26±0.05bcd 622.203**

3 討論

3.1 DEX對PE腦損傷的影響 臨床上，DEX的神經保護作用已得到充分證實，并應用于神經外科等相關領域。子癇是妊娠高血壓疾病伴隨神經損傷癥狀出現(xiàn)的嚴重并發(fā)癥，會對神經系統(tǒng)造成一定損傷，影響患者行為活動。研究表明，PE患者的子癇發(fā)作受到復雜的腦血管病變、代謝異常和一些細胞因子變化的影響［8］。腦脊液占成年哺乳動物大腦細胞外液的50%，其成分反映了中樞神經系統(tǒng)中發(fā)生的生化反應［9］。腦脊液中細胞因子的變化可反映腦損傷狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組較對照組大鼠行為學評分顯著增加（屬中度神經損傷），腦脊液中S100B與鐵蛋白表達水平顯著升高，說明PE大鼠存在神經損傷，也反映了PE大鼠模型制備成功；給予DEX后，DEX低、中、高劑量組較模型組大鼠行為學評分依次下降，腦脊液中S100B與鐵蛋白表達水平依次降低，說明DEX能夠抑制大鼠腦脊液中S100B與鐵蛋白的表達，對神經損傷具有改善作用，提示其有減輕PE腦損傷的作用。

3.2 PE損傷機制 全身炎癥反應是PE的主要發(fā)病機制，促炎因子與抗炎因子的調控失衡是PE發(fā)生和發(fā)展的關鍵［10］。本研究中，模型組大鼠腦組織神經細胞凋亡嚴重，且海馬區(qū)炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達水平顯著高于對照組，說明PE造成腦組織內嚴重的炎癥反應，導致上述因子表達失調，造成神經細胞凋亡。給予DEX治療后，低、中、高劑量組較模型組的細胞凋亡數目大大減少，上述因子表達水平顯著降低，且DEX高劑量組效果最好，說明DEX能減輕PE大鼠腦組織中炎癥反應，抑制炎性因子升高，進而抑制腦組織神經細胞凋亡，改善PE造成的神經功能損傷。

NF-κB為一種序列特異的轉錄因子，作為信號傳導中樞，與免疫應答、腫瘤發(fā)展、細胞凋亡、胚胎發(fā)育等關系密切［11］。p-NF-κB在腦損傷時會促進ICAM-1、炎性因子和白細胞介素的表達，共同參與腦損傷后炎癥反應，p-NF-κB促進下游ICAM-1的表達，ICAM-1表達升高能夠正反饋調節(jié)NF-κB，誘導NF-κB活 化，激 活NF-κB∕ICAM-1通 路［12-13］。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員，能夠與其配體結合，從而介導白細胞與內皮細胞緊密連接，增加白細胞與內皮細胞黏附力，進而白細胞透過血管壁，破壞血管局部微循環(huán)通透性，增加細胞通透性，造成組織水腫，加速白細胞聚集［14］；同時，聚集的白細胞在血管壁處造成微血管梗阻，導致腦血液微循環(huán)障礙，加重腦損傷［15］。Shi等［16］研究發(fā)現(xiàn)，PE大鼠中硫酸鎂發(fā)揮腦神經保護作用的靶點為NF-κB∕ICAM-1通路。本研究中，給予DEX治療后，DEX低、中、高劑量組較模型組大鼠腦組織p-NF-κB∕NF-κB蛋白表達水平依次下降，且與血管壁白細胞聚集、腦血液微循環(huán)有關的細胞因子ICAM-1表達也依次降低，提示DEX可能通過抑制NF-κB∕ICAM-1通路活化，進而抑制PE大鼠腦組織中炎癥反應，減輕神經損傷程度。

綜上所述，DEX可降低炎性因子水平，減少腦細胞凋亡，進而改善神經功能，從而達到治療子癇大鼠的目的。這一過程可能與抑制NF-κB∕ICAM-1通路活化有關。后續(xù)將使用NF-κB∕ICAM-1通路抑制劑及激活劑進一步驗證。