槲皮素對胃癌相關(guān)p53∕AMPK∕mTOR信號通路的影響

李欣，林明哲，趙久達(dá)

胃癌是常見的腫瘤之一，發(fā)病原因與不良習(xí)慣及細(xì)菌感染有關(guān)［1］。槲皮素（quercetin，QE）是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗癌、抗氧化等多種作用。研究顯示，QE可呈時間和劑量依賴性地抑制人肺腺癌細(xì)胞的增殖，并可能通過上調(diào)P53蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞的凋亡［2］。另有研究顯示，QE可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的自噬而起到抗癌作用［3］。然而，目前有關(guān)QE對胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制并不十分明確。有研究顯示，p53信號通路是抑癌通路，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；腺苷酸激活蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）與細(xì)胞自噬有關(guān)，也是調(diào)控腫瘤細(xì)胞的信號通路；AMPK和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路存在交叉作用，而mTOR也參與腫瘤細(xì)胞自噬過程［4］。目前，關(guān)于p53∕AMPK∕mTOR信號通路與胃癌關(guān)系的相關(guān)研究少見。本實驗旨在探討QE對p53∕AMPK∕mTOR信號通路的影響及其抗腫瘤作用機(jī)制，以期為胃癌治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 QE購自上海同田科技有限公司。酶標(biāo)儀（型號：9602；上海名元科技有限公司），流式細(xì)胞儀（型號：S3e；美國Bio-Rad Laboratories公司），熒光定量PCR儀（型號：ABI6000；美國thermo公司），Western blot濕電轉(zhuǎn)膜儀（型號：E-BLOTTER；美國Protein Simple公司），恒溫培養(yǎng)箱（型號：QP-160；濟(jì)南來寶醫(yī)療科技有限公司）。人體胃癌細(xì)胞SGC-7901（美國ATCC細(xì)胞庫）；DMEM培養(yǎng)基（上海哈靈生物有限公司）；青∕鏈霉素（貴州賽蘭博科技有限公司）；MTT試劑盒（上海歌凡生物有限公司）；自噬檢測試劑盒、凋亡檢測試劑盒（美國Sigma公司）；SYBR Premix EX Taq試劑盒（武漢科昊佳生物科技有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、一抗抗體P53、AMPK、mTOR、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ及內(nèi)參β-肌動蛋白（β-actin），二抗HRP-羊抗兔IgG（上海艾博抗有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將胃癌細(xì)胞接種到制備好的培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。當(dāng)胃癌原代細(xì)胞培養(yǎng)至第3代對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗研究，期間各組細(xì)胞均以相同條件（37℃、5%CO2）培養(yǎng)。QE組以DMSO為溶劑，將QE配制成0.02、0.04、0.06及0.08 mmol∕L溶液對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，分別對應(yīng)QEA、QEB、QEC、QED組；溶劑組加入等量不含QE的溶劑。

1.2.2 MTT實驗檢測細(xì)胞增殖水平 取第3代對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種至6孔板，調(diào)整密度為2×104個∕mL，每孔100μL，在37℃溫箱中培養(yǎng)。細(xì)胞完全貼壁后，按1.2.1分組處理細(xì)胞，每組設(shè)6個復(fù)孔，溫箱培養(yǎng)12、24、48 h時移除孔板中的培養(yǎng)液，按照MTT說明書操作并檢測波長490 nm處的光密度（OD490）值。計算各個時點各組胃癌細(xì)胞抑制率=（1-實驗組OD∕對照組OD）×100%。

1.2.3 MDC染色法檢測胃癌細(xì)胞自噬 按照1.2.1分組處理細(xì)胞后，將各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按照自噬檢測試劑盒說明書操作，并于熒光顯微鏡（×3000）下觀察并拍照，計算積分光密度值（IOD），IOD=染色的像素點強(qiáng)度值累加值∕所選區(qū)域面積（A）。

1.2.4 雙染法檢測胃癌細(xì)胞凋亡率 取第3代對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔約2×105個細(xì)胞。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，根據(jù)1.2.1將細(xì)胞分組處理，培養(yǎng)48 h，然后用0.25%胰酶消化細(xì)胞，1000 r∕min離心5 min，棄上清液。4℃預(yù)冷的70%乙醇固定，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個∕mL，加入染色劑10 mL，置于4℃冰箱中染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況，細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞∕細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測p53、AMPK及mTOR的mRNA相對表達(dá)水平 采用Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。反應(yīng)體系20μL：SYBR Premix EX Taq試劑盒中的MonAmp SYBR預(yù)混液10μL，上下游引物各0.4μL，cDNA模板1μL，無核酸酶純水8.2μL。反應(yīng)條件：95℃2 min；95℃15 s，60℃45 s，45個循環(huán)；60℃45 s。U6mRNA水平作為內(nèi)參對結(jié)果進(jìn)行歸一化。將配置好的反應(yīng)體系放置在熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。引物由上海生工合成。記錄各孔Ct值，以2-ΔΔCt來計算mRNA相對表達(dá)水平。基因引物序列，見表1。

Tab.1 Primer sequences of related genes表1 相關(guān)基因引物序列

1.2.6 Western blot檢測LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ、P53、AMPK、mTOR蛋白表達(dá)情況 將胃癌細(xì)胞按1.2.1分組處理，培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取。將樣品放在沸水中加熱至蛋白完全變性，取出樣品冷卻至室溫，取30μg進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜。常溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，輕輕搖動，加入一抗anti-P53、anti-AMPK、anti-mTOR、anti-LC3-Ⅰ及anti-LC3-Ⅱ（均1∶1000）于4℃孵育過夜，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3次，每次10 min，加入二抗（1∶2000）常溫下孵育1 h，PBS清洗3次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光法顯影處理、拍照，以βactin作為內(nèi)參蛋白。Image J（v1.7.0）軟件對條帶進(jìn)行定量分析，蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值∕參照蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法，組內(nèi)各時間點比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組胃癌細(xì)胞抑制率比較 12、24及48 h時，QE對胃癌細(xì)胞的抑制率均呈濃度依賴性增高，且各組內(nèi)隨干預(yù)時間的延長抑制率亦逐漸增高（P＜0.05），見表2。

2.2 各組細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡率比較 隨著QE濃度增加，胃癌細(xì)胞自噬程度和凋亡率均呈濃度依賴性增加（P＜0.05），見表3，圖1、2。

2.3 各組p53、AMPK及mTOR的mRNA相對表達(dá)水平比較 隨著QE濃度增加，胃癌細(xì)胞中p53、AMPKmRNA相對表達(dá)水平均呈濃度依賴性增加，而mTORmRNA相對表達(dá)水平呈濃度依賴性降低（P＜0.05），見表4。

Tab.2 Comparison of inhibition rates of gastric cancer cells between the four groups表2 各組胃癌細(xì)胞抑制率比較（n=6，%，±s）

Tab.2 Comparison of inhibition rates of gastric cancer cells between the four groups表2 各組胃癌細(xì)胞抑制率比較（n=6，%，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01；a與QEA組比較，b與QEB組比較，c與QEC組比較，P＜0.05；A與12 h比較，B與24 h比較，P＜0.05

組別QEA組QEB組QEC組QED組F 12 h 9.511±1.48114.621±1.532a 26.032±2.951ab 39.861±3.423abc 174.881**24 h 14.782±1.344A 27.472±3.012aA 37.823±3.402abA 54.801±1.931abcA 179.793**48 h 17.584±1.541AB 42.074±2.452aAB 60.324±3.993abAB 70.474±1.933abcAB 462.472**F 13.424*257.004**254.853**142.361**

2.4 各組LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ、P53、AMPK及mTOR的蛋白相對表達(dá)水平比較 隨著QE濃度增加，胃癌細(xì)胞中LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ、P53、AMPK相對表達(dá)水平均呈濃度依賴性增加，而mTOR相對表達(dá)水平呈濃度依賴性降低（P＜0.05），見表5、圖3。

Tab.3 Comparison the effects of autophagy and apoptosis rates of gastric cancer cells between the five groups表3 各組細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡率的比較（n=6，±s）

Tab.3 Comparison the effects of autophagy and apoptosis rates of gastric cancer cells between the five groups表3 各組細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡率的比較（n=6，±s）

**P＜0.01；a與溶劑組比較，b與QEA組比較，c與QEB組比較，d與QEC組比較，均P＜0.05；表4、5同

細(xì)胞凋亡率（%）2.642±0.3226.473±1.544a 13.413±2.273ab 23.293±3.694abc 41.685±3.415abcd 224.093**組別溶劑組QEA組QEB組QEC組QED組F細(xì)胞自噬（IOD）0.331±0.0510.532±0.083a 0.713±0.092ab 0.932±0.112abc 1.121±0.072abcd 83.652**

Fig.1 Comparison of autophagy in gastric cancer cells(MDC staining,×200)圖1 胃癌細(xì)胞自噬比較（MDC染色，×200）

Fig.2 Effects of different concentrations of quercetin on cell apoptosis rate圖2 不同濃度QE對細(xì)胞凋亡率的影響

Tab.4 mRNA relative expression levels of p53,AMPK and mTOR in each group表4 各組p53、AMPK及mTOR的mRNA相對表達(dá)水平（n=6，±s）

Tab.4 mRNA relative expression levels of p53,AMPK and mTOR in each group表4 各組p53、AMPK及mTOR的mRNA相對表達(dá)水平（n=6，±s）

組別溶劑組QEA組QEB組QEC組QED組F p53 1.741±0.1422.372±0.271a 2.881±0.253ab 3.232±0.173abc 3.582±0.224abcd 68.161**AMPK 0.674±0.0721.063±0.113a 1.694±0.232ab 2.324±0.213abc 3.043±0.292abcd 138.052**mTOR 1.933±0.1231.273±0.092a 0.692±0.114ab 0.443±0.062abc 0.344±0.052abcd 328.332**

Tab.5 Comparison of protein expression of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand p53/AMPK/mTOR signaling pathway between the five groups表5 各組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p53/AMPK/mTOR信號通路蛋白表達(dá)的比較 （n=6，±s）

Tab.5 Comparison of protein expression of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand p53/AMPK/mTOR signaling pathway between the five groups表5 各組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p53/AMPK/mTOR信號通路蛋白表達(dá)的比較 （n=6，±s）

組別溶劑組QEA組QEB組QEC組QED組F LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ0.361±0.0411.872±0.131a 2.123±0.212ab 2.382±0.174abc 2.581±0.314abcd 728.532**P530.921±0.0421.312±0.061a 1.571±0.081ab 1.682±0.152abc 1.813±0.143abcd 69.124**AMPK 0.323±0.0330.532±0.043a 0.893±0.122ab 1.222±0.091abc 1.561±0.131abcd 183.954**mTOR 0.943±0.0630.693±0.041a 0.372±0.113ab 0.241±0.021abc 0.181±0.024abcd 165.932**

Fig.3 Comparison of LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ,p53∕AMPK∕mTOR signaling pathway proteins圖3 LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ、p53∕AMPK∕mTOR信號通路蛋白比較

3 討論

胃癌細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移是大多數(shù)胃癌患者的主要死亡原因。有關(guān)QE對胃癌的抗腫瘤作用研究主要集中在對胃癌細(xì)胞生長、增殖及凋亡的影響及其可能作用機(jī)制［5］，但目前關(guān)于其對腫瘤細(xì)胞自噬的研究較少。細(xì)胞的增殖、自噬和凋亡是非常重要的生理過程，正常情況下細(xì)胞的增殖會受到自身限制，自噬程度較低，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象正常，三者共同調(diào)控細(xì)胞生理過程。然而，在腫瘤細(xì)胞中這些平衡會被打破，腫瘤細(xì)胞增殖速度異常增加，凋亡水平下降。

P53蛋白能夠活化DNA修復(fù)蛋白，從而抑制腫瘤的發(fā)生［6］。研究顯示，活化的DNA修復(fù)蛋白能接合于DNA，啟動Bax、P21等多個基因表達(dá)，使p21蛋白與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDK2）形成復(fù)合體，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［7］。P53也可以調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，AMPK信號通路與mTOR通路存在交叉，mTOR含有2種復(fù)合體mTORC1和mTORC2；P53可以激活A(yù)MPK，活化的AMPK會使mTORC1的表達(dá)下調(diào)，同時會活化UNC-51樣激酶1（ULK1），誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬［8］。自噬主要功能是降解過大的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并通過重復(fù)利用氨基酸來維持細(xì)胞功能，使細(xì)胞在饑餓條件下存活［9］。自噬開始后，ULK1磷酸化并激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）復(fù)合物，在新生的自噬體膜上形成含有自噬相關(guān)蛋白（ATG）9的吞噬膜。在ATG4、ATG7和ATG3的活化作用下，LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ，LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ比值的大小可估計自噬水平的高低［10］。本研究結(jié)果顯示，隨著QE濃度的增加和作用時間的延長，腫瘤細(xì)胞的抑制率均明顯增加；胃癌細(xì)胞自噬程度和凋亡率亦隨QE濃度增加而增加，表明QE濃度越高，細(xì)胞自噬和凋亡也越明顯。既往研究認(rèn)為，QE具有抗氧化作用，可影響體內(nèi)金屬離子（Zn2+、Fe2+等）平衡，調(diào)節(jié)代謝狀態(tài)，并已在直腸癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞中得到證實［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，QE可調(diào)控Wnt∕β-catenin、P38 AMPK等多個信號通路［13-14］。李蔚等［14］研究發(fā)現(xiàn)，QE可以通過Wnt∕β-catenin信號通路促進(jìn)伊馬替尼（IM）敏感細(xì)胞K562和耐藥細(xì)胞K562R的凋亡。王象鵬等［15］研究發(fā)現(xiàn)，QE可以通過調(diào)控P38∕AMPK信號通路，降低骨關(guān)節(jié)細(xì)胞中炎性因子的表達(dá)。文蘭香等［16］研究發(fā)現(xiàn)，QE可以通過AMPK∕mTOR通路影響細(xì)胞自噬。Siaw等［17］研究發(fā)現(xiàn)，QE可以活化mTOR，促進(jìn)L1929纖維細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，隨著QE濃度增加，胃癌細(xì)胞中p53、AMPK mRNA和蛋白相對表達(dá)水平均呈濃度依賴性增加，而mTOR mRNA和蛋白相對表達(dá)水平呈濃度依賴性降低，表明QE可通過p53∕AMPK∕mTOR信號通路抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞自噬水平，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。另有動物實驗研究亦顯示，QE能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞的增殖，證實QE可通過抑制PI3K∕Akt通路誘導(dǎo)線粒體凋亡［18-19］。

綜上所述，QE可通過激活p53∕AMPK∕mTOR信號通路，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞自噬水平，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。