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      SIRT3-FOXO1介導(dǎo)自噬在H9C2心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用

      2021-12-06 06:54:26王尚徐林先和
      天津醫(yī)藥 2021年11期
      關(guān)鍵詞:乙?;?/a>培養(yǎng)箱高糖

      王尚徐,林先和

      急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是由于心臟冠狀動(dòng)脈狹窄、閉塞而導(dǎo)致的心肌急性缺血缺氧[1]。急診介入手術(shù)可迅速疏通病變的血管,恢復(fù)缺血心肌的血氧供應(yīng),是目前治療時(shí)間窗內(nèi)AMI的主要治療方法[2]。然而,在血供恢復(fù)的同時(shí),缺血部位血流的再灌注也會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞造成額外的損傷,稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)。MIRI涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體功能紊亂和細(xì)胞內(nèi)鈣超載,并可通過細(xì)胞凋亡發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞死亡[3-4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類3(silent mating type information regulator 2 homolog 3,SIRT3)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙?;?,為線粒體蛋白去乙?;闹饕{(diào)節(jié)因子[5]。已有研究發(fā)現(xiàn),在MIRI過程中,SIRT3通過激活A(yù)MPK-mTOR、FOXO3a-Pink1-Parkin通路激活自噬,同時(shí)也可通過SIRT3-SOD2-mROS通路抑制自噬過程[6]。叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O1(forkhead box O1,F(xiàn)OXO1)參與細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡和自噬,并且響應(yīng)細(xì)胞刺激,發(fā)揮維持組織穩(wěn)態(tài)的作用[7]。既往研究發(fā)現(xiàn),SIRT3可通過促使FOXO1去乙酰化來誘導(dǎo)自噬,從而改善心肌細(xì)胞肥大現(xiàn)象[8]。目前有關(guān)SIRT3-FOXO1調(diào)控自噬在MIRI過程中發(fā)揮作用的研究甚少,本研究在細(xì)胞水平構(gòu)建MIRI模型,旨在探究SIRT3-FOXO1通路在MIRI過程中的作用。

      1 材料與方法

      1.1 細(xì)胞系、主要試劑及儀器 大鼠H9C2心肌細(xì)胞及高糖DMEM培養(yǎng)基購自武漢普諾賽公司。慢病毒感染試劑盒購自上海漢恒公司,SIRT3抑制劑3-TYP購自GLPBIO公司,乙?;疐OXO1(Ac-FOXO1)抗體購自賽默飛公司,SIRT3抗體及GAPDH抗體購自Affinity公司,LC3B抗體及Beclin1抗體購自Cell Signaling公司,Bcl-2抗體及Bax抗體分別購自Bioss公司和Abcam公司。逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司。Annexin V-APC∕7-AAD熒光雙染凋亡試劑盒購自Elabscience公司,乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自日本世諾公司,倒置熒光顯微鏡購自蔡司公司,流式細(xì)胞儀及全自動(dòng)生化儀分別購自貝克曼和日立公司。

      1.2 SIRT3穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建及效果驗(yàn)證 大鼠H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中,同時(shí)準(zhǔn)備無糖DMEM培養(yǎng)基(不含胎牛血清及抗生素)用于模擬缺血處理。所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在缺血再灌注干預(yù)前均置于普通培養(yǎng)箱(95%空氣,5%CO2,37℃)中培養(yǎng)。選擇生長狀況良好的H9C2心肌細(xì)胞,分為SIRT3過表達(dá)組和空病毒對(duì)照組,分別用帶有SIRT3+綠色熒光蛋白(GFP)基因和只帶GFP基因的病毒,以感染復(fù)數(shù)(MOI)值=40進(jìn)行慢病毒感染72 h,嘌呤霉素(1 mg∕L)篩選后獲得SIRT3穩(wěn)定過表達(dá)株。倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。采用qPCR檢測SIRT3過表達(dá)效果。Trizol法提取細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行qPCR反應(yīng)。SIRT3引物上游5'-GGTCCAGCTAGGGGATGTAGT-3',下游5'-CCCGCAGGTGAAGAAGTAAG-3'。內(nèi)參β-actin引物上游5'-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3',下游5'-CCTTCTGACCCATACCCACC-3'。20μL反應(yīng)體系包含TB Green Premix Ex TaqⅡ(2×)10μL,上、下游引物(10μmol∕L)各0.8μL,cDNA(50μg∕L)2.0μL,滅菌水6.4μL。反應(yīng)條件:95℃30 s;95℃5 s,60℃30 s,40個(gè)循環(huán)。SIRT3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法進(jìn)行半定量分析。

      1.3 體外構(gòu)建缺血再灌注損傷模型及實(shí)驗(yàn)分組 H9C2細(xì)胞設(shè)正常對(duì)照(NC)組、缺血再灌注(IR)組、SIRT3過表達(dá)+缺血再灌注(S+IR)組、SIRT3過表達(dá)+IR+SIRT3抑制劑(S+IR+3-TYP)組。NC組細(xì)胞置于普通培養(yǎng)箱中添加高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。IR組細(xì)胞置于缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(1%O2,5%CO2,37℃)中,添加無糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h;隨后更換為高糖DMEM培養(yǎng)基,置于普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。S+IR組將SIRT3過表達(dá)的H9C2心肌細(xì)胞用無糖DMEM培養(yǎng)基缺氧培養(yǎng)3 h,隨后更換為高糖DMEM培養(yǎng)基,置于普通培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。S+IR+3-TYP組將SIRT3過表達(dá)的H9C2心肌細(xì)胞置于含有3-TYP(50μmol∕L)無糖DMEM培養(yǎng)基中,缺氧培養(yǎng)3 h,隨后更換為含3-TYP(50μmol∕L)的高糖DMEM培養(yǎng)基,在95%空氣,5%CO2,37℃條件下培養(yǎng)24 h。

      1.4 Western blot法檢測SIRT3、Ac-FOXO1、LC3B、Beclin1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 將RIPA和PMSF按100∶1比例混合,用于提取各組心肌細(xì)胞總蛋白。配制10%的SDS-PAGE分離膠,上樣進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶中封閉2 h。一抗SIRT3、Ac-FOXO1、LC3B、Bax(均為1∶1000稀釋),Beclin1、Bcl-2、GAPDH(均為1∶2000稀釋),4℃孵育過夜,TBST洗膜10 min×3次。二抗(1∶3000)孵育1 h,TBST洗膜后顯影。檢測SIRT3、Ac-FOXO1,自噬標(biāo)記蛋白LC3B、Beclin1及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)。

      1.5 上清液中LDH及細(xì)胞凋亡率檢測 收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液200μL,用全自動(dòng)生化儀檢測LDH水平。隨后用0.25%胰酶(不含EDTA)消化細(xì)胞,收集各組細(xì)胞沉淀。采用Annexin V-APC∕7-AAD熒光雙染凋亡試劑盒處理細(xì)胞樣本,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

      1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0和Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行分析,每組實(shí)驗(yàn)最少進(jìn)行3次。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用Tukey檢驗(yàn),雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 慢病毒感染H9C2心肌細(xì)胞的GFP表達(dá)及SIRT3過表達(dá)情況 慢病毒感染細(xì)胞72 h后,倒置熒光顯微鏡下可見SIRT3過表達(dá)組大量表達(dá)GFP,提示感染成功,見圖1。隨后經(jīng)qPCR驗(yàn)證,SIRT3過表達(dá)組SIRT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量(3.31±0.13)較空病毒對(duì)照組(1.00±0.14)升高(t=16.257,P<0.01),SIRT3過表達(dá)成功。

      Fig.1 The GFP expression of H9C2 cells infected with lentivirus(×100)圖1 慢病毒感染H9C2心肌細(xì)胞后的GFP表達(dá)(×100)

      2.2 各組H9C2細(xì)胞SIRT3、Ac-FOXO1蛋白表達(dá)水平比較 與NC組比較,IR組SIRT3表達(dá)降低,而Ac-FOXO1表達(dá)升高(P<0.05);與IR組比較,S+IR組SIRT3表達(dá)升高,而Ac-FOXO1表達(dá)降低(P<0.05);S+IR+3-TYP組較S+IR組SIRT3表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但Ac-FOXO1表達(dá)升高(P<0.05),見圖2、表1。

      Fig.2 Expressions of SIRT3,Ac-FOXO1,LC3B,Beclin1,Bcl-2 and Bax protein detected by Western blot assay in the four groups圖2 Western blot檢測各組細(xì)胞SIRT3、Ac-FOXO1、LC3B、Beclin1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

      Tab.1 Comparison of expression levels of SIRT3 and Ac-FOXO1 between the four groups表1 各組細(xì)胞SIRT3、Ac-FOXO1蛋白表達(dá)水平比較(n=3,±s)

      Tab.1 Comparison of expression levels of SIRT3 and Ac-FOXO1 between the four groups表1 各組細(xì)胞SIRT3、Ac-FOXO1蛋白表達(dá)水平比較(n=3,±s)

      **P<0.01;a與NC組比較,b與IR組比較,c與S+IR組比較,P<0.05

      組別NC組IR組S+IR組S+IR+3-TYP組F SIRT31.15±0.050.80±0.05a 1.06±0.09b 0.99±0.157.974**Ac-FOXO10.60±0.050.75±0.02a 0.60±0.07b 0.76±0.04c 10.080**

      2.3 各組細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與NC組比較,IR組自噬標(biāo)記蛋白LC3B、Beclin1表達(dá)升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低,促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高(均P<0.05);與IR組比較,S+IR組LC3B、Beclin1、Bcl-2表達(dá)升高,Bax表達(dá)降低(均P<0.05);與S+IR組比較,S+IR+3-TYP組LC3B、Beclin1、Bcl-2表達(dá)降低,Bax表達(dá)升高(均P<0.05),見圖2、表2。

      Tab.2 Comparison of expression levels of autophagy marker proteins and apoptosis-related proteins between the four groups表2 各組細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較(n=3,±s)

      Tab.2 Comparison of expression levels of autophagy marker proteins and apoptosis-related proteins between the four groups表2 各組細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較(n=3,±s)

      **P<0.01;a與NC組比較,b與IR組比較,c與S+IR組比較,P<0.05

      組別NC組IR組S+IR組S+IR+3-TYP組F LC3B 0.62±0.030.88±0.10a 1.14±0.04ab 0.88±0.08ac 28.900**Beclin10.79±0.040.95±0.02a 1.27±0.07ab 1.06±0.04ac 63.190**Bcl-21.33±0.060.82±0.06a 1.27±0.04ab 1.07±0.11ac 30.930**Bax 0.80±0.071.04±0.11a 0.74±0.03b 0.93±0.03ac 11.730**

      2.4 各組細(xì)胞上清液LDH水平及細(xì)胞凋亡率的比較 與NC組比較,IR組細(xì)胞上清液LDH水平升高,細(xì)胞凋亡率升高;與IR組比較,S+IR組上清液LDH水平降低,細(xì)胞凋亡率下降;與S+IR組比較,S+IR+3-TYP組上清液LDH水平升高,細(xì)胞凋亡率升高(均P<0.05),見圖3、表3。

      3 討論

      已有研究證實(shí),SIRT3-FOXO3a、SIRT3-SOD等信號(hào)通路的激活可以減輕氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,從而改善MIRI[9-10]。同時(shí),SIRT3作為一種重要的去乙?;?,可促使FOXO1去乙酰化,增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)Bcl-2等抗凋亡基因的表達(dá)[11]。本研究發(fā)現(xiàn),在模擬心肌缺血再灌注過程中,H9C2細(xì)胞SIRT3表達(dá)下降,細(xì)胞中Ac-FOXO1表達(dá)增加,細(xì)胞凋亡率增加,細(xì)胞遭受損傷。過表達(dá)SIRT3后,Ac-FOXO1含量減少,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加,促凋亡蛋白Bax表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率降低。然而,使用SIRT3抑制劑3-TYP后,SIRT3表達(dá)水平不受影響,但活性受到抑制,乙?;疐OXO1含量增加,細(xì)胞凋亡率增加,損傷加重,SIRT3過表達(dá)發(fā)揮的保護(hù)作用被消除。本研究證實(shí)SIRT3在心肌缺血再灌注過程中使FOXO1去乙酰化發(fā)揮保護(hù)作用,與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-11]。過表達(dá)SIRT3基因后,同時(shí)伴隨自噬標(biāo)記蛋白LC3B、Beclin1表達(dá)量的進(jìn)一步增加;但使用SIRT3抑制劑3-TYP后,LC3B、Beclin1表達(dá)量下降,提示SIRT3-FOXO1通路在MIRI中的保護(hù)作用可能是通過調(diào)節(jié)自噬水平發(fā)揮的。

      Fig.3 Apoptosis was detected by flow cytometry in each group圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況

      Tab.3 Comparison of LDH level in cell supernatant and apoptosis rate between the four groups表3 各組細(xì)胞上清液LDH水平及凋亡率比較(n=3,±s)

      Tab.3 Comparison of LDH level in cell supernatant and apoptosis rate between the four groups表3 各組細(xì)胞上清液LDH水平及凋亡率比較(n=3,±s)

      **P<0.01;a與NC組比較,b與IR組比較,c與S+IR組比較,P<0.05

      組別NC組IR組S+IR組S+IR+3-TYP組F LDH水平(U∕L)14.00±2.6553.67±3.21a 35.33±2.52ab 50.67±1.53ac 152.000**凋亡率(%)6.61±1.2720.76±1.94a 11.36±0.74ab 20.09±1.58ac 67.650**

      細(xì)胞自噬是一種保守的細(xì)胞分解代謝途徑,當(dāng)受到外界損傷刺激時(shí),自噬可以將受損的蛋白質(zhì)乃至某些細(xì)胞器進(jìn)行回收利用,以利于細(xì)胞生存[12-13]。FOXO1具有關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性,在葡萄糖剝奪培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中,F(xiàn)OXO1被去磷酸化并定位于細(xì)胞核,促進(jìn)自噬通路基因如Atg12的表達(dá)[14]。FOXO1去乙?;梢哉T導(dǎo)自噬相關(guān)基因的表達(dá),在心肌細(xì)胞營養(yǎng)和能量不足的情況下減輕凋亡,發(fā)揮保護(hù)作用[15]。SIRT3可以與FOXO1結(jié)合使其去乙酰化,去乙?;腇OXO1轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核,激活下游的E3泛素連接酶促進(jìn)自噬的發(fā)生,減輕心肌肥厚[8]。自噬與凋亡關(guān)系密切,自噬可以抑制應(yīng)激反應(yīng)誘發(fā)的細(xì)胞凋亡,也可以通過抑制凋亡蛋白caspase的激活來阻斷凋亡,發(fā)揮保護(hù)作用,同時(shí)Bcl-2蛋白家族可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)凋亡和自噬[16]。本研究結(jié)果提示,SIRT3可能通過激活FOXO1去乙?;龠M(jìn)H9C2心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生,使Bcl-2蛋白的表達(dá)增加,Bax蛋白的表達(dá)減少,減少H9C2心肌細(xì)胞在缺血再灌注損傷中的凋亡。

      自噬在心肌缺血再灌注的不同階段發(fā)揮不同的作用。在心肌缺血階段,自噬通過降解損傷的蛋白,為蛋白質(zhì)和糖類的合成提供氨基酸,同時(shí)為三羧酸循環(huán)提供底物用于合成三磷酸腺苷(ATP),從而保護(hù)細(xì)胞免于死亡[17]。再灌注階段,自噬水平上調(diào),誘導(dǎo)細(xì)胞成分的進(jìn)行性消耗,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,過度的激活自噬反而對(duì)機(jī)體造成損傷。Beclin 1作為自噬的啟動(dòng)分子,在再灌注階段其表達(dá)減少后可引發(fā)自噬水平下調(diào),進(jìn)而減少細(xì)胞的凋亡[18]。Wu等[19]研究發(fā)現(xiàn),SIRT3的激活導(dǎo)致Beclin1和LC3Ⅱ∕LC3Ⅰ表達(dá)減少,抑制過度線粒體自噬,在缺氧復(fù)氧損傷過程中保護(hù)H9C2細(xì)胞。本研究與上述研究相比,除缺氧復(fù)氧時(shí)間不同外,在模擬缺血處理的過程時(shí),將高糖培養(yǎng)基更換為無糖培養(yǎng)基,因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同可能由于造模方法不同。由此可見,SIRT3、FOXO1與自噬在MIRI中的關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究,如何減少自噬相關(guān)性損傷,發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞的保護(hù)功能仍是一項(xiàng)難題。

      本研究為探究SIRT3-FOXO1通路、MIRI和自噬之間的聯(lián)系提供了新的線索,有助于加深對(duì)自噬調(diào)控的理解,為靶向自噬作為MIRI的新療法提供支持。本研究局限性在于未對(duì)FOXO1進(jìn)行抑制,不排除SIRT3通過其他通路發(fā)揮作用,后續(xù)將完善相關(guān)實(shí)驗(yàn),并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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