動(dòng)物腸道中硫化氫的生理生態(tài)調(diào)控作用

胡佳昕,廖新俤

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

數(shù)個(gè)世紀(jì)以來，來自下水道和化糞池的硫化氫(Hydrogen Sulfide,H2S)始終作為毒氣和環(huán)境污染物受到人們的關(guān)注。近年來越來越多的證據(jù)表明，H2S和NO、CO一樣，可以自由穿過生物膜并直接觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而參與機(jī)體內(nèi)的生理和病理過程，被認(rèn)為是第三種氣體信號分子。過去對H2S的研究多集中于吸入H2S引起的全身性毒理生理反應(yīng)，隨著對腸道微生態(tài)和各種腸道疾病機(jī)制的研究逐漸深入，腸道中H2S的生理學(xué)影響也成為了腸道研究中的重要一環(huán)。

1 H2S的理化性質(zhì)及來源

1.1 H2S的理化性質(zhì)

H2S是一種無色、易燃、有刺激性氣味的氣體，具有高度親脂性，能以自由擴(kuò)散的方式通過脂質(zhì)生物膜。H2S能溶于水，溶液呈弱酸性，存在如下平衡： H2S?H++HS-?2H++S2-(pKa1≈7.0，pKa2≈19)[1]。在動(dòng)物體內(nèi)，H2S主要以H2S和HS-形式存在，S2-的含量可忽略不計(jì)。H2S的存在形式與pH有關(guān)，生理?xiàng)l件(pH 7.4)下，約有70%的H2S以HS-形式存在；在呈堿性的線粒體基質(zhì)(pH 8.0)中，HS-的含量可達(dá)92%；在酸性的溶酶體(pH 4.7)中，99%以上的H2S都以游離的形式存在[2]。在細(xì)胞中，HS-多以不穩(wěn)定的鐵硫蛋白和相對穩(wěn)定的有機(jī)硫化物形式存在，這些硫化物和游離H2S共同構(gòu)成了被稱為活性硫物種(reactive sulfur species, RSS)的集合。

H2S中的硫?qū)?yīng)的是它的最低氧化態(tài)。由于六價(jià)電子的存在，硫的氧化態(tài)可從-2到+6，這也是硫具有廣泛的生物學(xué)功能的原因。H2S是一種還原物，氧化還原電位約等于-280 mV(pH=7.0，相對于標(biāo)準(zhǔn)氫電極)，這與谷胱甘肽二硫化物/谷胱甘肽(GSSG/GSH)還原對接近。硫的這種廣泛生物學(xué)功能可能與硫在地球生命的出現(xiàn)和演化過程中的重要作用有關(guān)[3]。

1.2 體內(nèi)H2S的來源

動(dòng)物腸道組織中的H2S主要來自腸道上皮細(xì)胞和硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacteria, SRB)的作用。

腸道上皮細(xì)胞主要通過胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase, CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)兩種途徑分解L-半胱氨酸，合成H2S[4]。此外，3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfotransferase, MST)及蛋氨酸-γ-裂解酶(methionine gamma-lyase, MGL)對蛋氨酸及半胱氨酸裂解反應(yīng)的催化亦能產(chǎn)生一定量的H2S。

SRB是一類能夠利用含硫氨基酸和硫酸鹽的嚴(yán)格厭氧菌，大多屬于δ-變形菌門，適宜生活于pH為5.5～8.5、溫度為24～42 ℃的環(huán)境，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的結(jié)腸中。在厭氧條件下，SRB通過一系列酶促反應(yīng)利用含硫氨基酸和硫酸鹽，以H2為底物產(chǎn)生H2S，反應(yīng)如下：4H2+SO42-+H+→HS-+4H2O[5]。有趣的事實(shí)是，SRB可能不僅影響腸道中的H2S濃度，也調(diào)節(jié)了體內(nèi)其他組織和器官中硫的代謝：相較于無菌小鼠，常規(guī)小鼠在血漿、脂肪組織和肺組織中均具有更高水平的RSS，并且有著更高的CSE活性及更低的半胱氨酸水平[6]。

2 H2S對腸道的生理學(xué)影響

H2S在腸道中通過影響腸黏膜血流、刺激碳酸氫鹽及黏液分泌等方式參與腸道黏膜防御過程[7]，同時(shí)也以不同方式影響著腸道微生物區(qū)系。目前關(guān)于H2S對腸道的影響最令人信服的“鐘形曲線”理論提出：較低和較高濃度的H2S都對細(xì)胞具有不利影響，在某一區(qū)間內(nèi)則表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖和維持腸道穩(wěn)態(tài)的有利作用。

結(jié)腸內(nèi)容物中的H2S濃度可高達(dá)0.2～3.4 mmol/L[8]。在這樣的濃度下，H2S很可能與來自食物的一些化合物如異硫氰酸酯、類黃酮或類胡蘿卜素等發(fā)生相互作用，并改變結(jié)腸上皮細(xì)胞對這些化合物的反應(yīng)。高濃度的H2S也能夠嚴(yán)重抑制細(xì)胞色素C氧化酶，從而抑制線粒體氧消耗，造成細(xì)胞缺氧。H2S損害結(jié)腸細(xì)胞對丁酸鹽的利用，并且刺激上皮細(xì)胞增殖、增加腸上皮通透性。值得注意的是，結(jié)腸內(nèi)容物中的硫化物并不總是以活潑的游離形式存在[9]。同時(shí)，結(jié)腸上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)的硫醌氧化還原酶(sulfide-quinone reductase, SQR)能夠強(qiáng)有力地將硫化物氧化成硫代硫酸鹽，這一機(jī)制保護(hù)了消化道及其他組織免受局部高H2S濃度的潛在不利影響[10]。

腸腔中H2S的濃度主要取決于飲食(十字花科植物、大蒜及發(fā)酵魚類均可提供高含量的硫化物)和SRB豐度，不同種類的動(dòng)物之間存在一定的差異。本實(shí)驗(yàn)室陸東東等研究發(fā)現(xiàn)，不同品種蛋雞盲腸內(nèi)容物體外發(fā)酵液中SO42-變化量及H2S排放量均存在差異，其中杏花雞顯著低于其他品種蛋雞[11]；而鄧遠(yuǎn)帆等在杜×長×大三元雜商品豬中開展的研究則表明，添加菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖一方面可作為碳水化合物的補(bǔ)充，減少含硫蛋白類物質(zhì)酵解，從而減少該途徑下H2S的生成；飼喂1%菊粉日糧45 d后，豬腸道內(nèi)SRB生長受到抑制，擬桿菌門細(xì)菌比例增加；同時(shí)減少了L-氧化半胱氨酸和丙酮酸途徑的H2S生成[12]。

2.1 結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer, CRC)是全球范圍內(nèi)最常見的消化道癌癥之一，在全球每年有超過60×104人直接或間接死于CRC。CRC與腸道微生物代謝產(chǎn)物間可能存在關(guān)聯(lián)：在抑制DNA修復(fù)功能的HT29-Cl.16E結(jié)腸細(xì)胞系中觀察到NaHS(20 μmol/L)能夠濃度依賴性地導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定(chromosomal instability, CIN)，而CIN存在于高達(dá)80%的CRC中，與癌細(xì)胞的進(jìn)化和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。同時(shí)，亦有報(bào)導(dǎo)同樣濃度的NaHS能通過上調(diào)Akt和ERK磷酸化、減少p21(Waf1/Cip1)表達(dá)和NO合成促進(jìn)另一種結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞的增殖[14]。

另一方面，發(fā)現(xiàn)NaHS(100 μmol/L)處理誘導(dǎo)了細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和p38 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化，抑制細(xì)胞活力。值得注意的是，抑制p38 MAPK活化進(jìn)一步加強(qiáng)了NaHS對細(xì)胞活力的抑制作用[15]。同樣在HCT116細(xì)胞上，發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)源H2S合成酶活性或提供線粒體靶向的H2S供體AP39(60 μmol/L)能夠抑制細(xì)胞增殖[16]。H2S對CRC細(xì)胞的作用符合“鐘形曲線”假說：靜止期結(jié)腸癌細(xì)胞位于曲線頂點(diǎn)右側(cè)，隨著H2S供體濃度增加細(xì)胞增殖受到抑制[17]。

2.2 炎癥性腸病

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括結(jié)腸和小腸的一系列炎性癥狀，主要包括克羅恩病(Crohn's disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)。IBD期間存在典型的腸道微生態(tài)失調(diào)，具體可表現(xiàn)為屬于厚壁菌門的保護(hù)性細(xì)菌如乳酸桿菌屬及雙歧桿菌屬的減少，而變形菌門、放線菌門和擬桿菌屬增加[18]。此外，活動(dòng)期和非活動(dòng)期患者之間也存在不同的生態(tài)失調(diào)，表明腸道菌群的改變與腸道的炎癥環(huán)境有關(guān)[19]。

在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)作期間，腸腔內(nèi)具有較高的H2S濃度和SRB豐度，并且與結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，尤其是D.desulfuricans和D.vulgaris的含量[20]。結(jié)腸炎期間的腸上皮屏障缺陷加重了SRB對腸黏膜的侵襲，激活腸上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中的Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)進(jìn)而造成腸道穩(wěn)態(tài)失衡和炎癥[21]。Pitcher等[22]研究證實(shí)，在活動(dòng)性UC患者中分離的SRB能導(dǎo)致腸腔內(nèi)更高水平的H2S，表明SRB對腸道炎癥的影響可能建立在H2S的增加上。利用三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎離體結(jié)腸段模型中發(fā)現(xiàn)，厭氧菌對腸道炎癥的發(fā)展起關(guān)鍵作用[23]。此外，SRB對廣譜抗生素的耐藥性可能與抗生素導(dǎo)致的腹瀉及腸道炎癥有關(guān)[24]，利用5-氨基水楊酸治療活動(dòng)性潰瘍性結(jié)腸炎時(shí)，觀察到降低的SRB活性[25]。

減少飲食中含硫氨基酸的含量似乎對結(jié)腸炎有益。最近一項(xiàng)關(guān)于小兒克羅恩病的研究顯示，H2S在線粒體氧化功能受損的患者中加重了炎癥表現(xiàn)，這些患者同時(shí)也表現(xiàn)有SRB豐度的升高[25]。在由非甾體抗炎藥(Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs，NSAIDs)誘導(dǎo)腸道潰瘍的小鼠中也觀察到了類似的SRB增加[26]，而用質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑和蘭索拉唑治療潰瘍時(shí)觀察到γ變形菌綱的豐度增加[27]。

盡管如此，SRB和H2S對腸道炎癥的影響機(jī)制尚待探討。結(jié)腸上皮細(xì)胞能利用H2S作為細(xì)胞呼吸的燃料[28]，一項(xiàng)通過直腸活檢和實(shí)時(shí)PCR鑒定并定量脫硫弧菌屬的研究顯示，UC患者和健康人群間不存在疾病相關(guān)差異[29]，也沒有發(fā)現(xiàn)IBD患者中細(xì)胞代謝硫化物的硫氰酸酶等的下調(diào)[30]。大約50%的大蒜素在模擬條件下能轉(zhuǎn)化為H2S[31]，在一項(xiàng)研究中，一日兩次給予小鼠60 mmol/kg的大蒜素(diallyl disulfide, DADS)5 d，沒有發(fā)現(xiàn)任何組織或形態(tài)學(xué)上的改變或黏膜炎癥反應(yīng)[32]。此外，結(jié)腸組織產(chǎn)生的內(nèi)源性H2S對黏膜具有一定的保護(hù)作用。在通過三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠模型中發(fā)現(xiàn)H2S的內(nèi)源合成在誘導(dǎo)結(jié)腸炎后的首日顯著上調(diào)并隨著結(jié)腸炎的發(fā)展下降至正常水平[33]，提示H2S在抑制結(jié)腸炎中的潛在作用。美沙拉嗪衍生物ATB-429能夠釋放H2S，可減少結(jié)腸炎相關(guān)的白細(xì)胞浸潤及促炎因子的表達(dá)[34]。

2.3 H2S對腸道的積極影響

腸道健康建立于腸道微生物組生態(tài)平衡及腸黏膜的正常生理功能之上，最近的一些研究發(fā)現(xiàn)H2S或能通過調(diào)控腸道微生態(tài)平衡來降低腸黏膜對損傷的敏感性[7]。腸道微生態(tài)失衡與腸道黏膜防御受損有關(guān)，而H2S在胃腸道黏膜防御中的重要作用為開發(fā)保護(hù)胃腸道、加速胃腸道損傷恢復(fù)及減輕NSAIDs所誘導(dǎo)的胃腸道炎癥的藥物提供了思路[35]。

H2S在酒精、NSAIDs和缺血后再灌注所誘發(fā)的胃腸道損傷中表現(xiàn)出保護(hù)作用，同時(shí)能夠促進(jìn)炎癥消退及組織修復(fù)[36-38]。有研究發(fā)現(xiàn)在幾種動(dòng)物模型中H2S供體都能促進(jìn)結(jié)腸炎的消退[33,39]。能夠釋放H2S的NSAIDs衍生物如ATB-346可減少萘普生對腸道的損傷[40]，其原因可能是降低了膽汁酸的細(xì)胞毒性[41]。此外，H2S有助于維持腸道微生物所構(gòu)成的生物膜。給予H2S供體可加速結(jié)腸炎大鼠生物膜恢復(fù)并減少細(xì)菌移位，體外試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)H2S供體可促進(jìn)生物膜代謝活性和生物量增加[7]。H2S供體大蒜素也已被發(fā)現(xiàn)對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都具有抑制作用[42]。

H2S可以通過多種方式影響腸道微生物群落與腸道上皮細(xì)胞之間的關(guān)系，可以明確的是，H2S在維持腸道微生物生態(tài)平衡中起重要作用。在病理狀態(tài)下，利用H2S的生理生態(tài)調(diào)控作用來減少和修復(fù)腸損傷可能是一個(gè)重要的研究方向。

3 總結(jié)與展望

H2S在動(dòng)物體中具有廣泛的生理學(xué)影響。由于飲食中的硫化物被腸道中定植的SRB還原利用，腸腔中的H2S濃度遠(yuǎn)高于機(jī)體內(nèi)其他組織或器官，H2S也通過多種方式參與腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。在一定濃度下，H2S利于腸道黏膜層構(gòu)建、促進(jìn)腸道微生態(tài)恢復(fù)；另一方面，毫摩爾濃度的H2S被認(rèn)為能通過阻抑丁酸鹽的氧化過程進(jìn)而破壞腸道上皮屏障，參與結(jié)腸癌期間的細(xì)胞周期失調(diào)并保護(hù)結(jié)腸癌細(xì)胞免受凋亡誘導(dǎo)劑影響?？梢哉f，能夠直接接觸腸上皮細(xì)胞的H2S濃度是關(guān)系到H2S治療窗界限的重要因素。在現(xiàn)代畜禽生產(chǎn)中，腸腔中H2S濃度主要取決于飼料中所提供的硫化物和腸道微生物的代謝，而腸道微生物受到多種因素的共同影響。

但是，生理環(huán)境中游離H2S的濃度仍是一個(gè)尚未明確的難題。有報(bào)道稱H2S在哺乳動(dòng)物組織中的含量在50～160 μmol/L之間[43]，即使僅限于腸道中，H2S的濃度也存在巨大的差異：在盲腸和直腸中可能只有約40 μmol/L[44]，而在結(jié)腸可能高達(dá)250 μmol/L[45]。隨著檢測方法的改進(jìn)，H2S在體內(nèi)的報(bào)道濃度存在變低的趨勢，但仍未有一種方法能準(zhǔn)確地測定體內(nèi)的H2S濃度，更多地則是用RSS或硫化物含量作為衡量指標(biāo)。這種不確定性一方面與不同檢測方法靈敏度及可靠性有關(guān)，另一方面則提示著H2S在體內(nèi)廣泛參加的多種生化反應(yīng)中可能以多種形態(tài)存在，并具有復(fù)雜的代謝動(dòng)力學(xué)。但可以明確的是，游離H2S和其他硫化物在體內(nèi)共同作用于機(jī)體，后者在一定條件下，存在按需釋放H2S的可能性?，F(xiàn)有報(bào)道中，H2S促進(jìn)細(xì)胞增殖和產(chǎn)生細(xì)胞毒性的濃度依使用的H2S供體及細(xì)胞系不同而不同。有證據(jù)表明，在同一腸細(xì)胞系中，利用NaHS等快速釋放供體與AP39等緩釋型供體時(shí)H2S分別表現(xiàn)為毒性和促生長兩種截然不同的作用結(jié)果。此外有報(bào)道稱，腸上皮屏障即使暴露于高濃度硫化物仍可保持完整，提示正常情況下腸道能夠應(yīng)對腸腔中高達(dá)毫摩爾濃度的H2S；相反地，SRB所產(chǎn)生的硫化物能夠使粘蛋白變性，進(jìn)而將黏液層變得薄且易于被細(xì)菌滲透，引發(fā)炎癥反應(yīng)。

在H2S的細(xì)胞毒性方面，有報(bào)道H2S通過與細(xì)胞色素氧化酶C中的鐵結(jié)合使得線粒體呼吸鏈?zhǔn)茏?，造成?xì)胞缺氧[46]；同時(shí)H2S又對線粒體具有一定的保護(hù)作用?？紤]到結(jié)腸上皮細(xì)胞以高耗氧為特征的代謝，線粒體對H2S的利用可能是進(jìn)一步探究H2S對腸道細(xì)胞影響機(jī)理的切入點(diǎn)。此外，H2S對細(xì)胞作用的靶點(diǎn)仍未被確認(rèn)。盡管已經(jīng)有豐富研究表明，H2S影響KATP及其他離子通道[47]，但在不同細(xì)胞中似乎存在不同的靶點(diǎn)。H2S對cGMP和cAMP的作用也不能明確。有報(bào)道稱NaHS不能影響兩者的水平[48]，也有報(bào)道稱H2S通過非競爭性抑制磷酸二脂酶活性提高了cGMP和cAMP水平[49]?？梢悦鞔_的是，H2S通過與目標(biāo)蛋白的金屬中心反應(yīng)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變。并且，H2S與NO、CO之間的相互作用可能也是H2S復(fù)雜作用機(jī)理的原因之一。

鑒于H2S對腸道的復(fù)雜影響，確定H2S的治療窗將成為利用H2S影響腸道健康的重要一步。為此，需要建立更為靈敏和可靠的檢測方法，以及確定不同H2S供體(最常見的快速釋放型供體是NaHS，此外還有緩釋型供體如GYY4137、AP39等)對細(xì)胞、組織和腸道的影響。在機(jī)理方面，明確H2S對腸道上皮細(xì)胞的作用靶點(diǎn)及其作為氧傳感器的作用機(jī)制或能解釋結(jié)腸上皮細(xì)胞對H2S的解毒作用和高濃度H2S的毒性作用。整合生理學(xué)和毒理學(xué)的兩方面，進(jìn)一步研究H2S對腸道的影響有助于對腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的認(rèn)識，并為腸道健康的維持提供新的思路和切入點(diǎn)。