益生菌通過腸-腦軸調(diào)控動物骨代謝的研究進展

余 洋，曾新福，樂 敏，楊彩梅*

（1.浙江農(nóng)林大學動物科技學院·動物醫(yī)學院，浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應用技術研究重點實驗室，動物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術浙江省工程實驗室，浙江臨安 311300；2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江安吉 313300；3.浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058）

骨代謝是指骨吸收與骨形成的動態(tài)平衡過程，其中成骨細胞（Osteoblast，OB）與破骨細胞（Osteoclast，OC）在保證骨量正常中起著重要作用。OB 負責骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，OC 主要吸收骨基質(zhì)。OB 的分化受多種因素影響，如干細胞抗原1（Sca-1/Ly-6A）、激素、胰島素樣生長因子1（Insulin-Like Growth Factors -1，IGF-1）等，其調(diào)節(jié)涉及Wnt/catenin 和轉化生長因子-β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白介導的信號通路之間復雜的相互作用。OC 的關鍵因子主要有核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）配體受體激活因子（Receptor Activator of Nuclear Factor-Kappa B ligand，RANKL）和單核細胞集落刺激因子（Macrophage Colony-Stimulating Factor，M-CSF）2 種。其中，RANKL 又稱腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）相關激活誘導細胞因子，它通過激活NF-κB 受體激活物（Receptor Activator of NF-κB，RANK）直接控制分化過程。

此外，免疫系統(tǒng)細胞（如B、T 細胞）產(chǎn)生的大量細胞因子，如白細胞介素-1（IL-1）、IL-6、IL-17、腫瘤壞死因子（TNF-α）等，也可通過調(diào)節(jié)OC 和OB上RANK 和RANKL 的表達，或調(diào)節(jié)RANK 介導的細胞內(nèi)信號而間接發(fā)揮作用[1]。骨代謝相關生化指標，如1,25-羥基維生素D3、甲狀旁腺素（PTH）、降鈣素（CT）、血鈣、血磷等，均可直接或間接調(diào)節(jié)骨代謝，進而影響骨的鈣化或溶解[2]。

腸道微生物是指存在于動物腸道中的數(shù)量龐大的微生物群體。腸道微生物中包含部分益生菌，其可調(diào)節(jié)腸道菌群的整體代謝，進而增強屏障功能、免疫調(diào)節(jié)及腸道神經(jīng)的調(diào)節(jié)功能[3-5]。目前，關于益生菌通過腸-腦軸影響骨代謝的討論越來越熱，但其具體功能機理仍然未知，在禽類生產(chǎn)上此類研究較少。本文基于腸-腦軸綜述了益生菌對禽骨代謝的影響，為益生菌研究及其對禽類規(guī)?；B(yǎng)殖提供參考。

1 影響骨代謝的因素

1.1 鈣、磷 影響骨代謝的因素包含各個方面，鈣磷穩(wěn)態(tài)是維持骨強度的主要因素。如禽類中，不同比例的鈣磷添加對OC 的形成及活化呈不同程度抑制作用，影響禽類骨骼強度[6-7]。在小鼠試驗中，鈣磷水平調(diào)節(jié)PTH的分泌及維生素D 的合成，PTH 變化影響RANKL mRNA 表達受體激活劑的分泌，影響OC 的形成和活化，達到調(diào)節(jié)骨量作用[8]。而益生菌與血清鈣水平呈正相關，對提高細胞吸收鈣有顯著作用[9]，表明益生菌可能參與骨代謝。

1.2 維生素 維生素D 及維生素K 影響骨骼形成。膽鈣化固醇及其代謝物可促進軟骨細胞成熟，預防脛骨軟骨發(fā)育不良，改善肉雞骨骼的鈣沉積，進而提高生產(chǎn)性能，降低死亡率，口服補充益生菌羅伊氏乳桿菌可提高血清25-羥基維生素D 水平[10-12]，維生素K 促進骨折愈合和骨生成，腸道菌群合成的維生素K2轉運到肝外組織后，再通過活化骨鈣素（Osteocalcin，Ocn）抑制NF-κB 表達調(diào)節(jié)基質(zhì)GLA 蛋白、血管和軟骨鈣化抑制劑，進而抑制OC 形成，促進OB 生成[13]。

1.3 激素 PTH 作為甲狀旁腺的主要分泌物，一方面增加活性維生素D 的產(chǎn)生，促進腸道鈣吸收，并協(xié)同腎臟減少鈣排泄以達到提升血鈣水平；另一方面通過與基質(zhì)或OB 上的甲狀旁腺素受體1（Parathyroid Hormone Receptor 1，PTHR1）結合來刺激OC 形成，從而增加RANKL 和M-CSF 的受體產(chǎn)生并抑制RANKL 結合骨保護素[14]，含有瑞士乳桿菌的發(fā)酵乳可使絕經(jīng)后婦女血清PTH 降低，減少其絕經(jīng)后骨吸收[15]。

CT 雖然是響應于血鈣變化進行調(diào)節(jié)，但它和PTH一樣，可直接作用于軟骨細胞刺激其鈣化，且可通過其受體與依賴性環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A（cAMP-PKA）偶聯(lián)來抑制OC 骨吸收[16]。雖然目前關于益生菌影響家禽此類激素的研究較少，但已有關于添加益生菌改善骨質(zhì)量的研究[17]，該激素可作為檢測骨代謝的指標之一。

骨鈣素（Ocn）作為評價骨形成和骨轉換率的一種標志，由OB 產(chǎn)生并分泌，經(jīng)γ-羧化后存儲于細胞外基質(zhì)。Ocn 可在參與能量代謝后反饋性影響OB 中的胰島素信號傳導，活化OC，影響骨代謝[18]。此外，Ocn可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的合成，促進海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生過程，進而影響大腦的認知功能（防止焦慮和沮喪，改善學習和記憶）[19]。而雄性小鼠口服Ocn 試驗也證明其可顯著提高血清Ocn 水平，增加骨密度[20]。綜上，Ocn 似乎是腸-腦-骨軸鏈接的重要物質(zhì)之一。

2 腸-腦-骨軸

腦-腸軸和腸-腦軸是指腸與大腦之間的雙向通訊。腦-腸軸是指大腦通過自主神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌因子傳遞輸出信號到腸道。而腸-腦軸是指腸道以感覺神經(jīng)元、免疫介質(zhì)（如細胞因子）、腸道激素和腸道菌群衍生的信號分子將信息從腸道傳遞到大腦[21]。二者聯(lián)系的介質(zhì)較多，如乙酰膽堿（Ach）、γ-氨基丁酸（GABA，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)）、5-羥色胺（5-HT，又稱血清素）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）等，本文就其研究較多的部分進行簡單梳理。

2.1 腸源性介質(zhì) 5-HT 作為一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，95%是由腸嗜鉻細胞（EC）利用色氨酸羥化酶1（TPH1，在周圍表達）產(chǎn)生[22]。念珠菌和大腸埃希氏菌也可利用食物中色氨酸產(chǎn)生5-HT[23-24]。已有研究證明，5-HT可通過調(diào)節(jié)RANKL 或直接活化NF-κB 來調(diào)控破骨細胞分化[25]，且不同的5-HT 受體亞型對骨的作用有所差異，腸源性5-HT 可以影響Wnt/β-catenin 信號的LRP5（低密度脂蛋白相關蛋白5）對骨形成的調(diào)節(jié)[26]。

短鏈脂肪酸是聯(lián)系腸-腦軸的一個非常重要的介質(zhì)。益生菌可通過短鏈脂肪酸影響免疫系統(tǒng)，進而調(diào)控IL-6、IL-17、RANKL 等的表達，達到調(diào)節(jié)骨代謝的作用[27]。Lucas 等[28]開展的3 種獨立試驗進一步驗證了短鏈脂肪酸可改變破骨細胞的代謝狀態(tài)，且對絕經(jīng)后骨質(zhì)丟失及關節(jié)炎有顯著緩解作用，這表明短鏈脂肪酸含量變化是貫穿腸-腦-骨軸調(diào)節(jié)的關鍵。

2.2 腦源性介質(zhì) 交感神經(jīng)支配骨髓調(diào)節(jié)造血功能和干細胞穩(wěn)態(tài)，從大腦發(fā)出的交感神經(jīng)信號通過腎上腺素能神經(jīng)纖維傳遞到骨髓，影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放。外周5-HT無法直接穿過腸腦屏障作用于中樞，但基因敲除小鼠的色氨酸羥化酶2（在腦中表達）的試驗證明了腦源性5-HT可以通過5-HT2c 受體作用于下丘腦腹內(nèi)側核神經(jīng)元，調(diào)節(jié)腎上腺素（E）分泌，以減少交感神經(jīng)活動，從而調(diào)節(jié)骨量[29]，說明腦源性5-HT 可以作為骨代謝調(diào)節(jié)因子參與骨轉換，并猜測腸源性5-HT 可能間接影響這一過程。

NE 屬于兒茶酚胺的一種，主要由交感節(jié)后神經(jīng)元和腦內(nèi)腎上腺素能神經(jīng)末梢合成和分泌，其變化往往可以體現(xiàn)菌群變化對機體代謝的影響。最新的研究揭示了腸道菌群與NE 通過環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A-反應元件結合蛋白（cAMP-PKA-pCREB）信號通路相互作用，調(diào)節(jié)能量代謝[30]，且交感神經(jīng)激活后釋放的NE 可負面調(diào)節(jié)骨量[31]，這些均涉及下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸，揭示神經(jīng)遞質(zhì)在腸-腦-骨軸中的調(diào)節(jié)不可或缺。

3 益生菌對腸-腦軸的影響

益生菌作為活的微生物，其益生作用早已得到研究者的一致認同，且其對腸道疾病（傳染性腹瀉、抗生素

相關性腹瀉、炎性腸病、腸易激綜合征、乳糖不耐癥等）的預防、治療效果也早已被證明[32]。而益生菌對于腸-腦軸的作用也在大量試驗中開始明晰，它不僅能使腸道菌群正常化，還可使涉及腸-腦軸調(diào)控的行為或疾病得到改善。如益生菌可以使母體分離后的小鼠HPA 正?；痆33]，在抗焦慮作用上可單獨通過迷走神經(jīng)促進腸腦溝通，降低皮質(zhì)酮水平，促進大腦中GABA 的表達正常化[34]。此外，研究通過對重排活化基因敲除（Rag1-/-，缺乏發(fā)育成熟的B 和T 淋巴細胞）小鼠使用益生菌后，發(fā)現(xiàn)小鼠行為障礙和結腸生理學變化得到改善，證明了益生菌可使免疫缺陷小鼠的腸-腦軸正?；痆35]。相關機制或涉及神經(jīng)傳導，或涉及免疫系統(tǒng)，均表明益生菌對腸-腦軸的作用是多途徑同時進行。

3.1 益生菌對神經(jīng)遞質(zhì)的影響 益生菌調(diào)節(jié)腸-腦軸的方式大致可以分為代謝、免疫、神經(jīng)遞質(zhì)3 種，而神經(jīng)遞質(zhì)中的生物原胺類（單胺類，包含吲哚胺中的5-HT和兒茶酚胺中的E、NE、DA）和氨基酸類（GABA、組胺、谷氨酸、Ach 等）研究最多。

3.1.1 單胺類 E、NE、DA 和5-HT 都是激素和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，是作為激素存在而發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)的作用，雖然沒有直接證據(jù)證實它們可穿過腸腦屏障作用于中樞神經(jīng)，但早前的大量研究證實腸道菌群可產(chǎn)生與抑郁癥有關的神經(jīng)遞質(zhì)GABA[36]，乳酸桿菌可合成DA[24]，且無菌動物試驗發(fā)現(xiàn)，無菌小鼠的盲腸腔和組織中的NE 水平顯著低于正常小鼠，并且盲腸中NE 的水平可以通過微生物群落或46 種梭狀芽胞桿菌混合物的定植來恢復[37]，說明益生菌可介導宿主體內(nèi)的這些激素調(diào)節(jié)而影響中樞神經(jīng)。O’Mahony 等[38]也指出，胃腸微生物可通過直接利用色氨酸調(diào)節(jié)胃腸道中局部5-HT 濃度，繼而影響腸-腦軸神經(jīng)傳遞。

3.1.2 氨基酸類 膽囊收縮素（CCK，一種胃腸激素），在周圍神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)中大量產(chǎn)生，并且主要參與情緒和食物攝入的調(diào)節(jié)。在人和小鼠中，CCK 水平與增加的焦慮樣行為呈正相關[39]。研究表明，CCK 可通過神經(jīng)遞質(zhì)（包括谷氨酸、5-HT、Ach 和GABA）的關鍵作用來調(diào)節(jié)情緒障礙[40]。而乳酸桿菌可產(chǎn)生Ach[24]，擬桿菌屬可產(chǎn)生GABA 且其豐度與大腦抑郁癥特征負相關[36]。雖然相關的具體作用機理仍在探索中，但基于益生菌在相關疾病中的作用已被證明，益生菌通過影響神經(jīng)遞質(zhì)來影響神經(jīng)系統(tǒng)的途徑值得進一步探究。

3.2 益生菌對細胞因子的影響 益生菌對宿主免疫影響并不是直接作用于相關的細胞免疫因子，而是通過其代謝物影響細胞因子，進而與宿主的免疫調(diào)節(jié)能力相關聯(lián)。腸道微生物與炎癥細胞因子反應顯著相關，具體表現(xiàn)為微生物色氨酸代謝物——色胺醇與TNF-α和干擾素（IFN-γ）的產(chǎn)生相關，而與其他細胞因子（如IL-1β、IL-6 和Th17 衍生的IL-17 和IL-22）關聯(lián)程度較低，但更具特異性[41]。此外，腸道中色氨酸的代謝物還可通過與芳基烴受體相互作用介導免疫反應，進而抑制炎癥[42]，這些不僅僅是對宿主機體的免疫調(diào)節(jié)非常重要，對機體的大腦也有影響，因為細胞因子在介導免疫信號的同時，可進入血液而影響血腦屏障缺陷的部位（如下丘腦）。Murray 等[43]的對比實驗驗證了這一點，益生菌可改善脂多糖（LPS）處理青春期小鼠的細胞因子及下丘腦室旁核中TLR4 的表達。

3.3 益生菌對免疫因子的影響 益生菌對免疫的影響主要是通過其代謝產(chǎn)物實現(xiàn)腸道免疫，如短鏈脂肪酸、色氨酸代謝物、B 族維生素等。丁酸可以與G 蛋白偶聯(lián)受體GPR109A（G-Protein Coupled Receptor 109A，在結腸上皮細胞和先天免疫細胞中表達）特異性結合并誘導Treg 細胞（調(diào)節(jié)性T 細胞）分化，丙酸對腸固有層的巨噬細胞的組蛋白脫乙酰基酶（HDAC）活性及炎性介質(zhì)（NO、IL-6、IL-12）的分泌有抑制作用[44]，它們影響著促炎與抗炎機制之間的平衡，是益生菌與宿主免疫系統(tǒng)交流的重要手段。

色氨酸代謝物中的吲哚是腸道免疫中最有效的產(chǎn)物，其主要作用是通過降低TNF-α介導的NF-κB 活化，減少促炎因子IL-8 的表達并增加抗炎因子IL-10 的表達；此外，吲哚及其衍生物對維持黏膜穩(wěn)態(tài)、增加細胞緊密連接、增強腸上皮屏障亦有作用[45]。

益生菌可產(chǎn)生其宿主不能產(chǎn)生的維生素[46]，尤其是B 族維生素，對機體的免疫調(diào)節(jié)非常重要，如B1是三羧酸循環(huán)的關鍵因子，B2與相關蛋白結合，可特異性激活MAIT 細胞（一種先天樣T 細胞），進而可能對IFN-γ、IL-17 分泌產(chǎn)生影響[47-48]。

4 益生菌對骨代謝的影響

4.1 益生菌通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)吸收影響骨代謝 腸道菌群在食物消化、能量利用、礦物質(zhì)吸收及維生素供應等方面均與宿主相互作用，進而影響宿主骨骼代謝。益生菌不僅可合成維生素B 和維生物素K[46]，大量的動物試驗證明益生菌（包括乳酸菌、雙岐乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌等）還可通過合成維生素、調(diào)節(jié)腸道pH、膽汁酸代謝等途徑影響鈣吸收；此外，腸道作為礦物質(zhì)吸收的主要場所，可直接受益生菌影響，調(diào)節(jié)機體對鈣磷的吸收，進而影響骨骼[49]。這些證據(jù)均表明益生菌可影響宿主骨骼代謝，也說明益生菌或可為骨骼相關疾病的治療找到契機。

4.2 益生菌通過生長因子及激素調(diào)節(jié)骨量 副乳桿菌或乳桿菌混合物可治療小鼠雌激素缺乏引起的骨丟失[50]。而雌激素可通過調(diào)節(jié)產(chǎn)生TNF-α的T 細胞數(shù)量影響M-CSF 誘導和RANKL 誘導的OC 生成，達到調(diào)節(jié)骨量的作用[51]。研究表明，飼糧中添加地衣芽孢桿菌可顯著調(diào)節(jié)蛋雞雌激素分泌，并上調(diào)編碼雌激素及雌激素相關受體基因表達[52]。另外，長雙歧桿菌也已被證明可使卵巢切除大鼠的骨轉化指標正常化[53]。在肉雞上，枯草芽孢桿菌用于生產(chǎn)可提高肉雞血清Ocn 水平，增加脛骨強度[54]，已知IGF-1 是一種多能生長因子，可通過內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌作用促進破骨細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化，常規(guī)生長的新生小鼠的生長激素和IGF-1 水平高于無菌小鼠，且植物乳酸菌可部分消除營養(yǎng)不良狀態(tài)下外周組織對生長激素的抗性[55]。說明益生菌可通過影響生長因子及激素水平來影響骨骼健康。

4.3 益生菌通過介導免疫反應影響骨代謝 Sj?gren 等[56]的試驗顯示，對3 周齡無菌小鼠進行正常腸道菌群定植，可以提高其全身免疫力繼而使骨量正?；?。益生菌還可直接通過其代謝物影響機體免疫。研究顯示枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的細菌多糖可介導發(fā)育中免疫系統(tǒng)的細胞成熟，彌補無菌小鼠脾臟中CD4+T 細胞的缺陷[57]，鼠李糖乳桿菌對營養(yǎng)不良狀況下小鼠的免疫功能有增強作用，影響免疫缺陷小鼠的骨重塑[58-59]，這意味著益生菌對于宿主健康的作用不僅僅在預防疾病方面，在逆轉不良影響方面也有價值。

目前，畜牧方面已有不少學者指出益生菌可明顯影響生產(chǎn)動物骨骼參數(shù)及生產(chǎn)性能，如枯草芽孢桿菌可改善蛋雞骨骼性狀、產(chǎn)蛋性能和蛋殼品質(zhì)[60-61]。低含量非植酸磷的日糧中添加酵母亦有利于其骨骼鈣化[62]。盡管關于益生菌作用的具體機制仍在探索中，但它為進一步研究益生菌影響畜禽骨代謝提供了有價值的信息。

5 應用展望

綜上，可發(fā)現(xiàn)腸-腦軸是聯(lián)結益生菌與骨代謝的重要通路，而短鏈脂肪酸和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是影響腸-腦軸的關鍵，未來可著重探究相關具體機制，如丁酸如何通過腸-腦軸影響骨代謝通路、5-HT 怎樣介導腸-腦-骨軸聯(lián)系、益生菌產(chǎn)生的色氨酸是否直接介導骨代謝途徑等。相信這些深入的機制研究不僅可在相關疾病的治療方面發(fā)揮重要作用，也將為進一步探索畜禽高效養(yǎng)殖提供理論依據(jù)，同時推動益生菌在畜禽養(yǎng)殖上的應用，提高生產(chǎn)動物經(jīng)濟效益，促進養(yǎng)殖業(yè)高效發(fā)展。