腎移植術(shù)后BK 病毒感染與人腎小管上皮細(xì)胞的相關(guān)性研究進(jìn)展

許瀚仁，王繼納，楊橙，許明（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科，上海市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032）

BK 多瘤病毒（BK polyomavirus， BKV）是隸屬于多瘤病毒科的雙鏈DNA 病毒，在免疫力正常的人群中缺乏臨床癥狀，潛伏在腎臟腎小管上皮細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞中，處于休眠期。在腎移植患者使用大劑量免疫抑制治療后，會激活休眠期BKV 的活性，運(yùn)輸?shù)饺四I小管上皮細(xì)胞（human renal proximal tubular epithelial cells， HRPTEC）內(nèi)大量復(fù)制，細(xì)胞損傷、脫落，產(chǎn)生輸尿管潰瘍導(dǎo)致基底膜的破壞，病毒進(jìn)而進(jìn)入腎實(shí)質(zhì)和血液循環(huán)，發(fā)展成為病毒血癥，進(jìn)一步發(fā)展可引起輸尿管狹窄和BKV 相關(guān)性腎病（BK virus associated nephropathy， BKVAN），而BKV 從潛伏再激活會造成腎小管上皮細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞病變，從而導(dǎo)致腎小管上皮脫落加快BKV 傳播速度和反復(fù)感染［1］。因此，了解BKV 與腎小管上皮細(xì)胞的最新研究進(jìn)展能為今后臨床上BKV 感染的診斷及治療方案的選擇提供一定的參考。本文將著重探討B(tài)KV 與HRPTEC 的感染途徑機(jī)理及關(guān)鍵因素、HRPTEC 相關(guān)的治療新靶點(diǎn)和BKV 感染HRPTEC 的臨床診斷及治療。

1 BKV 感染HRPTEC 的機(jī)制及關(guān)鍵因素

臨床上為了治療BKV 感染，大多時候是選擇減少免疫抑制劑和使用抗病毒藥物的治療方案，但是如此的治療方案無法有效阻止BKV 內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到HRPTEC，病毒仍然可以感染細(xì)胞并復(fù)制，損傷脫落時感染其余的尿路上皮細(xì)胞，加重移植腎功能損傷。初次BKV 感染后，病毒仍潛伏在不同的泌尿系統(tǒng)部位上，特別是腎臟及尿道的上皮細(xì)胞［2］。潛伏期可能會在正常人中無癥狀性尿毒癥，但在免疫抑制情況下，BKV 再激活從膀胱沿尿道上皮細(xì)胞上升感染，引起輸尿管狹窄，進(jìn)而導(dǎo)致BKV 在輸尿管位置以上反復(fù)感染及自身復(fù)制，包含膀胱與腎臟等上下尿路途徑。尿道上皮細(xì)胞中HRPTEC 作為BKV 感染的主要天然靶細(xì)胞，了解BKV 感染HRPTEC 的機(jī)制有助于研發(fā)早期抑制BKV 復(fù)制的治療辦法。

早期研究發(fā)現(xiàn)BKV 經(jīng)小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入Vero 細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）細(xì)胞膜質(zhì)膜內(nèi)，Vero細(xì)胞作為靶細(xì)胞可以解釋BKV 早期感染細(xì)胞其中一種過程［3］。但是HRPTEC 是整倍體細(xì)胞，而Vero 細(xì)胞作為非整倍體細(xì)胞不利于BKV 感染研究。由于HRPTEC 在自然狀態(tài)下就是BKV 感染的主要靶細(xì)胞，因此用HRPTEC 作為病毒感染靶細(xì)胞能減少細(xì)胞層面的誤差［4］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床實(shí)際情況更加貼切。

有研究發(fā)現(xiàn)BKV 能經(jīng)小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入HRPTEC 細(xì)胞膜內(nèi)，小窩蛋白-1（Caveolin-1，Cav-1）是小窩的標(biāo)志蛋白質(zhì)，經(jīng)由siRNA 介導(dǎo)敲除CaV-1 基因表達(dá)和消耗細(xì)胞膽固醇減少小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制能夠抑制BKV 感染HRPTEC［5］。

通過電鏡對BKVAN 患者的腎穿刺組織進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)病毒顆粒是以無被膜形式進(jìn)入HRPTEC，這從形態(tài)學(xué)上支持BKV 能經(jīng)網(wǎng)格蛋白包被小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入靶細(xì)胞［6］。而Sorokin 實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果表明，敲除Cav-1 基因可抑制BKV 感染HRPTEC，而敲除網(wǎng)格蛋白基因沒法抑制BKV 感染。BKV 似乎是通過小孔而不是通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的途徑進(jìn)入HRPTEC，此研究進(jìn)一步支持小窩內(nèi)吞機(jī)制是BKV 感染HRPTEC 的重要機(jī)制［4］。BKV 在附著于HRPTEC 的細(xì)胞表面后，BKV 顆粒沿細(xì)胞表面移動，并在感染后4 h 被轉(zhuǎn)運(yùn)至小窩之中。經(jīng)由小窩介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用后，若胞內(nèi)微管運(yùn)動正常，BKV 能沿著微管穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum， ER）運(yùn)輸至細(xì)胞核中，內(nèi)運(yùn)輸過程與運(yùn)動蛋白的作用無關(guān)，該研究能證明BKV 是小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制后是經(jīng)沿著細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)靶細(xì)胞內(nèi)。

有研究證明BKV 可以入侵至外泌體-細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）中，從而使BKV 顆?？梢允褂锰娲緩竭M(jìn)入HRPTEC，提供了BKV 發(fā)病機(jī)理的新觀點(diǎn)。盡管在比較EV 相關(guān)顆粒和裸BKV粒子時，我們沒有發(fā)現(xiàn)對中和抗體的敏感性降低，但該研究也提出有關(guān)基于誘導(dǎo)或施用中和抗體制定預(yù)防策略的重要問題［7］。

BKV 在感染后6 ～ 8 h 到達(dá)ER，繞過高爾基體（Golgi apparatus， GA）或迅速通過GA。然后BKV顆粒進(jìn)入細(xì)胞核中進(jìn)行病毒復(fù)制，并且在細(xì)胞破碎后子病毒被轉(zhuǎn)運(yùn)至其他細(xì)胞。BKV 感染HRPTEC的過程相對緩慢，感染周期至少需要24 ～ 48 h，與多瘤病毒的SV40 感染非常相似。這是第一份證明BKV 感染獨(dú)特時程并提供BKV 主要自然靶點(diǎn)HRPTEC 中BKV 細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制的證據(jù)的報(bào)告。每種細(xì)胞類型的病毒生命周期都非常不同，因此，使用HRPTEC 闡明BKV 感染的精確機(jī)制和動力學(xué)非常重要。

上文闡述3 種BKV 感染途徑，包含無被膜形式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)、經(jīng)小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)和入侵胞外的外泌體經(jīng)替代途徑感染HRPTEC。破譯這種新的釋放途徑可以使治療靶標(biāo)的識別能夠更好的預(yù)防BKVAN 發(fā)生。

2 HRPTEC 相關(guān)的拮抗BKV 感染新靶點(diǎn)

腎臟中病毒感染的特征是病毒和/或細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞直接誘發(fā)的腎小管損傷，損傷脫落BKV 感染的HRPTEC 通過不斷地復(fù)制和轉(zhuǎn)染其他尿路上皮細(xì)胞，BKV 進(jìn)一步擴(kuò)散感染尿路上皮細(xì)胞，感染程度加重發(fā)展成BKVAN［8］。

如前文所述，已知BKV 是通過小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制和微管結(jié)構(gòu)進(jìn)入至細(xì)胞中，是BKV 感染HRPTEC 的關(guān)鍵步驟［5］，降低膽固醇的藥物能夠可抑制細(xì)胞膜上小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制，進(jìn)而 干 預(yù)BKV 感 染HRPTEC。 在Moriyama 研 究中，HRPTEC 與BKV 和普伐他汀共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BKV 感染的HRPTEC 比例與對照組相比明顯下降。而普伐他汀抑制BKV 感染細(xì)胞的機(jī)制是由于普伐他汀通過抑制膽固醇的合成降低Cav-1 的水平，從而阻礙BKV 經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞機(jī)制運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)。平時用來治療高膽固醇血癥的他汀類藥物在體外實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛞种艸RPTEC 小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制，同時證實(shí)降低膽固醇能有效降低BKV 感染的風(fēng)險(xiǎn)［9］。盡管已經(jīng)證實(shí)普伐他汀能降低Cav-1水平，但仍有研究顯示他汀類藥物抑制BKV 感染可能與降低HRPTEC 中Cav-1 的表達(dá)并干擾內(nèi)在標(biāo)記化BKV 顆粒來抑制BKV 的內(nèi)運(yùn)輸［9］。

研究發(fā)現(xiàn)，HRPTEC 表達(dá)3 種dsRNA：Toll 樣受體3（TLR3）、黑素瘤分化相關(guān)基因5（MDA5）和視黃酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I），以及雙鏈RNA 的所有傳感器。而研究證明巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）或BKV 感染期間腎臟移植活檢中這3 種dsRNA 傳感器的表達(dá)增加。在初級腎小管上皮細(xì)胞中，dsRNA 傳感器的激活誘導(dǎo)了促炎性TNF-α 和抗病毒IFN-β 的產(chǎn)生。值得注意的是，dsRNA 還增強(qiáng)了促凋亡蛋白的表達(dá)。然而，由于抗凋亡蛋白的表達(dá)，單獨(dú)的dsRNA 并不會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。dsRNA 使HRPTEC 對由抗Fas 受體激動性抗體誘導(dǎo)進(jìn)行凋亡，這是一種清除被BKV 感染細(xì)胞的凋亡途徑。這些發(fā)現(xiàn)表明，HRPTEC 至少需要兩個信號才能進(jìn)行凋亡，即使在炎性條件下也可以幫助保持腎小管的完整性。因此，病毒dsRNA 的傳感器可促進(jìn)HRPTEC 中的抗病毒作用、促炎和促凋亡反應(yīng)，協(xié)調(diào)腎臟中BKV 感染的控制［10］。

如今已知降膽固醇藥物能抑制CaV-1 相關(guān)的感染途徑、BKV 的dsRNA 傳感器表達(dá)有助于抗病毒作用，針對HRPTEC 抗BKV 感染新機(jī)制的研究進(jìn)展將能啟發(fā)治療BKV 相關(guān)性疾病的新方法，為病毒特異性的拮抗劑奠定了基礎(chǔ)。

3 BKV 感染HRPTEC 的臨床診斷及治療

3.1 臨床診斷：對于BKV 感染腎小管上皮細(xì)胞后的病毒擴(kuò)增最好用以下感染模型解釋：BKV 在腎臟中開始復(fù)制，然后尿路上皮擴(kuò)增和腎小管上皮細(xì)胞脫落交叉發(fā)生，在約10 周后達(dá)到動態(tài)平衡。將腎內(nèi)復(fù)制減少50%無效，并且在7 周內(nèi)清除病毒血癥需要＞80%，但病毒尿持續(xù)超過14 周。減少＞90%的病毒血癥和病毒血癥分別在3 周和10 周時清除。該模型在前瞻性監(jiān)測的KT 患者中進(jìn)行了臨床驗(yàn)證，支持減少80%以上的最佳干預(yù)措施［11］。

目前主流BKV 感染性和發(fā)病機(jī)制的研究焦點(diǎn)主要集中在HRPTEC 上，大多數(shù)研究已將其作為導(dǎo)致BKVAN 纖維化的主要病毒庫和致病性途徑的主要驅(qū)動力［5］。這些報(bào)告得出結(jié)論，在免疫抑制的腎移植患者中，腎小管上皮細(xì)胞是病毒潛伏和再激活的主要部位［1］。發(fā)現(xiàn)來自幾項(xiàng)研究的證據(jù)支持以下觀點(diǎn)：腎小管上皮細(xì)胞感染、移植腎功能丟失，腎小管壞死是與BKVAN 相關(guān)的腎纖維化的必要先決條件。

腎移植功能下降是最常見的表現(xiàn)時間?；颊邿o癥狀，血清進(jìn)行性升高肌酐［12］。間質(zhì)性腎炎與BKV 感染有關(guān)很難與急性細(xì)胞排斥反應(yīng)區(qū)分開。后續(xù)的纖維化改變可導(dǎo)致慢性同種異體腎病。有報(bào)道顯示膀胱區(qū)的上行BKV 感染可導(dǎo)致移植腎輸尿管狹窄和尿路梗阻，隨后同種異體移植物阻塞。實(shí)驗(yàn)室檢查可發(fā)現(xiàn)BKV 在尿中和血中的復(fù)制增加，即較高水平的BKV 也與出血性膀胱炎，可能是BKV 的最初表現(xiàn)腎移植受者的腎?。?2］。在出現(xiàn)血清肌酐升高之前，BKV 尿癥和BKV 血癥兩者均與BKVAN 有一定的相關(guān)性，但僅有部分BKV 感染患者會加重病情發(fā)展成BKVAN。其他臨床表現(xiàn)包括尿路梗阻和出血性膀胱炎，并可能成為BKVAN 的首發(fā)表現(xiàn)［13］。研究證明，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中BKV 原發(fā)性HRPTEC 感染均未觸發(fā)抗病毒反應(yīng)基因也不會誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)，因此尿液中白細(xì)胞升高和炎癥因子增多的臨床表現(xiàn)與BKV 感染的相關(guān)性有待商榷［14］。

Decoy 細(xì)胞是指細(xì)胞內(nèi)含有BKV 包涵體的脫落腎小管上皮細(xì)胞在BKV 感染患者的尿液中能檢測到Decoy 細(xì)胞，能證明移植腎內(nèi)有病毒復(fù)制并感染腎小管上皮細(xì)胞，但僅據(jù)此還不能診斷BKVAN。尿中檢出Decoy 細(xì)胞對診斷BKVAN 僅有29%的陽性預(yù)測價(jià)值［7］。然而，鏡下觀察Decoy 細(xì)胞不利于診斷BKV感染，人工操作容易誤判，操作流程耗時長，不利于長期隨訪和大量樣本檢測。國內(nèi)有研究團(tuán)隊(duì)長期觀察BKV 感染患者的尿沉淀標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)免疫組化雙標(biāo)志物染色能明確檢測出尿沉淀中出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞來源和膀胱上皮細(xì)胞來源的Decoy 細(xì)胞，一定程度預(yù)測BKVAN 發(fā)生［15］。除了細(xì)胞學(xué)檢測以外，臨床檢驗(yàn)中可經(jīng)血漿和尿液中的病毒DNA 檢測或病毒蛋白1（ Viral Protein-1， VP-1） mRNA 做PCR定量檢測，是一種無創(chuàng)檢測BKV 感染的診斷性方法［7］。目前診斷BKV 感染的標(biāo)準(zhǔn)為：尿BKV DNA定量＞ 107拷貝/ml 或血漿BKV DNA 定量＞104拷貝/ml ，此標(biāo)準(zhǔn)與證實(shí)BKVAN 的活檢結(jié)果有明顯相關(guān)性［16］。移植腎活檢是BKVAN 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其病理特征包括以下特點(diǎn): 腎小管上皮細(xì)胞、腎小球、集合管細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞學(xué)改變及SV40 細(xì)胞標(biāo)記陽性，腎間質(zhì)內(nèi)纖維組織增生和腎小管萎縮［17］。BKVAN 組織學(xué)改變可能是局灶的，或僅局限于髓質(zhì)，所以移植腎活檢如果僅取材1 處，有近33%的臨床病例可能會出現(xiàn)漏診情況［18］。SV40 大T 抗原免疫組化染色有助于鑒別移植腎穿刺標(biāo)本診斷為BKVAN 或是屬于移植后急性排斥反應(yīng)［19］。然而移植腎穿刺對于其本身也存在損傷腎臟的風(fēng)險(xiǎn)，目前提出針對細(xì)胞學(xué)和PCR 定量檢測血液尿液標(biāo)本針對的無創(chuàng)性診斷BKVAN方式有助于提升患者移植腎的存活時間［15-16］。3.2 治療：目前BKV 感染的治療主要目的是抑制病毒復(fù)制、增加自身免疫防御機(jī)制同時預(yù)防急性及慢性移植排斥反應(yīng)發(fā)生、保護(hù)移植腎功能，多數(shù)情況下選擇減量免疫抑制劑的使用。各中心具體免疫抑制劑減量的方案不盡相同，一般是停用或減量嗎替麥考酚酯（mycophenolate Mofetil，MMF）用量，改用含有抗病毒作用的免疫抑制劑方案，也有調(diào)整鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（calcineurin inhibitor，CNI）的免疫抑制藥用藥。

研究顯示，在臨床相關(guān)濃度下，CI 藥物中的西羅莫司（Sirolimus，SIR）能抑制BKV 復(fù)制，而他克莫司（Tacrolimus，Tac）則會反向激活BKV 復(fù)制。差異之處在于兩者需要同時競爭FKBP-12 蛋白位點(diǎn)，F(xiàn)KBP-12 是一種已知與任何一種藥物結(jié)合的小型宿主細(xì)胞蛋白，而SIR 通過與FKBP-12 結(jié)合和抑制mTOR 通路達(dá)到抑制HRPTEC 中BKV 的復(fù)制，Tac 與FKBP-12 結(jié)合后則是會促進(jìn)mTOR 通路從而誘導(dǎo)BKV 的復(fù)制［20］。有研究表明SIR 和來氟米特聯(lián)合用藥后能降低BKV 的大T 抗原表達(dá)并減少BKV 復(fù)制。西羅莫司和來氟米特聯(lián)合抑制蛋白激酶途徑（PDK1、Akt、哺乳動物雷帕霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)靶點(diǎn)和p70S6K），可能是抑制BK 病毒激活的有效途徑。由于SIR和來氟米特均具有免疫抑制活性，因此，聯(lián)合用藥可減少BK 發(fā)病機(jī)制，同時保持適當(dāng)?shù)拿庖咭种扑剑?1］。而市面上常用的抗病毒藥物包含西多福韋（Cidofovir， CDV）和來氟米特（Lefluno-mide，LEF）［18］，臨床上能作為MMF 藥物替代使用。

在抗病毒藥物當(dāng)中， LEF 經(jīng)常用于治療BKVAN，LEF 的活性表征影響HRPTEC 中BKV 的生命周期。LEF 可將細(xì)胞外BKV 負(fù)荷降低90%，但具有顯著抑制宿主細(xì)胞的作用。尿苷類化合物的添加在很大程度上抵消了宿主細(xì)胞和抗病毒作用，這暗示非特異性嘧啶的消耗是來氟米特的主要抗BKV 感染的主要機(jī)制，證明來氟米特能抑制BKV 復(fù)制，但同時也抑制HRPTEC 的增生作用［22］。CDV 能抑制HRPTEC 細(xì)胞內(nèi)BKV 基因復(fù)制的水平達(dá)到抑制HRPTEC 的BKV 復(fù)制周期，并在較小的程度上抑制病毒體的組裝和釋放。CMV 目前已用于臨床上小病例的系列研究，研究顯示 CDV 是以劑量依賴的方式抑制病毒后代的產(chǎn)生，在40 lg / ml 時降低90%的病毒量。BKV 與受體結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞等早期步驟似乎并未受到CDV 藥物影響，初期大T 抗原轉(zhuǎn)錄和表達(dá)也未受影響，但隨后的HRPTEC 內(nèi)BKV復(fù)制減少90%以上，晚期BKV 的mRNA 和相應(yīng)的蛋白質(zhì)水平也降低90%。研究結(jié)果考慮為CDV 抑制大T 抗原表達(dá)下游的BKV DNA 復(fù)制，并涉及明顯的細(xì)胞毒性影響宿主細(xì)胞。在當(dāng)前的治療和藥物開發(fā)中應(yīng)考慮到這一項(xiàng)副作用［23］。

有臨床研究報(bào)道靜滴人免疫球蛋白（Intravenous immunoglobulin，IVIG）聯(lián)合免疫抑制劑減量能有效抑制BKV 活化復(fù)制［18］。IVIG 制劑的劑量范圍為從0.1 到2.0 g/kg，同時免疫抑制。的IVIG 制劑含有高滴度的BKV 有效中和抗體。盡管IVIG 不能穿透HRPTEC 細(xì)胞膜內(nèi)抑制BKV 復(fù)制，但其對BKV 的中和作用和過多的間接免疫調(diào)節(jié)作用可能有助于改善BKV 感染情況［24］。國內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑咪唑立賓在體外實(shí)驗(yàn)?zāi)苡行б种艬KV 感染HRPTEC。在高藥物濃度情況下僅抑制BKV 在細(xì)胞內(nèi)的活性，不會出現(xiàn)抑制HRPTEC 增殖再生的作用，臨床上有能保護(hù)正常移植腎功能和抑制BKV 感染的潛力［25］。

如今為止抗病毒治療的療效有限，臨床上尚未有明確的有效治療方案，并且抗病毒藥物大多含有腎毒性，會損失HRPTEC 以及移植腎功能，今后BKV 感染的治療方向針對BKV 運(yùn)輸至HRPTEC 的初始步驟進(jìn)行干預(yù)。

4 小 結(jié)

BKV 在HRPTEC 內(nèi)活化復(fù)制是BKV 感染以及BKVAN 發(fā)病的主要因素，對該病毒的免疫逃逸和預(yù)防發(fā)病的機(jī)制仍然知之甚少，目前，腎移植患者感染BKV 后仍然缺乏有效的治療選擇，針對抗BKV感染HRPTEC 的藥物治療將會是未來臨床治療研究方向的主流。