納米示蹤劑在移植干細胞活體示蹤中的研究進展

黃思渝， 成 昱， 秦 瑤

(1. 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092； 2. 同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究所，上海 200123； 3. 同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院干細胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)基地，上海 200123)

干細胞，包括胚胎干細胞(embryonic stem cells， ESCs)及各種成體干細胞，如間充質(zhì)干細胞(mese-nchymal stem cells， MSCs)、造血干細胞(hemo-poietic stem cell, HSCs)、神經(jīng)干細胞(neural stem cells， NSCs)、上皮干細胞(epithelial stem cells， ESCs)、視網(wǎng)膜干細胞(retina stem cells， RSCs)等，因其治療和再生潛能受到越來越多的關(guān)注。其可能的機制是干細胞在移植后遷移到病變或損傷的部位，分化為目標細胞，修復(fù)或替換受損的細胞或組織。目前，干細胞療法在很多疑難疾病，如帕金森病[1]、肝衰竭病[2]、修復(fù)缺血和梗死肢體組織[3]以及心肌梗死[4]等的治療中已顯現(xiàn)出良好的臨床前效果。需要指出的是，由于缺乏對移植干細胞的在體示蹤手段，干細胞移植到體內(nèi)后的存活、遷移以及增殖分化過程并不清楚，導(dǎo)致其治療過程尚在黑箱之中，治療效果也很難明確界定。因此，發(fā)展有效的、適用于移植干細胞的活體示蹤技術(shù)對干細胞療法的臨床推進有重要意義。

正如分子探針的發(fā)展催生了分子影像學(xué)的出現(xiàn)與發(fā)展一樣，基于現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)影像設(shè)備及成像方法，適用于移植干細胞的活體示蹤技術(shù)的發(fā)展將更多依賴于先進的干細胞示蹤劑的開發(fā)。理想的干細胞活體示蹤劑應(yīng)該具備以下特點： (1) 示蹤劑必須是安全的，即示蹤劑不能干擾細胞的關(guān)鍵屬性；(2) 示蹤劑必須能穩(wěn)定標記細胞足夠時間，即示蹤劑能夠在干細胞的作用周期內(nèi)準確指示干細胞的位置；(3) 示 蹤劑能靈敏指示干細胞的活死；(4) 示蹤劑能指示干細胞的增殖以及分化情況，即干細胞的功能情況。這些特點給現(xiàn)有醫(yī)學(xué)影像技術(shù)及未來干細胞活體示蹤劑的研發(fā)提出了巨大的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有的譜系示蹤技術(shù)雖然能反映干細胞的活死狀態(tài)，但其標記過程必須經(jīng)過基因改造工程輔助，這制約了其臨床轉(zhuǎn)化。而其他示蹤技術(shù)則普遍存在不能有效反映移植干細胞的活死以及分化和功能情況。

近年來，納米技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展為干細胞活體示蹤技術(shù)的發(fā)展提供了新的思路?；诩{米技術(shù)制備的顆粒，如熒光量子點、超順磁納米粒子以及金納米顆粒等，其納米尺度的直徑及結(jié)構(gòu)賦予其穩(wěn)定優(yōu)異的光電子學(xué)、磁學(xué)等性能，可作為外源性標記物標記細胞，分別用于干細胞的光學(xué)成像、磁共振/磁粒子成像及光聲成像等。這類具有成像功能的納米粒子統(tǒng)稱納米示蹤劑。納米粒子作為示蹤劑的優(yōu)點除了更穩(wěn)定、優(yōu)異的成像性能之外，還體現(xiàn)在以下幾個方面： (1) 可以通過控制制備方法及技術(shù)方便地調(diào)變示蹤劑的成像性能，如熒光量子點的發(fā)光波長可以從紫外紅移至近紅外區(qū)；(2) 可 以通過耦合或修飾的方法方便地對納米示蹤劑進行功能集成，使具備多模態(tài)成像功能或者結(jié)合分子影像探針進行細胞的功能成像。已有一些探索性的工作將基于納米顆粒的干細胞標記與其他標記技術(shù)結(jié)合，用于監(jiān)測治療過程中移植干細胞的位置、遷移、存活和分化，顯示出納米示蹤劑用于干細胞治療的巨大潛力。本文將按成像方法分類，介紹各種示蹤標記技術(shù)尤其是納米示蹤劑在移植干細胞活體示蹤中的應(yīng)用進展，并重點關(guān)注那些可以對干細胞的活死及分化功能狀態(tài)進行示蹤的工作。

1 基于光學(xué)成像的干細胞活體示蹤

1.1 熒光量子點結(jié)合報告基因技術(shù)示蹤干細胞活死

光學(xué)成像技術(shù)是一種經(jīng)典的活體成像技術(shù)，具有無創(chuàng)、高靈敏度、特異度、低成本等特點?；趫蟾婊驑擞浖夹g(shù)的光學(xué)成像被較早地用于干細胞的示蹤。報告基因標記需要在干細胞移植前，用攜帶有報告基因的質(zhì)粒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或慢病毒載體轉(zhuǎn)染干細胞，使細胞表達特異性酶、受體或蛋白，因為導(dǎo)入的基因只能在活細胞中表達，所以它的檢測可以推斷細胞的活性。但明顯的，報告基因技術(shù)由于轉(zhuǎn)染步驟的存在對干細胞損傷較大。且由于用于光學(xué)成像的報告基因一般是一些熒光蛋白[5]及熒光素酶[6]的基因，其發(fā)光區(qū)間一般落在可見光區(qū)，存在光穿透能力有限、發(fā)光壽命有限等缺陷。相比報告基因標記技術(shù)，基于納米熒光量子點的標記技術(shù)屬于外源性標記技術(shù)。成像前，通過簡單的共孵育實現(xiàn)熒光量子點對干細胞的標記，然后被標記的干細胞移植到活體后經(jīng)過激發(fā)光激發(fā)，由高靈敏度的CCD捕獲發(fā)射光子，實現(xiàn)對干細胞的示蹤。納米量子點相比生物熒光材料具有壽命長、光學(xué)信號穩(wěn)定、發(fā)光光譜范圍窄并且可調(diào)等優(yōu)點。但其發(fā)光仍需要外源的激發(fā)，因此也存在背景信號干擾問題，同時由于其組成為無機材料的特點，也無法直接對干細胞在活體內(nèi)的活死狀態(tài)進行反映。目前,有研究者將熒光素酶與量子點進行偶聯(lián),利用生物發(fā)光的自發(fā)冷光作為激發(fā)光,通過發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)方式使得量子點發(fā)射光信號。這種復(fù)合成像技術(shù)既能夠利用熒光素酶特異指示細胞活性的特性,又能利用量子點優(yōu)良的發(fā)光特性，還能克服其需要外源激發(fā)光的問題,是一種可高靈敏度、有效示蹤干細胞分布及細胞活性的光學(xué)成像技術(shù)。Ma等[7]以熒光素酶為模板，通過生物礦化合成了Luc8-PbS近紅外量子點，用該探針標記干細胞,移植活體后,注射熒光素底物,利用熒光素酶氧化底物發(fā)光激發(fā)量子點,發(fā)射具有更高組織穿透能力的近紅外熒光,來對干細胞進行活體示蹤。這種成像技術(shù)無需對細胞進行基因改造,目前已成功應(yīng)用于膠質(zhì)瘤細胞的標記和活體示蹤。Huang等[8]通過將Ag2S量子點、紅色螢火蟲熒光素酶(RFLuc)和Ⅰ型膠原啟動子驅(qū)動的熒光素酶(GLuc)結(jié)合起來，設(shè)計了一種復(fù)合納米光學(xué)探針： Ag2S的近紅外二區(qū)(NIR-Ⅱ)熒光成像有利于人骨髓間充質(zhì)干細胞(human mesenchymal stem cells， hMSCs)的定位，RFLuc和GLuc的生物發(fā)光成像可以分別用于實時報告hMSCs的活性和成骨分化，從而幫助了解移植的hMSCs與顱骨缺損部位的細胞外微環(huán)境之間的相互作用及干細胞促進骨再生的治療機制。所以，基于生物發(fā)光-近紅外量子點的偶聯(lián)復(fù)合納米材料有希望成為符合體內(nèi)干細胞示蹤要求的示蹤劑結(jié)合光學(xué)成像用于臨床應(yīng)用。只是目前量子點的發(fā)光效率普遍偏低[9]，發(fā)光光譜需要進一步紅移來改善成像深度，熒光素酶和量子點之間能量轉(zhuǎn)移效率也有待提高，這些方面可能是該類探針開發(fā)將來要有所針對的努力方向。

1.2 熒光量子點結(jié)合響應(yīng)性熒光分子示蹤干細胞功能

借用生物傳感器的設(shè)計原理，設(shè)計對干細胞死亡或分化功能關(guān)聯(lián)的特異性分子響應(yīng)的化學(xué)/生物顯像反應(yīng)結(jié)合到示蹤探針上，是一種解決干細胞死活以及功能示蹤的有效方法。Li等[10]制備了負載siRNA的上轉(zhuǎn)換熒光@多孔氧化硅(UCNP@MSN)復(fù)合納米粒子，用于干細胞標記和近紅外光控釋放siRNA。納米顆粒中負載的siRNA釋放促進了干細胞的成骨分化。此外，他們還通過對基質(zhì)金屬肽酶13(MMP13酶)響應(yīng)的多肽將聚集誘導(dǎo)發(fā)光(agg-regation-induced emission, AIE)探針分子連接到復(fù)合納米粒子表面。結(jié)果，成骨細胞特異性表達的MMP13酶通過裂解MMP13多肽觸發(fā)了AIE探針的釋放，從而在560 nm處產(chǎn)生熒光信號。因此，這類多功能復(fù)合納米粒子探針不僅可以促進干細胞定向分化，而且可以通過光學(xué)成像監(jiān)測干細胞的分化情況，為干細胞治療及機制研究提供了新的思路。

2 基于MRI的干細胞活體示蹤

2.1 報告基因技術(shù)結(jié)合MRI用于干細胞示蹤

相比于光學(xué)成像,MRI具有更高的組織穿透深度和分辨率,同時又可以獲得解剖和生理信息。鑒于報告基因技術(shù)的特點，結(jié)合了報告基因技術(shù)的MRI使在活體深層組織評估細胞存活、遷移和分化成為可能[11]。其原理為干細胞通過轉(zhuǎn)染報告基因表達含鐵的蛋白質(zhì)，提供內(nèi)源性MRI對比度[12]，或者在細胞內(nèi)表達與外源MRI探針反應(yīng)的蛋白，以增強MRI信號，從而實現(xiàn)對干細胞的活體示蹤[13]。近年來，研究者們已經(jīng)開發(fā)了幾種MRI報告基因，如β-半乳糖苷酶[14]、酪氨酸酶[15]、鐵基轉(zhuǎn)鐵蛋白受體[16]、鐵蛋白[11]等，其中，鐵蛋白是一種細胞內(nèi)鐵存儲蛋白，由24個重(H)和輕(L)亞基組成，可存儲和釋放鐵以維持鐵穩(wěn)態(tài)[17]。鐵蛋白的過表達通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達而捕獲過量的細胞內(nèi)鐵[18]，因此導(dǎo)致T2弛豫時間的明顯縮短，從而通過MRI信號檢出。鑒于鐵蛋白的生物相容性，此技術(shù)具有干細胞活體示蹤的臨床應(yīng)用潛力[19]。最近，Zhang等[20]采用鐵蛋白作為報告基因，標記植入梗死心臟的干/祖細胞，并通過對其體內(nèi)MRI信號進行定量評估，跟蹤移植到心臟中干細胞的存活，生長和遷移。Lim等[21]采用攜帶鐵蛋白MRI報告基因、熒光成像報告基因、增強型綠色熒光蛋白的慢病毒載體轉(zhuǎn)染NSCs，然后將之移植到患有急性缺血性中風(fēng)的大鼠健康紋狀體中后，進行了雙模態(tài)MRI和FLI成像，追蹤移植細胞的分布和遷移長達4周。然而,MRI報告基因的成像也存在一些缺陷,如不確定在細胞死亡后鐵蛋白復(fù)合物的降解速度和MRI信號的持續(xù)時間,同時活體檢測的靈敏度也較低。所以在評估細胞活死的過程中仍存在一定的不確定性。

2.2 磁性納米粒子標記結(jié)合MRI用于干細胞活體示蹤

超順磁性氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles， SPIONs)是一類直徑<10 nm的鐵氧化物納米顆?；蛴蛇@種納米顆粒組成的簇狀物。因為SPIONs顆粒的直徑極小，每個顆粒接近單個磁疇，當(dāng)對其施加外場時，整個顆?？梢匝刂粋€方向排列，具有很高的磁化強度；撤去外場時，熱擾動又足以破壞這個排列使顆粒失去磁性，此即其所具有的超順磁性。鑒于其顆粒直徑及表面修飾策略，SPIONs一般具有很好的水溶性和穩(wěn)定分散性。SPIONs中未成對電子自旋產(chǎn)生的局部磁場能夠顯著影響鄰近水分子質(zhì)子橫向弛豫時間T2值的變化，因此是陰性增強MRI造影劑。且相對于釓基MRI信號增強劑，SPIONs具有更好的生物相容性、更高的馳豫率、可降解性、更長的體內(nèi)留存時間及磁控靶向性等特點，近年來被廣泛用于標記干細胞。作為一種簡單有效的外源性標記策略，在動物模型上，SPIONs結(jié)合MRI已被用于ESCs[22]、BMSCs[23]、NSCs[24]等類型干細胞移植后的體內(nèi)示蹤。麥筱莉等[25]用聚賴氨酸修飾的SPIONs體外標記骨髓來源內(nèi)皮祖細胞，并觀察標記細胞移植至小鼠缺血性腦梗死模型后的遷移情況。行原位MRI并以普魯士藍染色輔助觀察標記細胞的遷移情況。MRI結(jié)果顯示，標記細胞腦內(nèi)移植1周后，移植區(qū)信號改變，并沿胼胝體向病灶側(cè)遷移，和普魯士藍染色結(jié)果一致。盡管如此，SPIONs外源性標記法用于干細胞的MRI示蹤仍有其不足之處。如隨細胞分裂，SPIONs標記信號會被稀釋直至最終失去示蹤作用；更關(guān)鍵的是，單純SPIONs標記也不能即時反映移植干細胞的存活及功能發(fā)揮狀況，所標記移植細胞已經(jīng)凋亡后，仍有MRI信號被檢測到，不符合干細胞體內(nèi)示蹤的真正要求。鑒于此，Scharf等[26]使用SPIONs和熒光蛋白雙重標記BMSCs，然后跟蹤其移植入肌腱損傷的大動物模型體內(nèi)后的活性及增殖狀況。結(jié)果證明以質(zhì)量濃度為25或50 μg/mL的SPIONs標記細胞時，干細胞的標記率分別為95%和94%，且細胞活性不受明顯影響；標記細胞的代謝活動和增殖能力與未標記的細胞無明顯差異。MRI顯示，在肌腱注射部位，第7天開始出現(xiàn)信號缺失。Ngen等[27]提出使用MRI雙對比技術(shù)來實現(xiàn)對移植干細胞遷移及活/死狀態(tài)的監(jiān)測。他們用SPIONs[T2造影劑，鐵含量為(14.8±1.7)pg/cell]和基于釓的螯合物GdDTPA[商品名： 馬根維顯，T1造影劑，釓含量為(3.3±0.2)pg/cell]對hMSCs進行雙重標記，在活細胞中，兩種造影劑都被包裹在有限的細胞空間中，彼此緊密接觸，標記細胞將產(chǎn)生明顯的T2/T2*對比度，而釓螯合物的T1對比度被湮滅。一旦細胞死亡，移植細胞的質(zhì)膜就會破裂，小直徑、快速擴散的釓螯合物同SPION分離，在死細胞附近產(chǎn)生T1增強信號。通過監(jiān)測移植細胞附近T1信號的變化可以在活體中監(jiān)測干細胞的活死狀態(tài)。當(dāng)然這種方法也有一些局限性。如GdDTPA從死細胞中釋放后清除很快，所以成像時間點對于獲得準確的讀數(shù)非常重要。且由于釓螯合物本來就是低靈敏度的MRI顯影劑，這種方法適合于造影劑會迅速積聚到可檢測水平的急性細胞死亡情況。值得一提的是，此前雖然有學(xué)者對SPIONs納米粒子在活體中長時間存在可能會釋放鐵離子引發(fā)一定毒性有擔(dān)憂，但目前也有一些研究證實這個問題可以通過控制SPIONs劑量及在SPIONs納米粒子表面進行一些有效修飾或者包覆來解決。

2.3 CEST造影劑結(jié)合MRI用于干細胞活體示蹤

化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移(chemical exchange satu-ration transfer， CEST)是一種新型MRI技術(shù)，與一般意義MRI增強劑基于改變水質(zhì)子弛豫時間不同，CEST造影劑基于自身被激發(fā)飽和的質(zhì)子與周圍游離水中未被飽和的質(zhì)子間化學(xué)位移不同而發(fā)生交換，引起磁共振信號改變來產(chǎn)生對比圖像的。由于質(zhì)子間的交換速率與組織微環(huán)境的pH值之間存在直接聯(lián)系，因而可以通過CEST-MRI信號間接對活體組織進行pH值成像。關(guān)鍵的是，CEST造影劑可以是外源性小分子和金屬螯合物，也可以是內(nèi)源性蛋白質(zhì)、多肽、葡萄糖或多糖分子，因而有更好的生物相容性。由于細胞的生理狀態(tài)(病理或者死亡)會引起細胞內(nèi)及微環(huán)境pH值的變化,通過開發(fā)合適的CEST造影劑，CEST-MRI可被用于示蹤移植干細胞的生理狀態(tài)。Chan等[28]報道了一種基于多聚L-精氨酸(具有多個可交換NH質(zhì)子的分子)的pH值敏感型CEST造影劑，用于在體監(jiān)測移植肝細胞的存活狀況。他們將聚精氨酸做成納米脂質(zhì)體，然后跟移植細胞封裝在藻酸鹽凝膠微球中,整體移植到肝臟組織中。微球中移植細胞死亡會引起pH值從正常的7.3左右下降到6.0左右,納米脂質(zhì)體CEST試劑中精氨酸發(fā)生質(zhì)子交換的速率對這個pH值變化敏感而隨之下降，產(chǎn)生可被檢測的CEST-MRI信號，從而可以利用MRI系統(tǒng)即時實現(xiàn)對移植細胞的活性檢測。此示蹤平臺的優(yōu)勢在于能夠?qū)⒁浦布毎纳嫘盘柵c高分辨解剖學(xué)成像信息結(jié)合起來,生物相容性好，有較好的臨床轉(zhuǎn)化潛能。但其不足之處在于并不能很好地反映移植后細胞的增殖過程。研究則將報告基因技術(shù)和CEST-MRI技術(shù)結(jié)合起來，將單純皰疹病毒-1型胸苷激酶(HSV1-tk)報告基因標記的MSCs與CEST-MRI探針5-methyl-5,6-dihydrothymidine(5-MDHT)共培養(yǎng)，然后移植到豬的心臟組織中，利用CXCL12對HSV1-tk基因表達的驅(qū)動作用及HSV1-tk對5-MDHT探針分子的召集作用這條關(guān)系鏈，通過CEST-MRI間接反映干細胞分泌CXCL12促進心肌修復(fù)的情況，巧妙地用CEST-MRI技術(shù)示蹤了移植干細胞的活死及功能狀況[29]。此項示蹤技術(shù)若結(jié)合前面Chan等[28]的納米脂質(zhì)體技術(shù)，將獲得更好的成像分辨率，具有好的在體干細胞示蹤臨床應(yīng)用價值。

3 基于超聲成像的干細胞活體示蹤

超聲成像(ultrasound imaging， US)技術(shù)利用探頭發(fā)射超聲波于組織上并接收回波數(shù)據(jù)來成像，由于不同組織的聲阻抗和衰減特性有差異，經(jīng)過不同組織的回波強度就產(chǎn)生了對比差異，因而成像能反映組織結(jié)構(gòu)。US幾乎無創(chuàng)且有良好的時空分辨率和較好的組織穿透深度，是可用于干細胞的活體示蹤的影像技術(shù)[30]。超聲造影劑是在US中用來增強圖像對比度的物質(zhì)。一般為微米級直徑的包膜微氣泡，通過靜脈注射進入血管后，可以改變組織的超聲特性(如背向散射系數(shù)、衰減系數(shù)、聲速及非線性效應(yīng))產(chǎn)生造影效果，其增強效果取決于超聲造影劑的濃度、直徑以及超聲發(fā)射頻率。1984年，F(xiàn)einstein等[31]發(fā)明了白蛋白包裹氣泡形成的超聲造影劑，此后基于氣泡的超聲造影劑研究得以快速發(fā)展。這類超聲造影劑一般在空氣氣泡周圍包裹白蛋白、脂類或多糖等，作為膜穩(wěn)定劑。最近20年，新型的氣泡型超聲造影劑氣體多為由氟碳類低彌散度、大相對分子質(zhì)量的氣體，氣泡的直徑也更小，即微泡超聲造影劑。微泡的直徑一般約幾微米，由一層厚度為幾十納米的膜包裹，膜的彈性及韌性也有所改進，穩(wěn)定性得以提高，可直接標記干細胞[32]。但微泡造影劑始終還是因為直徑大(相對細胞而言)、氣泡壽命短等問題不能很好地適用于干細胞的穩(wěn)定示蹤。這種情況下，基于剛性納米材料的超聲造影劑出現(xiàn)了。剛性顆粒和組織界面的聲阻抗差別較大使得納米顆粒可以顯著增強標記干細胞的US信號。重要的是，與傳統(tǒng)的基于脂質(zhì)或蛋白質(zhì)氣泡的US造影劑相比，剛性納米粒子在長期和穩(wěn)定地進行干細胞追蹤方面顯示出更大的優(yōu)勢。Jokerst等[33]發(fā)現(xiàn)通過籠蛋白和肌動蛋白內(nèi)吞，二氧化硅納米顆粒(300 nm)可以用來標記hMSCs顯著增強US信號(大約是未標記細胞的7倍)。US的檢測下限為70 000個細胞，大大低于基于釓標記的MRI的檢測限(250 000個細胞)，表明US具有更高的靈敏度，有助于提高干細胞移植治療的精準性。Chen等[34]報道了一種具有凹面介孔結(jié)構(gòu)類外泌體形貌的二氧化硅納米顆粒(exosome-like silica， ELS)。這些ELS納米顆粒的凹面介孔結(jié)構(gòu)對超聲波具有“多重散射/反射”效應(yīng)，從而能夠顯著提高其回聲能力，使之成為性能優(yōu)異的US造影劑。顆粒合成中引入的TSPA(一種含有胺基的硅源)，不僅利于外泌體形貌的形成，而且使ELS表面帶有正電荷，增強了其與干細胞的親和力。ELS納米顆粒標記干細胞后，可以通過US實時跟蹤監(jiān)測移植干細胞。當(dāng)然，ELS納米顆粒因其多孔的特性，還可以負載細胞因子等，從而提高移植干細胞的存活率[35]。此外，這些ELS顆粒很容易被化學(xué)修飾，可以在表面連接放射性核素或釓離子，成為多模態(tài)示蹤劑?？傊?，硅基納米粒子因其良好的生物安全性和可設(shè)計的多孔特性，跟超聲造影技術(shù)結(jié)合后，有潛力成為干細胞活體示蹤向臨床轉(zhuǎn)化的示蹤劑。今后可通過多孔結(jié)構(gòu)設(shè)計及表面改性進一步提高硅基納米粒子的干細胞標記及US示蹤能力。

4 基于光聲成像的干細胞活體示蹤

光聲成像(photoacoustic imaging， PAI)的原理基于光聲效應(yīng)： 近紅外激光以脈沖(1～100 ns)形式照射到目標介質(zhì)/組織上，介質(zhì)吸收光后產(chǎn)生熱彈性膨脹，能量以機械波的形式釋放,即光聲信號。光聲信號攜帶了介質(zhì)的光吸收特征信息，通過探測光聲信號能重建出介質(zhì)各部分的光吸收分布圖像。因此，光聲成像結(jié)合了純光學(xué)成像的高選擇性和純超聲成像的深穿透優(yōu)點，可得到高分辨率和高對比度的組織圖像，從原理上避開了光散射的影響，突破了高分辨率光學(xué)成像深度“軟極限”。PAI的成像設(shè)備易于操作，能夠以實時和非侵入性方式提供功能和解剖信息[36]?？紤]到光聲轉(zhuǎn)化效率，幾種在近紅外波長有強吸收的小分子染料，如FDA批準的ICG和其他近紅外花箐染料被用于PAI，但它們存在易光漂白和水溶性較差的問題[37]。為了解決這些問題，各種基于納米粒子的PAI探針已在動物模型上用于示蹤移植細胞[38]。Kim等[39]用聚賴氨酸(poly-L-lysine, PLL)修飾的普魯士藍納米粒子(Prussian blue nanoparticles-PLL, PB-PLL)有效標記了hMSCs。PB-PLL納米粒子在730 nm光激發(fā)下有很強的PAI信號，能夠?qū)π∈竽X中hMSCs的移植過程進行長達14 d的成像示蹤。此外，PB-PLL標記的hMSCs在小鼠模型上的檢測限為200 cells/μL，低于二氧化硅包裹的金納米棒的檢測限(約1 300 cells/μL)。此方法可定量評估到達靶點的細胞數(shù)量，但仍不能反映其植入后的存活狀態(tài)。為解決這個問題，Dhada等[40]通過將金納米棒與對活性氧類(ROS)敏感的染料IR775c相結(jié)合，開發(fā)了一種基于納米顆粒的復(fù)合PAI造影劑，標記干細胞并追蹤其活性。在該體系中，IR775c在795 nm處的PAI信號隨介質(zhì)中活性氧濃度的增加呈線性下降，而金納米棒在920 nm處保持成像穩(wěn)定性，與ROS濃度無關(guān)。因此，通過對795 nm和920 nm兩處信號進行定量比較，可以獲得移植MSCs的即時活性。總體而言，隨著PAI系統(tǒng)和基于納米顆粒的PAI造影劑的發(fā)展，使用實時PAI對移植干細胞進行準確和非侵入性檢測可以提高其治療效果，從而推動干細胞治療的發(fā)展。

5 基于多模態(tài)成像技術(shù)的干細胞活體示蹤

鑒于現(xiàn)有的示蹤技術(shù)(包括影像技術(shù)及造影劑)都各有其優(yōu)勢和缺點，沒有一種完全滿足前面提到的干細胞活體示蹤的所有要求。如譜系示蹤/報告基因技術(shù)結(jié)合光學(xué)成像雖然成熟且屬于極少的能實時體現(xiàn)干細胞活死狀態(tài)并能抗傳代稀釋的技術(shù)之一，但該技術(shù)使用前提是對細胞進行基因轉(zhuǎn)染，因此不滿足干細胞活體示蹤的安全性要求。且光學(xué)成像技術(shù)空間分辨率及成像深度也非常有限。而多模態(tài)示蹤將不同的造影技術(shù)聯(lián)合使用，使不同成像技術(shù)形成優(yōu)勢互補，不同來源的成像信息相互印證補充。尤其當(dāng)示蹤劑本身可以集成多種成像功能時，用于細胞標記可以使研究結(jié)果更為精確可信和全面，有望最終達到干細胞活體示蹤的要求。目前多模態(tài)成像用于示蹤干細胞活死狀態(tài)及功能的工作并不多，下面就列舉一些有代表性的工作。

5.1 PET結(jié)合MRI

如上文所述，因MRI增強造影劑超順磁氧化鐵納米粒子低毒、高靈敏度、磁控靶向性以及MRI成像大的穿透深度和高分辨率的特點，基于SPIONs的MRI仍然是目前干細胞示蹤研究的主要對象之一[41]。而基于SPIONs的MRI不能滿足的方面，如，對干細胞活性及功能的示蹤，可以由其他示蹤手段來互補。正電子發(fā)射斷層顯像(positron emi-ssion tomography， PET)是一種先進的臨床核醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)，是唯一可在活體上顯示生物分子代謝、受體及神經(jīng)介質(zhì)活動的新型影像技術(shù)。其成像原理： 將生物生命代謝中必需的物質(zhì)，如葡萄糖、蛋白質(zhì)、核酸、脂肪酸等標記上短壽命的放射性核素(18F、11C等)，并作為造影劑注入活體，然后通過跟蹤造影劑的代謝過程及分布，來反映組織和器官的功能情況。如以18F標記的脫氧葡萄糖為PET造影劑時，根據(jù)大部分惡性腫瘤組織中葡萄糖代謝旺盛、聚集較多的特點，PET能通過圖像對早期的腫瘤病變進行診斷[42]。但PET成像缺乏解剖學(xué)信息，且其較低的空間分辨率會使細胞的準確定位變得困難；此外，所應(yīng)用的示蹤劑半衰期有限，限制了它們作為長期細胞示蹤劑的使用[43]。PET和MRI雙模態(tài)造影不僅可以提供具有高軟組織對比度的解剖學(xué)信息，還可以對組織中標記的移植細胞進行高靈敏度成像及特定功能示蹤。有研究開發(fā)了18F標記的Fe3O4@Al(OH)3納米顆粒作為安全細胞示蹤劑在PET-MRI雙模態(tài)同步成像中的應(yīng)用： 早期使用PET快速、簡便地定位和量化納米粒子及標記干細胞MSCs，而MRI則提供高分辨率的解剖學(xué)信息和長期跟蹤[44]。Higuchi等[45]對人內(nèi)皮祖細胞分別進行了碘鈉轉(zhuǎn)運基因和氧化鐵納米粒子標記，以通過124I-PET和MRI結(jié)合顯像，對移植的HEPC的定位、存活以及心臟的形態(tài)學(xué)信息進行示蹤。報告基因的表達提供關(guān)于存活細胞數(shù)量的特異性信息，鐵氧體納米粒子標記提供組織形態(tài)學(xué)信息，此雙模態(tài)方法可對細胞定位和活性進行互補分析。

5.2 光學(xué)成像結(jié)合MRI

用于光學(xué)成像的熒光標記技術(shù)結(jié)合SPIONs-MRI的多模態(tài)成像也可用于移植干細胞的活體示蹤。Lim等[46]制備了含有SPIONs和近紅外熒光染料Cy5.5的殼聚糖復(fù)合納米粒子探針標記MSCs，以實現(xiàn)近紅外熒光-T2加權(quán)MRI雙模成像引導(dǎo)的細胞示蹤。首先他們用四乙?；腘-疊氮乙酰-d-甘露糖胺(Ac4ManNAz)處理hMSCs，通過糖工程在其表面生成疊氮(-N3)基團。然后，通過體外點擊化學(xué)方法對細胞表面進行復(fù)合納米探針標記。與單一納米粒子標記技術(shù)相比，這種復(fù)合標記方法可大大提高細胞標記的效率、安全性和成像靈敏度。在中風(fēng)小鼠模型中，經(jīng)腦實質(zhì)內(nèi)注射復(fù)合標記的hMSCs，采用雙模成像引導(dǎo)進行精確追蹤，實現(xiàn)了對標記hMSCs從植入部位到腦卒中病變?yōu)槠?4 d的遷移追蹤。研究開發(fā)了一種基于商用SPIONs Feru-moxytol和響應(yīng)Caspase-3釋放熒光的復(fù)合納米粒成像探針，用于干細胞的MRI和響應(yīng)熒光成像[47]?；贔erumoxytol的MRI可以實時觀察干細胞移植到小鼠顱骨缺損后的空間分布；Caspase-3響應(yīng)熒光基團則有助于檢測移植后因早期免疫排斥引起的干細胞死亡。這種雙模態(tài)成像示蹤有助對干細胞治療過程進行及時的矯正干預(yù)。

6 干細胞示蹤的挑戰(zhàn)和未來

綜上，基于納米材料獨特的納米尺度效應(yīng)(如超順磁性)、納米集成效應(yīng)(可以修飾各種功能分子、偶聯(lián)其他成像模態(tài)的分子)，好的成像靈敏度、結(jié)構(gòu)和化學(xué)穩(wěn)定性以及標記效率等方面的優(yōu)勢，納米示蹤劑結(jié)合各種成像方式已在移植干細胞的活體示蹤，尤其是最具挑戰(zhàn)性，也是最關(guān)鍵的干細胞活死示蹤及遷移、分化功能示蹤上取得了一些進展。治療的動物模型也涉及了中風(fēng)、心肌梗死、骨損傷及神經(jīng)系統(tǒng)損傷等疾病?；谶@些工作，人們對移植干細胞在體的命運轉(zhuǎn)歸已有初步了解，也發(fā)現(xiàn)了一些重要問題，如存活時間短、定植率低等。但跟干細胞治療機制更相關(guān)的干細胞在體分化、增殖及功能發(fā)揮等情況卻遠遠不夠明確。而且目前沒有一種基于納米材料的干細胞示蹤劑獲得FDA的批準。所以，一方面干細胞示蹤劑的研發(fā)有迫切的臨床需求，另一方面納米示蹤劑要真正轉(zhuǎn)化為臨床所用，還面臨很多挑戰(zhàn)。

首先，作為外源性標記物，無論是用于光學(xué)、MRI還是PET成像的納米示蹤劑都未能克服隨細胞傳代而濃度被逐漸稀釋的問題。移植干細胞在體內(nèi)增殖分化后，標記上去的納米示蹤劑會隨著干細胞的增殖或細胞胞吐而逐漸被稀釋，最終達不到成像需要的濃度而失去示蹤能力。其次，除部分商品化的SPIONs，目前對各種納米示蹤劑生物安全性的研究僅限于體外及動物實驗。標記有納米示蹤劑的移植干細胞在生物體中的代謝途徑、生物分布和長時間生物效應(yīng)還沒有得到系統(tǒng)的研究。因此，就生物安全性這方面，納米示蹤劑離臨床應(yīng)用也有較長的路要走。最后，對于確定成分的示蹤材料，其顆粒大小、形貌、表面性質(zhì)等都會影響其標記效率、細胞毒性、降解率和在體內(nèi)的存留時間。因此在設(shè)計納米示蹤劑時，為了獲得更好的生物相容性和標記、示蹤能力，需要更全面深入地考慮納米粒子合成策略及表面改性策略，然后再對其示蹤能力及生物效應(yīng)作相應(yīng)評估和定論。

按照文章開頭提出的移植干細胞活體示蹤要求，干細胞示蹤劑的未來發(fā)展應(yīng)該在以下方面： (1) 多 模態(tài)示蹤仍然是必然趨勢。鑒于干細胞活體示蹤對細胞存活、增殖、分化、遷移各方面的要求，只有將各種標記技術(shù)/成像模式結(jié)合起來取長補短才有可能部分或全部滿足這些要求。如雖然報告基因標記技術(shù)對干細胞的影響一直都飽受詬病，但目前只有這種標記技術(shù)能抗傳代稀釋且同時能反映細胞的存活狀況。鑒于目前基因轉(zhuǎn)染技術(shù)也在不斷改進提高其安全性和轉(zhuǎn)染/表達效率,未來基于報告基因標記技術(shù)的多模態(tài)示蹤必然還是很多研究者選擇的研究方向。MRI的安全性、高軟組織分辨率及深度優(yōu)勢也是別的成像模式無法替代的，基于CEST成像原理的MRI示蹤劑因其更好的生物安全性及細胞微環(huán)境pH值示蹤能力而值得采用。(2) 設(shè) 計基于生物傳感原理的響應(yīng)型示蹤劑很有必要。移植干細胞的死亡或正常分化必然伴隨一些特異性分子的釋放，只要找到了可對這些分子響應(yīng)的化學(xué)/生物顯像反應(yīng)并結(jié)合到示蹤探針上，便會成為解決干細胞死活以及功能示蹤的有效方法。而生物傳感器在過去幾十年的發(fā)展中已經(jīng)積累了豐富的對待測分子響應(yīng)的化學(xué)/生物檢測原理可以供干細胞示蹤劑的設(shè)計借用，如基于對Caspase-3響應(yīng)發(fā)光的策略可以報告干細胞的死亡。(3) 基于納米集成策略設(shè)計多功能示蹤平臺也是有必要的。從現(xiàn)有研究來看，移植干細胞在體內(nèi)存活時間仍然較短，定植及分化效率較低，因此，賦予納米示蹤劑磁性，利用外磁場幫助干細胞在靶部位定植，以及在納米示蹤劑中引入合適的生長因子和其他生物活性物質(zhì)以增強被標記干細胞活性、定向分化和遷移都是在設(shè)計新型多功能示蹤平臺時值得考慮的策略。