HO-1在不同病因肝硬化中的研究

孟 蝶，楊 慧，張曉倩，張曉華

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院感染病科，山西 太原 030001

肝硬化是一種由病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病(autoimmune liver disease,AILD)等多種病因引起的終末期肝病，以門脈高壓和肝功能減退為特征性臨床表現(xiàn)，失代償期肝硬化5年病死率為70%～86%。肝硬化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，是多因素共同作用的結(jié)果，炎癥與氧化應(yīng)激在其中有重要作用且直接與疾病進(jìn)展相關(guān)[1]。在氧化應(yīng)激作用下發(fā)生的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)[2]，為進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展提供了基礎(chǔ)。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是一種氧化應(yīng)激反應(yīng)蛋白，將具有強(qiáng)氧化作用的血紅素分解為一氧化碳、膽紅素、鐵，近年來(lái)這種酶促反應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)受到廣泛關(guān)注。HO-1及其代謝產(chǎn)物可通過(guò)抗炎、抗氧化、調(diào)控凋亡等發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用進(jìn)而抑制肝硬化進(jìn)展。不同原因的肝硬化發(fā)生機(jī)制不同，HO-1對(duì)于其保護(hù)作用的作用機(jī)理也有所差異，如何運(yùn)用不同作用機(jī)理調(diào)控HO-1表達(dá)抑制肝硬化進(jìn)展值得進(jìn)一步深入探討，本文對(duì)近年來(lái)HO-1在不同病因肝硬化中的研究作一概述。

1 HO-1概述及其在肝硬化中的作用

HO-1又稱熱休克蛋白32(heat shock protein 32，HSP32)，其基因定位于人染色體22q12，分子量為32 KDa，是廣泛存在于哺乳動(dòng)物中的可誘導(dǎo)酶，可經(jīng)缺氧、缺血再灌注、內(nèi)毒素、炎癥因子等多種因素誘導(dǎo)表達(dá)并產(chǎn)生保護(hù)作用。HO最早由Tenhunen等[3]于1968年發(fā)現(xiàn)存在于細(xì)胞微粒體中且他們同時(shí)發(fā)現(xiàn)HO-1在肝脾中活性最強(qiáng)。在正常的肝臟，HO-1主要存在于Kupffer細(xì)胞中，而在各種原因誘導(dǎo)的肝纖維化及肝硬化中，HO-1在HSC、Kupffer細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，廣泛參與了許多疾病的病理生理過(guò)程。

肝硬化患者血清中HO-1的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組，且主要分布于肝臟的門管區(qū)周圍及脾臟的紅髓區(qū)[4]。HO-1的表達(dá)及其催化血紅素的代謝產(chǎn)物可通過(guò)多種作用機(jī)制及通路在肝硬化及其各種并發(fā)癥中發(fā)揮保護(hù)作用。Wang等[5]使用Znpp抑制HO-1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，HO-1表達(dá)降低可通過(guò)Nrf2/Keap-1通路減少大鼠肝臟內(nèi)鐵沉積及一氧化碳釋放，從而抑制肝硬化進(jìn)展。此外，本課題組前期研究結(jié)果顯示，HO-1可通過(guò)調(diào)節(jié)PPAR/NF-κB信號(hào)通路及其下游炎癥因子的釋放抑制HSC的活化及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生而發(fā)揮抗纖維化作用[6]。因此，肝硬化患者血清HO-1水平的升高可能是機(jī)體自我保護(hù)機(jī)制的體現(xiàn)。但HO-1對(duì)肝硬化的保護(hù)作用存在一個(gè)閾值，肝硬化早期低水平HO-1誘導(dǎo)表現(xiàn)出保護(hù)作用，而在肝硬化晚期門脈高壓階段，HO-1過(guò)度表達(dá)則加重肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)門脈高壓高血流動(dòng)力循環(huán)改變，加重肝硬化[7]。HO-1還參與了包括肝性腦病、肝腎綜合征等在內(nèi)的多種肝硬化晚期并發(fā)癥的形成，但其在各器官中的表達(dá)不盡相同。

2 HO-1與病毒性肝炎肝硬化

隨著人們生活習(xí)慣的改變，肝硬化的病因譜也在發(fā)生著變化，但最新的研究結(jié)果顯示，病毒性肝炎仍為我國(guó)目前導(dǎo)致肝硬化的首要原因[8]，每年約33萬(wàn)人死于HBV或HCV感染導(dǎo)致的肝硬化及相關(guān)并發(fā)癥[9]。HO-1在病毒性肝炎肝硬化患者中的表達(dá)上調(diào)且其對(duì)于病毒性肝炎肝硬化的保護(hù)作用主要是通過(guò)其抗病毒作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

HO-1具有直接抗HBV作用，且以時(shí)間和劑量依賴的方式抑制病毒復(fù)制，其抗HBV機(jī)制是通過(guò)影響HBV核心蛋白的穩(wěn)定性，阻斷HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄后的各環(huán)節(jié)引起病毒載量的降低[10]。HO-1還可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答發(fā)揮抗HBV作用。有學(xué)者對(duì)乙肝肝硬化患者HO-1基因各等位基因及基因型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，rs2071746位點(diǎn)及rs2071749位點(diǎn)AG單倍型可能是乙肝肝硬化患病的危險(xiǎn)因素，但可因性別、民族、年齡、BMI、吸煙情況等不同而產(chǎn)生差異[11]，該研究結(jié)論或可為乙肝肝硬化的診治在基因水平提供新思路。

同樣HO-1可通過(guò)直接抗HCV抑制丙肝肝硬化的進(jìn)展，且HO-1對(duì)HCV的抑制作用強(qiáng)度與宿主基因多態(tài)性有關(guān)。miR-196及miR-let-7c等可靶向調(diào)控Bach1的表達(dá)進(jìn)一步誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)直接抑制HCV的復(fù)制[12]。HO-1催化血紅素的代謝產(chǎn)物也可發(fā)揮抗HCV作用，其中膽紅素占首要地位，膽紅素可直接抑制HCV-NS3/4a蛋白酶的活性從而發(fā)揮抗HCV作用，也可通過(guò)增強(qiáng)具有抗病毒功能的干擾素α2和α17的表達(dá)而減少HCV復(fù)制。鐵的抗HCV作用主要是由于鐵對(duì)HCV RNA聚合酶的二價(jià)結(jié)合位點(diǎn)具有很強(qiáng)的親和力，對(duì)HCV RNA聚合酶的NS5B具有抑制作用[13-14]。

3 HO-1與酒精性肝病肝硬化

酒精性肝病是長(zhǎng)期大量飲酒引起的慢性肝病，呈進(jìn)行性發(fā)展，酒精性肝病肝硬化占各種原因所致肝硬化的24.0%以上，已成為導(dǎo)致肝硬化的第二大病因[15]。長(zhǎng)期大量飲酒是酒精性肝病肝硬化的起始因素，長(zhǎng)期暴露于大量乙醇中，細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)表達(dá)活躍可催化乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，同時(shí)大量生成活性氧(ROS)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)肝硬化的進(jìn)展，因此CYP2E1的誘導(dǎo)被認(rèn)為是酒精所致氧化應(yīng)激的中樞途徑。Lu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，CYP2E1基因敲除的小鼠較野生型小鼠ROS的產(chǎn)生相對(duì)較少，肝硬化的程度也更輕，這也提示CYP2E1基因參與了酒精性肝病肝硬化的發(fā)生發(fā)展。Cong等[17]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染CYP2E1后的HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的氧化毒性可被HO-1的升高所抑制，同樣證明了HO-1在CYP2E1引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。HO-1催化的血紅素裂解反應(yīng)可直接抑制CYP2E1的合成進(jìn)而減弱乙醇誘導(dǎo)的ROS形成脂質(zhì)過(guò)氧化，而HO-1催化血紅素裂解的產(chǎn)物CO可通過(guò)降低CYP2E1的酶活性間接抑制ROS的形成從而發(fā)揮對(duì)肝硬化的保護(hù)作用。

酒精性肝病肝硬化除氧化應(yīng)激外，主要表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)，乙醇及其代謝產(chǎn)物可誘導(dǎo)TNF-α及IL等促炎細(xì)胞因子的釋放，這些細(xì)胞因子的釋放會(huì)活化中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞進(jìn)一步激活HSC產(chǎn)生大量膠原纖維，形成肝硬化。Xu等[18]通過(guò)慢性加單次暴飲乙醇喂養(yǎng)小鼠最佳模擬人體酒精性肝病的發(fā)病過(guò)程，證實(shí)了紫杉醇誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)對(duì)酒精性肝病所致肝損傷及肝硬化具有重要作用，其保護(hù)作用可能與抑制CYP2E1活性及炎癥因子TNF-α、IL-6等的分泌有關(guān)。以上結(jié)果表明，HO-1可作為酒精性肝病肝硬化疾病預(yù)測(cè)的重要方面。此外，最新研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)可上調(diào)Nrf2/Keap-1/HO-1通路的表達(dá)進(jìn)一步保護(hù)肝臟免受乙醇所致的氧化損傷[19]，且臨床中應(yīng)用的槲皮素、姜黃素、銀杏黃酮等對(duì)酒精性肝病的保護(hù)作用也是通過(guò)調(diào)控HO-1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

4 HO-1與非酒精性脂肪性肝病肝硬化

隨著人類生活方式及飲食習(xí)慣的改變，非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病率逐步上升，非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)患者10～15年內(nèi)肝硬化發(fā)生率為15%～25%[15]。非酒精性脂肪性肝病必須經(jīng)過(guò)NASH這一過(guò)渡階段才能進(jìn)展為肝硬化，在NASH患者肝組織內(nèi)異常增加的脂質(zhì)、游離脂肪酸通過(guò)增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化及氧化應(yīng)激反應(yīng)激活Kupffer細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，可加速HSC激活、轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步合成大量細(xì)胞外基質(zhì)并促進(jìn)血管生成相關(guān)基因表達(dá)，從而導(dǎo)致肝硬化。

血漿HO-1水平與NASH相關(guān)肝臟疾病發(fā)展密切相關(guān)，可能成為診斷NASH相關(guān)疾病的靈敏標(biāo)志物，且與血清白細(xì)胞計(jì)數(shù)聯(lián)合診斷靈敏度更高。miRNA參與NASH相關(guān)肝硬化的發(fā)生與發(fā)展，血晶素誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)能夠抑制Wnt信號(hào)通路進(jìn)而影響肝硬化進(jìn)程[20]。有學(xué)者通過(guò)建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型，用血晶素、鋅原卟啉進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，以明確HO-1基因調(diào)控阻止該病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)可通過(guò)增加SOD的表達(dá)與活性及調(diào)節(jié)IκK/IκB/NF-κB通路等兩方面抑制NF-κB基因的活化，NF-κB基因表達(dá)降低可減少ICAM-1及PDGF等炎癥因子及促纖維化因子的釋放，從而保護(hù)肝臟免受炎癥與氧化應(yīng)激的影響[21]。此外，南月敏教授團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果表明，HO-1高表達(dá)可抑制HSC活化，進(jìn)而下調(diào)α-SMA、HIF-1α、VEGF、iN0s、MIP-1α等血管生成相關(guān)基因的表達(dá)，阻止肝纖維化進(jìn)展[22]。同時(shí)該課題組研究發(fā)現(xiàn)，目前備受關(guān)注的扶正化瘀方通過(guò)調(diào)節(jié)IKKβ/NF-κB和TGF-β1/Smad信號(hào)通路及HO-1等氧化應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)來(lái)預(yù)防NASH相關(guān)肝硬化[23]。

已有學(xué)者在非酒精性脂肪性肝病的細(xì)胞和動(dòng)物模型中觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的完整性嚴(yán)重破壞，HO-1可減輕NASH相關(guān)肝硬化發(fā)展過(guò)程中的ROS累積，進(jìn)一步減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的肝細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮保護(hù)作用。Raffaele等[24]運(yùn)用TGF-β作為肝纖維化因子建立肝纖維化的體外模型，在其中發(fā)現(xiàn)HO-1活性抑制可使ROS水平增加及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物生成導(dǎo)致纖維化的發(fā)生和發(fā)展，這些新發(fā)現(xiàn)也為NASH相關(guān)肝硬化和HO系統(tǒng)之間的聯(lián)系提供了額外的證據(jù)。結(jié)合目前研究，我們認(rèn)為HO-1在NASH相關(guān)肝硬化中起積極作用，HO-1可作為NASH相關(guān)肝硬化的血清學(xué)標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，提高早期診斷率并指導(dǎo)臨床治療。

5 HO-1與自身免疫性肝病肝硬化

自身免疫性肝病肝硬化多由AILD引起，以自身免疫性肝炎及原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)為主。近年來(lái)，AILD的發(fā)病率或檢出率有所提高，已成為除病毒性肝炎外致肝硬化的又一主要原因，目前AILD發(fā)病機(jī)制尚不明確，大多數(shù)認(rèn)為與遺傳易感性和免疫紊亂有關(guān)。AILD發(fā)病過(guò)程中的異常免疫反應(yīng)可引發(fā)自身T淋巴細(xì)胞和 B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的激活與擴(kuò)增，產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)HSC活化及膠原合成，加速肝硬化的形成[25]。

PBC患者HO-1濃度及HO-1 mRNA表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，提示HO-1在PBC的進(jìn)展中可能發(fā)揮抗氧化應(yīng)激保護(hù)作用。同時(shí)研究[5]證實(shí),誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)可延緩肝硬化疾病進(jìn)展，其可直接抑制HSC活化，也可通過(guò)保護(hù)肝細(xì)胞、減輕炎性反應(yīng)、抑制細(xì)胞因子的釋放等間接抑制HSC的活化。Duan等[26]研究結(jié)果表明,降低或提高HO-1水平可能通過(guò)改變大鼠肝組織中TGF-β1的表達(dá)而誘導(dǎo)或抑制HSC的活性和增殖。高曉鵬等[27]在研究Nrf2/Keap1信號(hào)通路在PBC患者中的抗氧化應(yīng)激作用時(shí)證實(shí)，HO-1作為Nrf2的下游信號(hào)分子，參與了Nrf2/Keap1信號(hào)通路在PBC患者中的抗氧化應(yīng)激作用。Sass等[28]研究結(jié)果顯示，誘導(dǎo)HO-1表達(dá)可通過(guò)抑制半胱天冬酶-3的活性保護(hù)大鼠肝臟免受抗CD95抗體、抗CD3抗體、LPS、TNF-α等的損傷，減輕肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)及肝細(xì)胞凋亡?？梢?jiàn)HO-1高表達(dá)在自身免疫性肝病肝硬化中已成為對(duì)抗氧化應(yīng)激的一種機(jī)制，是延緩AILD向肝硬化進(jìn)展的重要靶點(diǎn)。

6 HO-1與藥物性肝損傷肝硬化

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)是指由各類處方或非處方的化學(xué)藥物、生物制劑、中藥、保健品等所誘發(fā)的肝損傷，由于我國(guó)醫(yī)務(wù)人員及公眾對(duì)藥物安全性問(wèn)題的認(rèn)知不夠，DILI的發(fā)生率有逐年升高趨勢(shì)。目前我國(guó)引起DILI的藥物中，主要是治療皮膚病及風(fēng)濕病等的中藥，其次是抗結(jié)核藥與解熱鎮(zhèn)痛藥。藥物及其活性代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體損傷和氧化應(yīng)激可通過(guò)多種分子機(jī)制引起肝細(xì)胞損傷和死亡，繼而引起肝硬化的發(fā)生。

抗結(jié)核類藥物以異煙肼(Isoniazid，INH)和利福平(Rifampicin，RFP)的肝臟損傷最為顯著，CYP2E1作為主要的微粒體催化酶，參與了INH的氧化代謝和肝毒性中間產(chǎn)物的生成，在INH-RFP引起的氧化應(yīng)激過(guò)程中，CYP2E1過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致HO-1受到抑制，從而使HO-1失去對(duì)INH-RFP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的保護(hù)作用進(jìn)而導(dǎo)致肝臟損傷[29]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，RFP及其活性代謝產(chǎn)物在細(xì)胞和動(dòng)物兩個(gè)層面均可增強(qiáng)肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激，采用Hemin誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)可減輕RFP所致的氧化應(yīng)激[30]。Yang等[31]對(duì)我國(guó)314例抗結(jié)核藥物性肝損傷(anti-TB drug-induced liver injury，ATLI)患者的HO-1基因型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，攜帶rs2071748的GG基因型患者發(fā)生ATLI的風(fēng)險(xiǎn)更高，這也說(shuō)明中國(guó)人群中HO-1基因多態(tài)性可能與ATLI易感性有關(guān)，因此我們可以考慮從基因水平出發(fā)更好地防治ATLI。

解熱鎮(zhèn)痛藥的代表是對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)，APAP的肝毒性主要是由其經(jīng)CYP450代謝轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物NAPQI引起，NAPQI可使肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體功能失調(diào)。目前，Nrf2/HO-1信號(hào)通路已經(jīng)成為APAP所致肝損傷研究領(lǐng)域的重點(diǎn)及熱點(diǎn)。顧佳毅等[32]研究結(jié)果顯示，低劑量的LPS可通過(guò)TLR預(yù)激活Nrf2/HO-1信號(hào)傳導(dǎo)通路，減輕APAP引起的氧化應(yīng)激，延緩DILI進(jìn)展為肝硬化。雖然目前有大量研究表明RFP具有肝毒性，但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)RFP通過(guò)AMPKα和Nrf2/HO-1途徑能有效保護(hù)肝臟免受APAP引起的氧化應(yīng)激[33]。綜上，HO-1主要通過(guò)抑制肝臟氧化應(yīng)激發(fā)揮對(duì)DILI所致肝硬化的保護(hù)作用，Nrf2/HO-1的深入研究或可為藥物性肝損傷肝硬化的治療提供新的策略。

從目前研究來(lái)看，HO-1作為人體內(nèi)重要的抗氧化酶，在肝硬化患者體內(nèi)明顯升高并具有保護(hù)作用，其機(jī)制主要與減弱肝硬化過(guò)程中的炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，我們認(rèn)為HO-1可能成為肝硬化的預(yù)測(cè)因子并為肝硬化的治療提供新思路。本課題組早期研究同樣也表明，肝硬化患者血清HO-1代償性高表達(dá)，且通過(guò)繪制ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，HO-1對(duì)肝硬化的疾病進(jìn)展程度有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值[34]。但HO-1對(duì)肝硬化的保護(hù)作用并不是無(wú)上限的，HO-1過(guò)表達(dá)可加速肝臟損傷，我們的研究結(jié)果證實(shí)Child-Pugh C級(jí)患者血清HO-1含量明顯低于Child-Pugh B級(jí)患者，這也提示HO-1的抗炎、抗氧化作用在肝硬化晚期可能出現(xiàn)耗竭，導(dǎo)致肝硬化患者病情迅速進(jìn)展。因此需對(duì)HO-1的具體作用機(jī)理、最適效應(yīng)及不同誘導(dǎo)方式等進(jìn)行深入研究，以便運(yùn)用適當(dāng)?shù)耐緩秸{(diào)控HO-1表達(dá)延緩肝硬化疾病進(jìn)展從而提高患者生活質(zhì)量。我國(guó)導(dǎo)致肝硬化的病因主要有病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、AILD等，大量研究結(jié)果顯示，HO-1對(duì)不同病因肝硬化均具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制不盡相同，本課題組比較了不同病因肝硬化患者血清中HO-1的表達(dá)，其間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[34]，但HO-1對(duì)肝硬化患者的預(yù)測(cè)能力及保護(hù)作用強(qiáng)度是否與病因相關(guān)仍需進(jìn)一步探討，以期從不同角度針對(duì)性地進(jìn)行防治。