NLRP3炎癥小體在缺血再灌注損傷中的作用研究進(jìn)展

唐天豪，張瑩

【提要】 缺血再灌注損傷是指器官在手術(shù)或外傷中遭受缺血打擊，血流恢復(fù)再通后進(jìn)一步加重器官損傷。炎癥反應(yīng)是引起缺血再灌注主要損傷之一，特別是NLRP3炎癥小體引起的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，主導(dǎo)各器官缺血再灌注炎癥損傷。近幾年研究表明可通過抑制炎癥小體改善缺血再灌注損傷。本文對NLRP3炎癥小體在重要器官缺血再灌注損傷中的作用研究進(jìn)行綜述。

缺血再灌注損傷（ischemia reperdusion injury，IRI）是指器官遭受一定時間的缺血缺氧，血流重新灌注后，進(jìn)一步加重器官結(jié)構(gòu)和功能損傷的現(xiàn)象，它是部分患者在圍手術(shù)期間發(fā)生并發(fā)癥的重要原因［1］。最近研究發(fā)現(xiàn)，IRI中炎癥反應(yīng)起著決定性作用，可通過抑制炎癥反應(yīng)減輕IRI程度［2－3］?，F(xiàn)有報道顯示，NLRP3炎癥小體在各器官IRI的病理生理發(fā)展中起著重要作用，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要成分。因此，本文就NLRP3炎癥小體在肝、腎、心肌、腦等重要器官缺血再灌注損傷中的作用進(jìn)行綜述。

1 NLRP3炎癥小體的結(jié)構(gòu)

炎癥小體是一組能夠激活主要炎癥反應(yīng)的蛋白復(fù)合體，它能夠在病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）或者損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的作用下激活炎癥級聯(lián)反應(yīng)［4］。根據(jù)傳感蛋白的結(jié)構(gòu)特點，炎癥小體主要有核苷酸結(jié)合域樣受體（nucleotide-binding domain-like receptors，NLRs），其中包含的成員主要有NLRP1、NLRP3、以及NLRP4等，以及黑色素瘤2樣受體（absent in melanoma 2-like receptors，ALRs），如黑色素瘤2（absent in melanoma 2，AIM2）［5］。目前由NLRP3蛋白為核心構(gòu)建搭造的炎癥小體是各界研究的重心。

NLRP3炎癥小體是由NLRP3、凋亡相關(guān)微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）以及胱天蛋白酶-1前體（pro-caspase-1）組成的復(fù)合體［6］，這三種蛋白之間的相互作用能靈活調(diào)節(jié)炎癥小體的結(jié)構(gòu)功能，以保證炎癥小體在適當(dāng)?shù)膱龊喜拍鼙患せ?。NLRP3依據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu)及功能可劃分為三個主要的結(jié)構(gòu)域：pyrin結(jié)構(gòu)域（pyrin domian，PYD）、可調(diào)節(jié)NLRP3活性的NACHT結(jié)構(gòu)域及富含亮氨酸重復(fù)序列的LRR結(jié)構(gòu)域［7］。位于N端的PYD可與其他蛋白的PYD結(jié)合并調(diào)節(jié)下游蛋白，如與ASC蛋白的PYD可形成NLRP3-ASC復(fù)合體［8］；NACHT結(jié)構(gòu)域可與三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）結(jié)合，將其水解并釋放能量調(diào)控NLRP3下游蛋白［9］；LRR結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸重復(fù)序列，具有參與調(diào)控NLRP3活性的作用［7］。

2 NLRP3炎癥小體的激活途徑

NLRP3作為NLRP3炎癥小體的的核心成分，是NLRP3炎癥小體促進(jìn)炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵調(diào)控蛋白，靜息時組織細(xì)胞內(nèi)的NLRP3蛋白含量很低，且多數(shù)是泛素化無活性的穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)NLRP3劇增后才能有效激活炎癥小體［10］。由于NLRP3炎性小體能夠激活炎癥級聯(lián)反應(yīng)，因此需要對其進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)控，其步驟大致分為以下二步［11－12］：第一步，啟動步驟。啟動步驟的主要目的是上調(diào)NLRP3和白細(xì)胞介素-1β前體（pro-interleukin-1β，pro-IL-1β）的表達(dá)以及誘導(dǎo)NLRP3翻譯后修飾，主要由PAMPs和DAMPs兩種不同的模式誘導(dǎo)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）激活，隨后上調(diào)NLRP3和pro-IL-1β的表達(dá)［13－14］。第二步，激活步驟。多種上游信號通過激活NLRP3誘導(dǎo)炎癥小體的形成，已被證實的上游信號主要有離子通道的異常開放（如K＋外流、Ca2＋超載、Cl－外流以及Na＋內(nèi)流）［15］、受損線粒體釋放的線粒體活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）以及線粒體脫氧核糖核酸（mitochondrial deoxyribo nucleic acid，mtDNA）［16－17］等。遭受各種刺激后，NLRP3通過同型NACHT結(jié)構(gòu)域之間相互作用寡聚，寡聚后的NLRP3再通過同型PYD-PYD之間的相互作用招募ASC，由多個ASC相互匯聚形成ASC斑點，組裝好的ASC再通過CARD-CARD的相互作用招募procaspase-1［7，18－19］，形成完整的NLRP3炎癥小體。炎癥小體通過剪切活化caspase-1，然后再切割pro-IL-1β、pro-IL-18成有活性的促炎因子IL-1β、IL-18，從細(xì)胞中釋放出來，介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)并加重組織缺血再灌注損傷［20－22］。

3 NLRP3炎癥小體在肝臟缺血再灌注損傷中的作用

肝臟缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperdusion injury，HIRI）是肝臟手術(shù)中導(dǎo)致肝功能障礙和嚴(yán)重并發(fā)癥的主要原因，HIRI的一個突出的特點就是發(fā)生過度的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥因子及趨化因子的釋放，招募循環(huán)中的嗜中性粒細(xì)胞黏附聚集在肝臟間隙中，釋放大量蛋白酶降解細(xì)胞，導(dǎo)致肝臟組織受到劇烈的損傷，破壞正常的組織結(jié)構(gòu)［23］。

Vargas等人［24］研究表明，小鼠HIRI模型通過給予甲狀腺激素（thyroid hormone，T3）預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)T3能夠通過上調(diào)腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），抑制NLRP3炎癥小體的激活和IL-1β的分泌以減輕HIRI，使用AMPK抑制劑化合物C（AMPK inhibitor compound C，CC）可逆轉(zhuǎn)這種保護現(xiàn)象。通過實驗結(jié)果分析，假手術(shù)組小鼠表現(xiàn)正常的肝組織病理形態(tài)和血清低AST水平，在沒有給予T3預(yù)處理的情況下，HIRI引起肝結(jié)構(gòu)破壞、肝細(xì)胞壞死、中性粒細(xì)胞浸潤以及NLRP3和IL-1β的mRNA及蛋白的表達(dá)升高，上調(diào)血清AST水平；使用T3處理組可明顯抑制NLRP3及IL-1β的表達(dá)水平，降低血清AST；而使用T3＋CC處理后不僅逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象，還進(jìn)一步加重肝損傷，上調(diào)血清AST水平。從病理組織學(xué)和血清AST水平來看，T3體內(nèi)給藥可抑制NLRP3和IL-1β表達(dá)水平，減輕肝損傷保護肝功能。Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）激活NLRP3炎癥小體的信號通路在HIRI病理生理中至關(guān)重要，El-Sisi等［25］人探討奧曲肽（octreotide，OCT）和褪黑素（melatonin，MLT）在HIRI中可以通過抑制TLR4／NF-κB／NLRP3信號通路減輕肝臟損傷，研究發(fā)現(xiàn)肝臟在發(fā)生IRI后血清ALT和AST會急劇上升，肝臟組織出現(xiàn)了嚴(yán)重的凝固性壞死、崩解以及出血進(jìn)入肝索，組織結(jié)構(gòu)失去正常形態(tài)，TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)增強，同時NLRP3、ASC和caspase-1三者mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)。單獨使用75μg／kg劑量的OCT處理可敲低TLR4、NF-κB以及NLRP3炎癥小體的表達(dá)，顯著降低小鼠血清ALT和AST水平，大大減輕了HIRI。Inoue等［26］人試驗發(fā)現(xiàn)HIRI后NLRP3的mRNA表達(dá)升高，表明NLRP3炎癥小體在HIRI中起著一定的作用。通過缺失NLRP3蛋白后發(fā)現(xiàn)肝臟組織受損面積縮小、血清ALT水平下降，并降低IL-1β、IL-6及CC趨化因子配體2（CC chemokine ligand 2，CCL2）等炎癥因子的分泌；免疫組化分析發(fā)現(xiàn)NLRP3缺失效應(yīng)使損傷區(qū)域中氧化物質(zhì)的表達(dá)和細(xì)胞凋亡數(shù)量降低；NLRP3缺失作用還能導(dǎo)致噬中性粒細(xì)胞遷移活性受損，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)肝臟組織中的噬中性粒細(xì)胞浸潤被顯著抑制，減輕炎癥反應(yīng)帶來的損傷。ASC對于炎癥小體在HIRI中促進(jìn)炎癥反應(yīng)有著一定影響，Kamo等［27］人的研究中談及ASC／caspase-1／IL-1β這一信號通路可以通過觸發(fā)高遷移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）在HIRI中誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。ASC蛋白缺失抑制了caspase-1／IL-1β信號傳導(dǎo)，并減輕HIRI損傷，使抗凋亡功能的局部增強，以及下調(diào)了HMGB1介導(dǎo)的和TLR4驅(qū)動的炎癥反應(yīng)。用重組HMGB1治療ASC缺失的小鼠可加重炎癥反應(yīng)。Huang等［28］人實驗顯示，NLRP3炎癥小體可被內(nèi)源性組蛋白激活，通過激活caspase-1和增加促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的產(chǎn)生促進(jìn)HIRI，并且NLRP3蛋白及caspase-1蛋白缺失可減輕HIRI。Zhong等［29］人發(fā)現(xiàn)干擾素基因刺激物（stimulator of interferon genes，STING）可通過STING／NLRP3軸促進(jìn)HIRI和炎癥反應(yīng)，抑制或敲除STING可減少HIRI中炎癥因子和趨化因子的分泌。

4 NLRP3炎癥小體在腎臟缺血再灌注損傷中的作用

腎臟缺血再灌注損傷（kidney ischemia reperdusion injury，KIRI）在臨床中常引起缺血性的急性腎損傷（acute kidney injury，AKI），導(dǎo)致腎臟細(xì)胞死亡、凋亡，損傷腎臟組織功能，最后進(jìn)展為慢性腎病。近幾年研究報道，炎癥小體相關(guān)基因在KIRI中顯著表達(dá)，激活促炎因子介導(dǎo)主要炎癥反應(yīng)［30－31］。

硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）是一種硫氧還蛋白抗氧化劑內(nèi)源性抑制劑，能夠與活化氧相互作用刺激炎癥反應(yīng)，Wen等［32］人的試驗研究證實NLRP3炎癥小體可以被mtROS／TXNIP／NLRP3信號通路激活以促使缺血再灌注后AKI。在小鼠KIRI模型中測得NLRP3、ASC蛋白表達(dá)和共定位增加，同時IL-1β、IL-18、caspase-1的成熟和分泌水平上調(diào)，免疫染色顯示NLRP3在IRI后的腎小管上皮細(xì)胞中高表達(dá)，并測得血清肌酐、血尿素氮和尿蛋白排泄率明顯上升，且腎小管上皮細(xì)胞壞死、刷狀緣脫落、管腔形成以及腎小管擴張。實驗證實NLRP3炎癥小體的激活是由于KIRI所致，并且NLRP3缺失會減輕KIRI誘導(dǎo)的腎臟損傷和炎癥小體激活水平，使用線粒體靶向抗氧化劑可通過抑制受損線粒體釋放mtROS激活NLRP3炎癥小體，減輕腎臟損傷并促進(jìn)腎功能恢復(fù)。Nazir等［30］人研究表明細(xì)胞保護性活化蛋白C（cytoprotection by activated protein C，aPC）可通過抑制NLRP3炎癥小體的活性減輕KIRI。在小鼠腎臟發(fā)生缺血再灌注24 h后，炎癥小體被顯著激活，NLRP3、pro-caspase-1以及pro-IL-1β蛋白表達(dá)明顯升高，進(jìn)一步增加IL-1β、IL-18以及caspase-1的成熟和分泌，同時血清肌酐、血尿素氮和腎臟損傷分子-1濃度升高，腎小管受到嚴(yán)重?fù)p傷。使用aPC處理的小鼠腎臟中NLRP3蛋白表達(dá)以及IL-1β、IL-18、caspase-1成熟和分泌顯著降低，逆轉(zhuǎn)腎臟炎癥損傷。Han等［33］人研究表明P2X4受體（P2X4 receptor，P2X4）在KIRI后能促進(jìn)腎小管炎癥小體活化并加劇缺血性AKI。實驗中小鼠腎臟經(jīng)過30 min的缺血再灌注后P2X4野生組可測得NLRP3、IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表達(dá)明顯升高，血漿中的血尿素氮、肌酐以及腎臟中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，且出現(xiàn)嚴(yán)重腎小管壞死和蛋白管型，腎小管充血擴張、細(xì)胞凋亡數(shù)增多，而P2X4缺陷組發(fā)生IRI后NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)與未發(fā)生IRI結(jié)局相似，不僅能夠抑制IL-1β和IL-18的成熟和分泌，還逆轉(zhuǎn)KIRI所致的缺血性AKI，后續(xù)試驗在P2X4缺陷組中加用P2X4激動劑，并未能上調(diào)NLRP3炎癥小體的表達(dá)。

5 NLRP3炎癥小體在心肌缺血再灌注損傷中的作用

心臟疾病是影響我們?nèi)祟惿眢w心理健康的主要問題原因之一，特別是由冠心病引起的急性心肌梗死，占據(jù)人類病死率首要地位。當(dāng)心臟發(fā)生急性心肌梗死后，最重要的治療措施便是溶栓或介入治療，治療同時常伴隨心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperdusion injury，MIRI）［34］，MIRI常誘發(fā)無菌性的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致局部組織細(xì)胞釋放相關(guān)分子模式因子激活炎癥小體，放大炎癥反應(yīng)、增加細(xì)胞死亡數(shù)量。

上述aPC還能在MIRI中保護心功能，Nazir等［30］人在小鼠MIRI中測得NLRP3、caspase-1以及IL-1β的蛋白表達(dá)上升，心肌梗死面積增加，且炎癥小體激活在先而心肌細(xì)胞凋亡在后。給予aPC治療的小鼠不僅減少了炎癥小體及促炎因子的表達(dá)，還縮小了心肌梗死面積，進(jìn)一步改善心功能。Yue等［35］研究發(fā)現(xiàn)MIRI中NLRP3炎癥小體激活可增加小鼠心肌梗死面積和加重心肌功能損傷，鈣蛋白酶能夠進(jìn)一步加強這一效應(yīng)，通過抑制或敲除鈣蛋白酶能夠降低NLRP3炎癥小體的激活，減輕心肌損傷、改善心臟功能。NLRP3炎癥小體激活可抑制自噬加重MIRI，meng等［36］人研究表明，MIRI大鼠心臟組織NLRP3的表達(dá)量高于正常野生型大鼠；與正常野生型大鼠相比，NLRP3缺失模型無論是否發(fā)生了IRI，NLRP3的表達(dá)量都處于低水平。除此之外，NLRP3缺失能縮減MIRI的心肌梗死面積；NLRP3缺失作用還能抑制MIRI血清心肌酶（AST、LDH和CK）的上調(diào)水平；缺失作用能夠顯著抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β表達(dá)水平，并且細(xì)胞凋亡數(shù)量更是被極大地抑制、減少；缺失作用還顯著上調(diào)自噬蛋白（Beclin1，Atg7，LC3II／LC3I）并降低抗自噬蛋白（p62）的表達(dá)。NLRP3炎癥小體確實在MIRI誘導(dǎo)的心肌損傷中發(fā)揮著重要的作用，NLRP3缺失可以通過激活自噬更進(jìn)一步改善這種損傷。Liu等［37］人研究表明，在小鼠MIRI中，缺血心臟表現(xiàn)為炎癥小體活性增強，NLRP3蛋白表達(dá)和caspase-1活性增加，促炎因子IL-1β和IL-18分泌增多。使用炎癥小體抑制劑可減輕炎癥損傷，減少心肌梗死面積的大小和細(xì)胞凋亡的數(shù)量。此研究進(jìn)一步證實ROS可以通過TXNIP／NLRP3通過激活炎癥小體，使用ROS清除劑能使TXNIP與NLRP3解離，抑制心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP3炎性小體的激活，減輕MIRI炎癥反應(yīng)。

6 NLRP3炎癥小體在腦缺血再灌注損傷中的作用

腦血管系統(tǒng)疾病一直是威脅人類生命健康安全嚴(yán)峻的問題，先前許多團隊研究表明，炎癥小體表達(dá)與多種大腦疾病相關(guān)，包括阿爾茨海默病、帕金森病及中風(fēng)等疾?。?8－40］。近來越來越多的研究證明NLRP3炎癥小體還與腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）有著密不可分的關(guān)系。

粉防己堿（tetrandrine，Tet）可通過沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，Sirt-1）／NLRP3信號通路減輕CIRI，wang等［41］人的實驗表明小鼠發(fā)生CIRI后，組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β以及IL-18表達(dá)升高，大腦梗死面積增加，且腦積水較假手術(shù)增多，使用Tet預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了這種損傷現(xiàn)象，不僅降低了NLRP3炎癥小體的表達(dá)，還減少了大腦梗死面積，上調(diào)了Sirt-1表達(dá)，證明Tet可通過上調(diào)Sirt-1表達(dá)抑制NLRP3炎癥小體的激活減輕CIRI，使用Sirt-1抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)Tet的這種保護作用，并上調(diào)NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)加重大腦梗死面積，如果同時使用Tet和Sirt-1抑制劑處理發(fā)現(xiàn)與單獨使用Sirt-1抑制劑結(jié)局相差無幾。Peng等［42］人先通過體外實驗證明，BV2細(xì)胞在氧-葡萄糖剝奪／復(fù)氧（OGD／R）后，ROS／NLRP3炎癥小體信號通路被激活導(dǎo)致mtROS生成增加，細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18表達(dá)升高，使用線粒體靶向抗氧化劑處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS明顯降低，進(jìn)一步證實了OGD／R誘導(dǎo)ROS生成主要是由于線粒體功能障礙引起的，抗氧化劑處理后的BV2細(xì)胞中NLRP3炎癥小體相關(guān)表達(dá)降低，結(jié)果表明mtROS對于NLRP3炎癥小體的激活至關(guān)重要，艾地苯醌能夠抑制mtROS／NLRP3炎癥小體這一信號通路，同時mtROS還可以促進(jìn)mtDNA的氧化，有助于NLRP3炎癥小體進(jìn)一步激活，并顯著增加BV2和PC12細(xì)胞的炎癥；隨后在動物實驗中證實，大鼠腦在發(fā)生IRI后，缺血區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3和caspase-1表達(dá)顯著增強，而艾地苯醌抑制了CIRI誘導(dǎo)的NLRP3和caspase-1上調(diào)，并減少大腦梗死面積和改善神經(jīng)功能。該實驗進(jìn)一步證明抑制NLRP3炎癥小體激活能夠保護IRI帶來的神經(jīng)損傷。近期研究表明，自噬可調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的激活，Wang等［43］人研究表明，大鼠腦發(fā)生IRI后，糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）活性增加并抑制自噬活性，LC3B-II／LC3B-I比率降低而p62相對升高，其NLRP3炎癥小體及活化的caspase-1、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平顯著增加，同時大腦梗死面積增加，神經(jīng)功能受到嚴(yán)重?fù)p傷；抑制GSK-3β的活性可增加LC3B-II／LC3B-I比率并降低p62的表達(dá)以增強自噬活性，同時抑制NLRP3炎癥小體激活，降低caspase-1、IL-1β、IL-18的表達(dá)，使用自噬抑制劑（3-MA）可逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象，更加說明增強自噬可抑制NLRP3炎癥小體激活可改善神經(jīng)功能、減輕CIRI。Ma等人［44］實驗表明，當(dāng)大鼠腦發(fā)生IRI后，NLRP3、ASC、caspase-1以及IL-1β蛋白表達(dá)增加，大腦缺血區(qū)域血液動力學(xué)發(fā)生了改變，同時大腦梗死面積、血腦屏障通透性以及腦積水顯著增加，細(xì)胞凋亡數(shù)增加、神經(jīng)功能減退，而用清開靈處理后可降低上述炎癥小體及促炎因子的蛋白表達(dá)水平，減輕MIRI并抑制炎癥反應(yīng)。

7 總結(jié)與展望

NLRP3炎癥小體是NLRs家族中研究最多最廣泛的炎癥小體，它能夠在肝、腎、心、腦IRI中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、加重器官損傷、延長器官功能恢復(fù)時間，抑制或敲除NLRP3后能夠減輕器官相應(yīng)的炎癥反應(yīng)損傷，促進(jìn)器官組織結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)，肯定了NLRP3炎癥小體在IRI中的關(guān)鍵作用。然而，NLRP3炎癥小體在IRI中的病理生理機制尚不清楚，仍需要我們今后更多的研究去探討這一機制。同時，NLRP3炎癥小體獨特的影響作用不只是在IRI中發(fā)揮，還可以通過在其他疾病的發(fā)生發(fā)展中介導(dǎo)其特殊的炎癥損傷反應(yīng)。因此，NLRP3炎癥小體今后的研究將成為國內(nèi)乃至國外關(guān)注的焦點。