基于GC-IMS和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析海鱸魚肉蒸制過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的變化

徐永霞，白旭婷，馮 媛，趙洪雷,*，李學(xué)鵬，勵(lì)建榮，儀淑敏,*，謝 晶，郭曉華

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，渤海大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 錦州 121013；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3.山東美佳集團(tuán)有限公司，山東 日照 276815）

海鱸魚（Perca fluviatilis）學(xué)名為日本真鱸，屬鱸形目，花鱸屬，是我國(guó)沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一[1]。海鱸魚主要分布于太平洋西部，在我國(guó)以黃海和渤海產(chǎn)量居多[2]。海鱸魚年產(chǎn)量大，據(jù)中國(guó)漁業(yè)年鑒最新統(tǒng)計(jì)，2019年我國(guó)鱸魚養(yǎng)殖年產(chǎn)量約18萬(wàn) t，比2018年增長(zhǎng)了8.16%[3]。海鱸魚的肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，富含蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，且鈣、鎂、鋅、硒、VA和B族維生素含量豐富，在市場(chǎng)上深受消費(fèi)者的青睞[4]。

熱處理是肉制品加工的重要方式，不僅可以提高食用安全性，而且可以賦予制品良好的風(fēng)味和色澤[5]。熱處理的方式和條件對(duì)肉品品質(zhì)具有重要影響。常見(jiàn)的食品熱處理方式包括蒸、煮、油炸和微波等，其中蒸制被認(rèn)為是最健康的熱加工方式，不僅可以較好地保留食材的營(yíng)養(yǎng)成分和原有的風(fēng)味特性，而且減少了油脂和鹽的攝入，更符合現(xiàn)代人們的健康飲食需求[6]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)水產(chǎn)品的要求不再局限于營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，也越來(lái)越注重其風(fēng)味品質(zhì)[7-8]。目前，關(guān)于魚肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究主要采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法、氣相色譜-嗅聞法、電子鼻技術(shù)等[9-10]。氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS）技術(shù)是近年來(lái)新興的一種快速檢測(cè)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的先進(jìn)技術(shù)，能同時(shí)獲得風(fēng)味物質(zhì)的構(gòu)成及樣品品質(zhì)判別信息，具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、操作方便且樣品分析溫度低等特點(diǎn)，更能真實(shí)反映樣品的風(fēng)味存在狀態(tài)[11]。此外，GC-IMS可對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行可視化表征，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣品的區(qū)分。目前GC-IMS技術(shù)已廣泛應(yīng)用于肉類、果蔬和酒類等食品中，在水產(chǎn)品中的應(yīng)用相對(duì)較少，應(yīng)用領(lǐng)域主要集中在關(guān)鍵香氣[12]和異味化合物[13]的鑒定，食品的分級(jí)、溯源、品質(zhì)評(píng)價(jià)[14-15]和質(zhì)量控制[16]等方面。GC-IMS技術(shù)在食品風(fēng)味領(lǐng)域中的研究逐漸增多，同時(shí)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法也為該技術(shù)在食品風(fēng)味分析中的應(yīng)用提供了重要貢獻(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)以海鱸魚為研究對(duì)象，采用GC-IMS技術(shù)結(jié)合正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）、模型驗(yàn)證及熱圖分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，研究不同蒸制時(shí)間對(duì)海鱸魚肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，旨在為海鱸魚的精深加工及食品化菜品的開(kāi)發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮海鱸魚，每尾長(zhǎng)（20±5）cm，尾質(zhì)量約1 kg，購(gòu)于遼寧錦州市林西街水產(chǎn)市場(chǎng)。

2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL602-L電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；FlavourSpec?風(fēng)味分析儀（配有LAV（Laboratory Analytical Viewer）分析軟件和GC×IMS Library Search定性軟件） 德國(guó)G.A.S公司；Checkmate3頂空分析儀丹麥Densensor公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

取海鱸魚背部肌肉，洗凈瀝干后切成大小均勻的魚塊，然后置于蒸鍋內(nèi)分別加熱4、6、8、10 min和12 min，取出吸去魚肉表面水分得到不同的蒸制樣品（Z4、Z6、Z8、Z10和Z12）。以未經(jīng)處理的新鮮魚肉塊為對(duì)照組（Z0）。

1.3.2 GC-IMS測(cè)定

自動(dòng)進(jìn)樣條件：準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品置于20 mL頂空瓶中，設(shè)置孵育溫度60 ℃，孵化轉(zhuǎn)數(shù)500 r/min，孵育時(shí)間15 min，采用頂空自動(dòng)進(jìn)樣的方式，進(jìn)樣量500 μL，進(jìn)樣針溫度65 ℃，不分流模式進(jìn)樣。

GC條件：采用石英毛細(xì)管色譜柱FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm，1 μm），柱溫60 ℃，載氣為氮?dú)猓ā?9.999%），載氣的流速程序見(jiàn)表1，遷移管溫度45 ℃，分析時(shí)間30 min，載氣/漂移氣為N2。

表1 GC檢測(cè)條件Table 1 Gas chromatographic conditions

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2019b軟件、SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。魚肉樣品中的揮發(fā)性成分采用儀器配套的LAV（Laboratory Analytical Viewer）軟件和Library Search軟件進(jìn)行采集和分析。利用LAV分析譜圖并進(jìn)行定量分析；通過(guò)Reporter和Gallery Plot插件對(duì)比指紋圖譜的差異；利用Dynamic PCA插件對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，以確定未知樣品的種類；應(yīng)用Library Search軟件內(nèi)置的NIST和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)揮發(fā)物進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海鱸魚肉風(fēng)味物質(zhì)的定性分析

如圖1所示，圖中遷移時(shí)間1.0 ms處紅色豎線表示反應(yīng)離子峰（reactive ion peak，RIP），每個(gè)樣品的遷移時(shí)間約為2.08 ms，各種風(fēng)味物質(zhì)的保留時(shí)間集中分布在100～380 s之間。RIP峰兩側(cè)的每個(gè)點(diǎn)反映了離子流的信號(hào)強(qiáng)度，代表一種揮發(fā)性物質(zhì)，點(diǎn)的顏色及面積表示物質(zhì)含量的大小，點(diǎn)的顏色越深、面積越大反映離子流的信號(hào)越強(qiáng)，物質(zhì)濃度越高，反之越低[17]。從圖1可直觀看出，樣品經(jīng)蒸制處理后揮發(fā)性物質(zhì)組成的差異，圖中淺藍(lán)色點(diǎn)和紅色點(diǎn)的數(shù)量明顯增加，且紅色點(diǎn)的顏色逐漸加深，說(shuō)明蒸制后樣品的風(fēng)味物質(zhì)含量明顯高于未經(jīng)蒸制處理的樣品。

圖1 海鱸魚肉蒸制過(guò)程中的特征風(fēng)味二維GC-IMS譜圖Fig.1 Two-dimensional GC-IMS spectra of characteristic flavor components in sea bass flesh during steaming process

為了進(jìn)一步分析蒸制過(guò)程中海鱸魚肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，采用GC×IMS Library Search軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性分析。依據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)的GC保留時(shí)間和離子遷移時(shí)間，以C4～C9的正酮類作為外標(biāo)物計(jì)算每種揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù)，通過(guò)與GCIMS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，完成對(duì)魚肉中揮發(fā)性物質(zhì)的定性分析[18]。如表2所示，海鱸魚蒸制過(guò)程中可明確定性的揮發(fā)性物質(zhì)共有43 種，包括提高待分析物濃度時(shí)，出現(xiàn)2 個(gè)分子時(shí)共用一個(gè)質(zhì)子或電子，形成二聚體的現(xiàn)象[19]。鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)碳鏈普遍集中在C3～C9之間，包括醛類12 種、醇類8 種、酮類5 種、酸類2 種、酯類2 種和含硫化合物1 種，其中醛類物質(zhì)的含量最高，其次是酮類和醇類物質(zhì)。

表2 海鱸魚肉蒸制過(guò)程中鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)Table 2 Volatile compounds identified in sea bass flesh during steaming process

2.2 不同蒸制時(shí)間下海鱸魚肉的風(fēng)味變化

利用GC-IMS分析海鱸魚肉蒸制過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，得到的風(fēng)味指紋圖譜如圖2所示。指紋圖譜中代表?yè)]發(fā)性物質(zhì)的點(diǎn)亮度發(fā)生明顯變化，說(shuō)明不同蒸制時(shí)間下魚肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成存在明顯差異。經(jīng)蒸制處理后，魚肉樣品中風(fēng)味物質(zhì)的含量明顯高于對(duì)照組。隨著蒸制時(shí)間的延長(zhǎng)，魚肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和濃度總體有不同程度的上升，這可能與魚肉蒸制過(guò)程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)、脂類的氧化和裂解有關(guān)，此外一定的熱處理可促進(jìn)魚肉中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的釋放，從而增加魚肉中揮發(fā)性物質(zhì)的含量[20]。榮建華等[21]通過(guò)固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析蒸制對(duì)脆肉鯇魚肉揮發(fā)性成分的影響，發(fā)現(xiàn)蒸制后魚肉中揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量及種類均高于生魚肉。

圖2 海鱸魚肉蒸制過(guò)程中的Gallery Plot圖Fig.2 Gallery Plot analysis of volatile flavor compounds in sea bass flesh during steaming process

由圖3可知，醛類物質(zhì)在海鱸魚肉中相對(duì)含量最高，其次是酮類和醇類物質(zhì)。據(jù)研究報(bào)道，醛類化合物（C6～C9）主要來(lái)源于不飽和脂肪酸的氧化降解或氨基酸的斯特勒克降解反應(yīng)，其氣味閾值比較低，對(duì)魚肉的整體風(fēng)味影響較大[22-23]。和生魚肉相比，蒸制處理顯著增加了魚肉中醛類物質(zhì)的含量，且隨著蒸制時(shí)間的延長(zhǎng)，魚肉中的己醛、庚醛、辛醛、壬醛、3-甲基丁醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-辛二烯醛和苯甲醛等醛類物質(zhì)的含量逐漸增加。己醛和庚醛主要產(chǎn)生于亞油酸和花生四烯酸的氧化，辛醛和壬醛主要由油酸的氧化形成[24]；烯醛類主要來(lái)源于亞油酸和亞麻酸的降解[25]。其中己醛有青草氣味，(E)-2-庚烯醛具有油脂香，對(duì)魚肉風(fēng)味均有重要貢獻(xiàn)。酮類和醇類物質(zhì)一般來(lái)源于脂肪酸的氧化降解，其氣味閾值通常高于醛類，但具有獨(dú)特的花香、水果香等令人愉悅的風(fēng)味，可能對(duì)特殊魚香味的形成有一定貢獻(xiàn)。隨著蒸制時(shí)間的延長(zhǎng)，魚肉中的1-辛烯-3-醇、1-庚醇、1-己醇、1-戊醇、1-丁醇、糠醇、3-呋喃甲醇、2-庚酮、2-戊酮和2-丁酮等醇類和酮類物質(zhì)含量逐漸增加。1-辛烯-3-醇主要由亞油酸的氧化產(chǎn)生，具有典型的蘑菇味和清香，可增強(qiáng)魚肉的脂香味[23]。酮類物質(zhì)如2-庚酮、2-丁酮可通過(guò)脂肪氧化和美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，有研究報(bào)道，酮類對(duì)消減腥味有一定的貢獻(xiàn)[25]。還有少部分物質(zhì)在蒸制4 min或6 min時(shí)含量較高，如戊醛、丁醛和乙酸乙酯等。3-甲基丁醇、二甲基二硫、丙酸等物質(zhì)在生魚肉中檢出的含量較高，而蒸制后含量逐漸降低。二甲基二硫化合物主要是由魚體內(nèi)含硫氨基酸降解產(chǎn)生，其氣味閾值極低，在高濃度時(shí)具有刺激性氣味，通常與變質(zhì)的海味有關(guān)[26]。3-甲基丁醇和丙酸具有令人不愉快的氣味，其在蒸制樣品中的相對(duì)含量顯著降低，說(shuō)明蒸制處理可明顯改善魚肉的風(fēng)味。

圖3 海鱸魚肉蒸制過(guò)程中揮發(fā)性組分的相對(duì)含量變化Fig.3 Changes in contents of volatile components in sea bass flesh during steaming process

2.3 OPLS-DA及熱圖聚類分析

2.3.1 樣品的OPLS-DA

OPLS-DA為能夠去除與X軸、Y軸有關(guān)的信號(hào)，建立物質(zhì)表達(dá)量與樣品類別間關(guān)系模型的有效判別分析統(tǒng)計(jì)方法[27]。利用OPLS-DA中的得分散點(diǎn)圖對(duì)不同蒸制時(shí)間下魚肉樣品中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。隨機(jī)改變分類變量的排列順序建立相應(yīng)的模型，RX2=0.966，RY2=0.879，當(dāng)R2和Q2處于0.5～1之間時(shí)，表明模型有較好的概括解釋率[28]：Q2=0.714，表示模型有較好的預(yù)測(cè)能力。當(dāng)模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力都比較好時(shí)，說(shuō)明構(gòu)建的模型穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)能力均達(dá)到要求，可用于區(qū)分不同蒸制時(shí)間下海鱸魚肉揮發(fā)性風(fēng)味組成的差異。

圖4 海鱸魚肉蒸制過(guò)程中的OPLS-DAFig.4 OPLS-DA plot of sea bass flesh samples with different steaming times

2.3.2 模型驗(yàn)證

利用置換檢驗(yàn)對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)樣本數(shù)據(jù)的隨機(jī)排列情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)推斷[29]。它將樣本進(jìn)行順序上的置換（n=200），重新得出統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)量，構(gòu)造經(jīng)驗(yàn)分布，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行推斷。Q2代表累計(jì)交叉有效性，其值與模型預(yù)測(cè)能力呈正比；R2代表累計(jì)方差值，表示有多少原始數(shù)據(jù)被用來(lái)建立新的OPLS-DA模型，其值大則表示模型的解釋能力強(qiáng)[30]。應(yīng)用OPLS-DA模型進(jìn)行擬合，其評(píng)價(jià)指標(biāo)為RX2=0.966，RY2=0.879，Q2=0.714，說(shuō)明所建模型擬合效果良好。為進(jìn)一步驗(yàn)證模型是否過(guò)擬合，將部分樣本的類別打亂，進(jìn)行200 次的置換擬合。如圖5所示，R2與縱軸相交（0，0.299），Q2與縱軸相交（0，-0.849），R2和Q2兩條回歸線斜率相對(duì)較大，左邊隨機(jī)排列產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)值R2和Q2均低于最右邊的R2和Q2值，且Q2回歸線的截距是負(fù)數(shù)，說(shuō)明OPLS-DA模型均無(wú)擬合現(xiàn)象，預(yù)測(cè)能力很好，可直接用于樣品的判別分析。

圖5 海鱸魚肉蒸制過(guò)程中OPLS-DA的擬合曲線Fig.5 Fitting curve of OPLS-DA for sea bass flesh samples with different steaming times

2.3.3 熱圖分析

通過(guò)熱圖和凝聚層級(jí)聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）法，將不同蒸制時(shí)間下的魚肉樣品與43 種揮發(fā)性化合物的關(guān)系進(jìn)行可視化。依據(jù)OPLS-DA模型中的變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）將每個(gè)變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)進(jìn)行量化，其中VIP值大于1的揮發(fā)性化合物可作為潛在的特征標(biāo)志物[31]。海鱸魚肉蒸制過(guò)程中共篩選出11 種特征揮發(fā)性標(biāo)志物（VIP＞1），包括醇類5 種、醛類4 種、酯類2 種。為了更加直接地區(qū)分不同蒸制處理下魚肉特征揮發(fā)性化合物的變化，依據(jù)每種風(fēng)味物質(zhì)的峰強(qiáng)度值繪制熱圖，結(jié)果如圖6所示。通過(guò)熱圖并結(jié)合HCA可以區(qū)分不同蒸制時(shí)間下海鱸魚肉樣品的風(fēng)味差異，可將具有不同風(fēng)味特征的魚肉大致分為3 類，分別為生魚肉（Z0）、蒸制4、6、8 min和10 min的魚肉（Z4、Z6、Z8和Z10）以及蒸制12 min的魚肉（Z12）。生魚肉中揮發(fā)性標(biāo)志物的種類較少，其中3-甲基丁醇在生魚肉中含量最高，其含量隨蒸制時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。Edirisinghe等[32]發(fā)現(xiàn)生魚中的異戊醇含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。因此，3-甲基丁醇可作為生魚肉的特征性風(fēng)味物質(zhì)。蒸制12 min的魚肉中1-庚醇、糠醇和(E)-2-庚烯醛的含量最高，這3 種風(fēng)味物質(zhì)可作為魚肉熟制后的特征性風(fēng)味物質(zhì)。

圖6 海鱸魚肉蒸制過(guò)程中特征風(fēng)味物質(zhì)的熱圖和HCAFig.6 Heatmap and HCA of characteristic flavor components in sea bass flesh samples with different steaming times

3 結(jié) 論

本研究采用GC-IMS技術(shù)對(duì)海鱸魚肉蒸制過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行分析，共鑒定出43 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醛類、酮類、醇類、酸類、酯類和含硫化合物，其中醛類物質(zhì)的相對(duì)含量最高，其次是酮類和醇類物質(zhì)。不同蒸制時(shí)間下海鱸魚肉的風(fēng)味物質(zhì)組成存在明顯差異，其中新鮮海鱸魚肉中3-甲基丁醇、二甲基二硫和丙酸等風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量較高，隨蒸制時(shí)間延長(zhǎng)，魚肉中醛類、酮類和醇類物質(zhì)的含量逐漸增加，如庚醛、辛醛、壬醛、3-甲基丁醛、(E)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-辛二烯醛、苯甲醛、2-庚酮、2-丁酮、1-辛烯-3-醇、1-庚醇、1-丁醇和3-呋喃甲醇等。采用OPLS-DA、熱圖聚類分析等計(jì)量學(xué)方法篩選出11 種揮發(fā)性標(biāo)志物（VIP＞1），并能較好區(qū)分不同蒸制時(shí)間下的海鱸魚肉樣品，其中3-甲基丁醇、1-庚醇、糠醇和(E)-2-庚烯醛可作為生熟海鱸魚肉的特征標(biāo)志物。