外源核苷酸對干酪乳桿菌生長的促進作用及機制

丁 婷，李 勇

（北京大學公共衛(wèi)生學院，北京 100191）

益生菌是一類對人體有益的活性微生物，主要定居于腸道、生殖道內。益生菌具有多種生理功能，不僅可以調節(jié)腸道功能，維持腸道菌群的平衡，還可以促進鈣、磷等微量元素的吸收，而且在治療腹脹、腹瀉、哮喘、痛風、糖尿病等疾病時發(fā)揮著重要作用[1-3]。然而，益生菌產品也具有一定的應用局限性，如對外界環(huán)境及胃環(huán)境敏感，或營養(yǎng)條件要求高而易失活，起不到對人體的有益作用?，F有能提高益生菌活性的物質有低聚果糖、低聚半乳糖、葡聚糖等，但這些快速發(fā)酵性寡糖能引起人體腹瀉和脹氣等缺點[4]。因此，尋找對人體安全且能促進益生菌生長增殖的物質亟待解決。

核苷酸是生物體內極重要的低分子化合物，是DNA和RNA的基本組成單位，作為細胞的主要成分，在細胞代謝、能量和功能調節(jié)等方面起到重要作用。研究發(fā)現，核苷酸具有多種生理功能，如免疫調節(jié)[5]、腸道菌群調節(jié)[6-7]、腸道修復[8]、抗感染[9]、促進生長發(fā)育[10-11]、延長壽命[12]等。由于機體從頭合成核苷酸的能力有限，在一些特殊情況下內源合成的核苷酸不能滿足機體需要，因此補充外源核苷酸則尤為重要。核苷酸也由“非必需營養(yǎng)素”轉變?yōu)椤鞍氡匦锠I養(yǎng)素”和“條件營養(yǎng)素”。由于其安全性，目前已添加到嬰幼兒配方奶粉中使用。

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）是在食品中應用廣泛的一種益生菌，具有降血壓、降膽固醇、緩解乳糖不耐癥、調節(jié)腸道菌群等益生作用，逐漸成為研究、開發(fā)的焦點，因此尋找促進干酪乳桿菌生長繁殖的物質具有重要意義。研究表明，外源核苷酸是腸道菌群的重要益生元[13-15]。鑒于此，本研究以干酪乳桿菌為研究對象，探究外源核苷酸對干酪乳桿菌的益生效應及機制，以期為提高干酪乳桿菌的存活率提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干酪乳桿菌Q1為從遼寧錦州酸菜中分離純化鑒定的菌株，保藏于本實驗室-80 ℃冰箱。菌株按1%比例接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h進行活化。

外源核苷酸5’-單磷酸胞苷（cytidine 5’-monophosphate，5’-CMP）、5’-單磷酸腺苷（adenosine 5’-monophosphate，5’-AMP） 大連珍奧生物技術股份有限公司；N-己?；?L-高絲氨酸內酯（N-hexanoyl-L-homoserine lactone，C6-HSL） 西格瑪奧德里奇貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

LabRAM HR Evolution拉曼光譜儀 法國HORIBA Scientific公司；LRH型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；TCS-SP8激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 德國徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 外源核苷酸對干酪乳桿菌生長的影響

以MRS培養(yǎng)基為空白對照，分別加入1%、2%、3%、4%的5’-CMP和5’-AMP，接種1%的干酪乳桿菌，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，每隔4 h取一次樣，采用二倍稀釋法對干酪乳桿菌進行活菌計數，繪制生長曲線。

1.3.2 干酪乳桿菌生長變化規(guī)律

微生物生長動力學模型可以描述不同生長環(huán)境和條件下微生物的數量與時間的關系。修正的Gompertz[16]和修正的Logistic模型[17]通常用于擬合微生物的生長數據。分別用修正的Gompetz模型、修正的Logistic模型非線描述干酪乳桿菌的生長變化規(guī)律。

修正的Gompertz模型：

式中：t為時間/h；Nt為時間t時的菌數/（CFU/mL）；Nmax為N0為最大和初始菌數/（CFU/mL）；μmax為最大比生長速率/h-1；λ為生長延滯時間/h。

修正的Logistic模型：

式中：Nt為時間t時的菌落數/（CFU/mL）；N0為初始菌落數/（CFU/mL）；A為擬合參數；μmax為最大比生長速率/h-1；λ為生長延滯時間/h。

1.3.3 外源核苷酸對干酪乳桿菌生物被膜、胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）的影響

干酪乳桿菌（1%）接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h。按1∶100比例稀釋后，將100 μL菌液和4.0%的5’-CMP和5’-AMP分別加入孔板中，MRS肉湯作為對照?？字蟹湃霟o菌蓋玻片和打磨過的鋅片（0.5 mm×0.5 mm，0.3 mm），37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后，用無菌水緩慢沖洗蓋玻片3 次，0.4%結晶紫溶液染色20 min，在顯微鏡下觀察細菌生物被膜的變化。將鋅片用無菌水緩慢沖洗除去未黏附的細菌。用2.5%的戊二醛溶液固定30 min后干燥30 min。用0.01 g/100 mL的吖啶橙溶液避光染色15 min后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3 次，干燥30 min。加入10 μL的封片劑，用CLSM進行觀察（發(fā)射波長525 nm，激發(fā)波長488 nm）。鋅片用無菌水緩慢沖洗后干燥，用拉曼光譜檢測外源核苷酸對干酪乳桿菌EPS含量和化學成分的影響。

1.3.4 外源核苷酸添加對干酪乳桿菌粗提物群體感應抑制活性及抗生物被膜活性的影響

干酪乳桿菌（1%）接種于MRS肉湯中，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h。按1∶100比例稀釋后取1 mL菌液加入100 mL的MRS肉湯中，加入4.0%的5’-CMP和5’-AMP，MRS肉湯作為對照，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，將菌液于12 000 r/min離心4 min，取上清液。用同體積的乙酸乙酯（含0.1%冰醋酸）萃取2 次后靜置1 h。將萃取后的乙酸乙酯進行旋轉蒸發(fā)（35 ℃）去除溶劑，加入1 mL甲醇溶解粗提物并用0.22 μm的濾膜過濾，貯藏于-20 ℃冰箱備用。

測定干酪乳桿菌粗提物的群體感應抑制活性前，需測定粗提物的最小抑菌濃度，以排除抑菌性的干擾。粗提物的最小抑菌濃度參照文獻[18]所述方法進行測定。在亞抑菌濃度下，粗提物的群體感應抑制活性通過報告菌株紫色色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026進行驗證。紫色色桿菌CV026培養(yǎng)至OD600nm為1.0。按1∶100的比例將培養(yǎng)物加入冷卻至50 ℃左右的LB瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入10 μL C6-HSL，混合均勻后倒平板（平板直徑90 mm）并用牛津杯打孔。將100 μL粗提物加入平板的孔中，置于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h并觀察平板顏色變化。每組3 個平行。為探究干酪乳桿菌粗提物抗生物被膜活性，將志賀菌（Shigella）按1%比例接種于LB肉湯培養(yǎng)基中28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h，按1∶100比例稀釋后取100 μL菌液加入96 孔板中，分別加入不同培養(yǎng)條件的干酪乳桿菌粗提物，不加粗提物的肉湯作空白對照。將96 孔板放置于28 ℃培養(yǎng)箱中靜置24 h。培養(yǎng)后，用無菌PBS沖洗3 遍。將VK3（丙酮溶解，10 mmol/L）加入2,3-二-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四氮唑-5-甲酰苯胺（2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide，XTT）（0.5 mg/mL，PBS溶解）中達到1 μmol/L濃度。將200 μL XTT-VK3溶液加入96 孔板中，37 ℃避光放置2 h，在490 nm波長處用酶標儀進行測試。每個樣品重復4 次取平均值。

1.3.5 干酪乳桿菌粗提物群體感應抑制活性的影響因素

為測定酶對干酪乳桿菌粗提物群體感應抑制活性的影響，向干酪乳桿菌粗提物中分別加入最適pH值下的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶，使其最終質量濃度為2.0 mg/mL，將上述溶液于37 ℃水浴鍋中放置4 h后用紫色色桿菌CV026平板測定其群體感應抑制活性，其中未加酶的粗提物作為對照。為測定溫度對干酪乳桿菌粗提物的群體感應抑制活性的影響，將干酪乳桿菌粗提物置于80 ℃和100 ℃水浴鍋中30 min，未處理的粗提物作為對照。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 外源核苷酸對干酪乳桿菌生長增殖的影響

圖1顯示，干酪乳桿菌在添加外源核苷酸的MRS培養(yǎng)基中較空白對照生長快，菌體迅速繁殖，很快進入對數生長期，活菌數較不添加核苷酸的空白組明顯提高，外源核苷酸濃度越高促進效果越顯著。其中，5’-AMP對細菌生長的促進作用更明顯，表明外源核苷酸可以加速細菌的增殖。用微生物生長動力學模型對細菌的生長曲線進行非線性擬合，結果顯示，修正的Gompertz方程和修正的Logistic方程可以較好地描述微生物的生長動態(tài)（R2＞0.919 78）。修正的Gompertz方程和修正的Logistic方程擬合后所得相關參數如表1所示。添加5’-CMP和5’-AMP后，細菌的最大比生長速率（μmax）較空白對照明顯增加，而延滯期（λ）則明顯縮短。上述結果表明外源核苷酸5’-CMP和5’-AMP對細菌的生長有明顯的促進作用。

圖1 干酪乳桿菌生長曲線用修正的Gompertz方程以及修正的Logistic方程擬合結果Fig.1 Growth curves of L.casei fitted with modified Gompertz and modified Logistic equation

表1 干酪乳桿菌用修正的Gompertz和修正的Logistic方程非線性擬合相關參數Table 1 Nonlinear parameters of L.casei fitted with modified Gompertz and modified Logistic equation

2.2 外源核苷酸對干酪乳桿菌生物被膜的影響

圖2a～c顯示，干酪乳桿菌添加外源核苷酸后，細菌生物被膜分泌增多，細菌由較為分散的狀態(tài)變得聚集，5’-AMP對細菌生物被膜的刺激作用更加明顯。圖2d～f顯示，對照生物被膜厚度為30 μm，添加5’-CMP后生物被膜增加到55 μm，添加5’-AMP后生物被膜則增加到70 μm，結果表明外源核苷酸5’-CMP和5’-AMP促進了干酪乳桿菌生物被膜的分泌。

圖2 光學顯微鏡及CLSM觀測外源核苷酸對干酪乳桿菌生物被膜的影響Fig.2 Effect of exogenous nucleotides on the biofilm of L.casei Q1observed by optical microscopy and CLSM

2.3 外源核苷酸對干酪乳桿菌EPS的含量及化學成分的影響

由圖3可以看出，添加5’-CMP和5’-AMP后，EPS的拉曼光譜峰強度增加。通過比對拉曼光譜特征峰[19]可以看出，干酪乳桿菌所產EPS的主要成分為蛋白質、碳水化合物、核酸以及脂質。添加5’-CMP和5’-AMP后，由EPS拉曼光譜圖可以看出，在544～553 cm-1處對應的碳水化合物分泌量增加；720～730 cm-1處對應的物質為腺嘌呤、色氨酸，添加5’-CMP和5’-AMP后細菌產生的這些物質含量也有所增加。在1 001～1 005 cm-1處的拉曼光譜條帶主要是苯丙氨酸；在1 200～1 290、1 300 cm-1的拉曼光譜峰顯示EPS中含有酰胺物質，添加5’-CMP和5’-AMP后此處的拉曼光譜峰強度增加，表明這兩種物質對EPS中酰胺III的產生具有刺激作用。1 605～1 620 cm-1和2 920～1 855 cm-1的拉曼光譜特征峰顯示，細菌所產的EPS中含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酰胺I、不飽和脂質以及孢粉素等物質，這些物質的變形振動主要由C＝C、CH2、CH3基團引起。添加5’-CMP和5’-AMP后拉曼光譜顯示對應的物質分泌量明顯增加。因此，外源核苷酸可以明顯增加干酪乳桿菌分泌EPS的量。

圖3 外源核苷酸對干酪乳桿菌EPS含量及化學成分的影響Fig.3 Effect of exogenous nucleotides on the content and chemical composition of EPS produced by L.casei

2.4 外源核苷酸對干酪乳桿菌粗提物群體感應抑制活性的影響

紫色色桿菌CV026是一種群體感應報告菌株，此菌自身不能產生信號分子，但是遇到外源的短鏈信號分子時，能產生紫色桿菌素使平板變紫色[20]。干酪乳桿菌粗提物的最小抑菌濃度為2 mg/mL。從圖4可以看出，添加C6-HSL的平板呈現紫色，當孔中注入亞抑菌濃度下的干酪乳桿菌粗提物時，孔周圍出現不透明的黃色暈圈，表明干酪乳桿菌粗提物具有群體感應抑制活性。干酪乳桿菌的培養(yǎng)基添加外源核苷酸（5’-CMP和5’-AMP）后，不透明的黃色暈圈增大，表明細菌分泌的具有群體感應抑制活性的物質增多，尤其是5’-AMP的促進作用更明顯，上述結果表明外源核苷酸具有刺激干酪乳桿菌產生群體感應抑制劑的作用。

圖4 5’-CMP和5’-AMP對干酪乳桿菌粗提物的群體感應抑制活性影響Fig.4 Effect of exogenous 5’-CMP and 5’-AMP on quorum sensing inhibitory activity of crude extract of L.casei Q1

2.5 外源核苷酸對干酪乳桿菌粗提物抗生物被膜能力的影響

從圖5可以看出，添加亞抑菌濃度下的干酪乳桿菌粗提物后，志賀菌分泌的生物被膜含量減少。外源核苷酸加入干酪乳桿菌培養(yǎng)基后，其粗提物對志賀菌生物被膜的抑制作用明顯增加，5’-AMP的添加對粗提物抗生物被膜活性促進作用更顯著。以上結果表明外源核苷酸的添加增加了干酪乳桿菌抗生物被膜物質的產生。

圖5 外源核苷酸對干酪乳桿菌粗提物抗生物被膜活性的影響Fig.5 Effect of exogenous nucleotides on anti-biofilm activity of crude extract of L.casei Q1

2.6 蛋白酶和溫度對干酪乳桿菌粗提物群體感應抑制活性的影響

從圖6可以看出，干酪乳桿菌粗提物經4 種酶處理后，群體感應抑制活性消失，表明粗提物對蛋白酶敏感，因此粗提物中的群體感應抑制活性物質推測為蛋白質類物質。用高溫處理干酪乳桿菌粗提物后，其群體感應抑制活性不變，表明粗提物中的群體感應抑制活性物質具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖6 蛋白酶（A）和溫度（B）對干酪乳桿菌粗提物群體感應抑制活性的影響Fig.6 Effects of protease (A) and temperature (B) on the quorum sensing inhibitory activity of crude extract of L.casei Q1

3 討 論

干酪乳桿菌具有的多種對人體有益的功效已被證實[21-23]。但是由于易失活的特點也限制了其應用。因此，外源核苷酸這種安全性好且能促進益生菌生長的物質受到越來越多關注。本研究將外源核苷酸（5’-CMP和5’-AMP）添加到干酪乳桿菌的培養(yǎng)基后，細菌的最大比生長速率提高，延滯期縮短，表明這兩種外源核苷酸對細菌的增殖及生長代謝具有促進作用。

細菌產生的生物被膜是細菌為了適應環(huán)境，黏附于固體或有機腔道表面，形成微菌落，并分泌EPS將自身包裹其中而形成的膜狀物[24]。生物被膜和EPS均受到細菌群體感應系統(tǒng)的調控[25-26]。群體感應是一種細菌之間通過分泌信號分子而進行通訊的機制。信號分子具有多種類型，大多數革蘭氏陰性菌由高絲氨酸內酯類作為信號分子；革蘭氏陽性菌由寡肽作為信號分子。此外，細菌種間（內）信息交流則由呋喃硼酸二酯類介導[27-30]。添加外源核苷酸后，干酪乳桿菌分泌的生物被膜和EPS含量都明顯增加，表明外源核苷酸很可能促進了干酪乳桿菌群體感應系統(tǒng)，從而導致生物被膜和EPS含量增加，使得細菌對外界不利環(huán)境的抵抗能力增加。對干酪乳桿菌粗提物的群體感應抑制活性測定也表明，外源核苷酸的添加刺激了干酪乳桿菌分泌具有群體感應抑制活性物質的產生。干酪乳桿菌的粗提物對蛋白酶敏感，因此粗提物中的群體感應抑制活性物質推測為蛋白質類物質。用高溫處理干酪乳桿菌粗提物后，其群體感應抑制活性不變，表明粗提物中的群體感應抑制活性物質具有良好的熱穩(wěn)定性，初步推斷此物質為細菌素類物質。Chahad等[31]發(fā)現，從海水魚中分離的乳酸菌對多種致病菌具有拮抗性，其粗提物熱處理后仍具有抑菌性，經鑒定此物質為II型乳酸菌素。Campos等[32]也發(fā)現分離于大菱鲆的乳酸菌可以產生細菌素抑制多種病原微生物。

志賀菌屬即通稱的痢疾桿菌，細菌性痢疾是最常見的腸道傳染病，夏秋兩季患者最多[33-34]。傳染源主要為病人和帶菌者通過污染了痢疾桿菌的食物、飲水等經口感染。志賀菌侵入腸黏膜組織并釋放內毒素引起癥狀，癥狀為劇烈腹痛、腹瀉、發(fā)熱，嚴重者出現痙攣和休克[35]。由于抗生素的濫用，造成志賀菌產生了耐藥性，因此，尋找新的抗菌靶點或開發(fā)新型抗菌藥物顯得十分重要和迫切。而以上實驗結果表明，外源核苷酸可以刺激干酪乳桿菌分泌對抗志賀菌等食源致病菌的物質，這一發(fā)現也表明外源核苷酸可作為優(yōu)質益生元使用，對提高益生菌活力、減少腸道致病菌感染、調節(jié)腸道菌群具有巨大的潛力。

4 結 論

本研究發(fā)現外源核苷酸（5’-CMP和5’-AMP）對干酪乳桿菌的生長、生物被膜、EPS產生、粗提物的群體感應抑制活性、抗生物被膜活性均有明顯的促進作用。2 種外源核苷酸很可能促進了干酪乳桿菌的群體感應系統(tǒng)，從而增強了細菌對環(huán)境的抵抗力所致，因此5’-CMP和5’-AMP可作為優(yōu)質益生元使用，對增強市售益生菌產品的存活率、調節(jié)腸道菌群、維護腸道健康具有重要意義。