茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒不同生產(chǎn)輪次釀造環(huán)境的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)特征

王 琳，胡小霞，黃永光

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

中國(guó)傳統(tǒng)白酒作為華夏民族最古老的酒精飲料之一，擁有8 000多年的悠久發(fā)展歷史，以文化底蘊(yùn)深厚、釀造工藝復(fù)雜以及風(fēng)味豐富多彩而聞名世界，為世界六大蒸餾酒之一[1]。中國(guó)白酒釀造產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境各異，致使微生態(tài)各不相同，進(jìn)而導(dǎo)致品種繁多、香型各異。醬香型白酒作為中國(guó)白酒的傳統(tǒng)典型酒種之一，具有醬香突出、幽雅細(xì)膩、回味悠長(zhǎng)、空杯留香持久等特點(diǎn)[2]，其受到更多消費(fèi)者青睞，呈現(xiàn)快速發(fā)展的良好態(tài)勢(shì)[3-4]。醬香白酒的發(fā)展與其自身優(yōu)良的品質(zhì)密不可分，而好品質(zhì)來(lái)源于匠心獨(dú)具的生產(chǎn)工藝流程與天然不可復(fù)制的釀造微生物環(huán)境。位于赤水河畔的茅臺(tái)鎮(zhèn)是中國(guó)醬酒圣地，被譽(yù)為“中國(guó)第一酒鎮(zhèn)”，其釀造環(huán)境空氣濕度和溫度為參與白酒釀造的微生物菌群繁衍生息提供了適宜的條件。茅臺(tái)鎮(zhèn)獨(dú)特的釀造環(huán)境及其基酒的特殊風(fēng)味是其他地區(qū)所無(wú)法比擬的，充分說(shuō)明釀造環(huán)境及其微生物對(duì)白酒釀造的重要性。環(huán)境微生物主要包括細(xì)菌、酵母菌、霉菌和放線菌[5]，其中，細(xì)菌作為白酒釀造過(guò)程中生香和產(chǎn)酶的關(guān)鍵功能微生物，直接影響酒體風(fēng)味的形成[6]。因此，系統(tǒng)研究釀造環(huán)境中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成分布及其多樣性有助于充分認(rèn)識(shí)釀造環(huán)境對(duì)白酒釀造的影響機(jī)制，從而揭示釀造環(huán)境微生物在釀造過(guò)程中的關(guān)鍵性作用。

近年，研究者越來(lái)越關(guān)注白酒釀造核心產(chǎn)區(qū)的價(jià)值，茅臺(tái)鎮(zhèn)的地域優(yōu)勢(shì)與釀造價(jià)值備受關(guān)注，尤其是釀造微生物生態(tài)效應(yīng)[7]。譚旭[8]對(duì)茅臺(tái)地區(qū)赤水河水體四季上下游的微生物多樣性進(jìn)行分析，得出細(xì)菌種類(lèi)夏季＞冬季＞秋季＞春季的結(jié)論。張亞麗[9]研究了茅臺(tái)鎮(zhèn)空氣中的微生物，發(fā)現(xiàn)參與醬香白酒釀造的部分微生物來(lái)源于環(huán)境空氣。黃永光等[10]論述了茅臺(tái)酒極端釀酒環(huán)境和極端微生物間的關(guān)系，并呼吁保護(hù)茅臺(tái)鎮(zhèn)環(huán)境釀酒微生物資源。王興初等[11]研究了茅臺(tái)酒生產(chǎn)環(huán)境中的空氣細(xì)菌區(qū)系，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在長(zhǎng)期的釀造過(guò)程中不斷被選擇富集，最終形成密度較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的特定細(xì)菌區(qū)系。文獻(xiàn)查閱顯示，關(guān)聯(lián)醬香白酒釀造環(huán)境細(xì)菌菌群的系統(tǒng)性研究和解析，特別是對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境的細(xì)菌菌群極其有限，更缺乏對(duì)各釀造輪次細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)之間的多樣性、異同性的系統(tǒng)研究。致使對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)與醬香白酒釀造品質(zhì)之間的相關(guān)性機(jī)理、機(jī)制仍然是模糊的，這十分不利于茅臺(tái)鎮(zhèn)白酒產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量的可持續(xù)發(fā)展。因此，系統(tǒng)全面地研究不同釀造輪次釀造環(huán)境中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及其演替規(guī)律，對(duì)科學(xué)認(rèn)識(shí)醬香白酒核心產(chǎn)區(qū)的獨(dú)特性及其釀造科學(xué)機(jī)制具有深遠(yuǎn)意義和重大價(jià)值。

本研究結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)與數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒1～7輪次釀造環(huán)境樣本中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成及多樣性、差異性進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨在揭示茅臺(tái)鎮(zhèn)各輪次釀造環(huán)境的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成分布，進(jìn)一步為“世界醬香白酒核心產(chǎn)區(qū)”打造及茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品采自貴州省仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)7 個(gè)醬香白酒主釀區(qū)（根據(jù)釀造企業(yè)集中度、地理區(qū)位分，分別為鎮(zhèn)觀音寺區(qū)、茅臺(tái)鎮(zhèn)上坪村、茅臺(tái)鎮(zhèn)椿樹(shù)村、茅臺(tái)鎮(zhèn)巖灘村、茅臺(tái)鎮(zhèn)向陽(yáng)村、茅臺(tái)鎮(zhèn)盧榮壩村和合馬鎮(zhèn)街道社區(qū)）的17 個(gè)代表性釀酒企業(yè)的釀造環(huán)境，采樣點(diǎn)如圖1所示。按照輪次劃分，將相同輪次及同一區(qū)域內(nèi)的不同釀造環(huán)境樣品等量混合為該輪次該主釀區(qū)的綜合樣，共49 個(gè)綜合樣品。環(huán)境取樣點(diǎn)包括：釀造生產(chǎn)車(chē)間窗戶、窗臺(tái)、墻體、梁柱、晾堂、行車(chē)梯、配電箱和消防箱、儲(chǔ)酒罐、溝渠表面及車(chē)間外地面。取樣時(shí)間為2018年1—9月，茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造1～7輪次釀造生產(chǎn)的堆積發(fā)酵期。每個(gè)采樣點(diǎn)（釀造區(qū)域環(huán)境）的樣品采集點(diǎn)均固定在同一采樣位置。每輪次樣品采集完后及時(shí)將樣品轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱密封保存。

圖1 茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境樣品采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling points of fermentation environmental samples in Maotai town

1.1.2 試劑

E.Z.N.A.Soil DNA Kit 美國(guó)Omega BioTek公司；rTaqDNA聚合酶試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Marker 大連TaKaRa公司；引物合成 生工生物工程（上海）股份有限公司；Gengreen染料 上海賽百盛有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 廈門(mén)致徽儀器有限公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)ABI公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司；MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA提取

各取混勻的綜合樣品20 g于100 mL離心管中，加入35 mL滅菌后的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）懸浮和3～5 顆玻璃珠，充分振蕩7 min，400 r/min離心5 min，吸取上清液。沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩4 min，400 r/min離心5 min，收集上清液。重復(fù)上一步操作共收集40～50 mL上清液，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀。預(yù)處理后每個(gè)樣品的總DNA提取步驟參考E.Z.N.A.Soil DNA Kit的操作說(shuō)明書(shū)。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增

細(xì)菌PCR擴(kuò)增引物：338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3’）；擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系20 μL，分別為4 μL 5×FastPfu緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL引物（5 μmol/L）、0.4 μL FastPfu聚合酶、10 ng DNA模板。

1.3.3 Illumina MiSeq測(cè)序

利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)，分別對(duì)細(xì)菌V3-V4高變區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序分析（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和分析?；贗llumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，利用R語(yǔ)言、Origin作圖軟件、SIMCA 14.1繪制稀釋曲線、豐度圖和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析

2.1.1 基于可操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類(lèi)分析

利用MiSeq平臺(tái)的擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)分析茅臺(tái)鎮(zhèn)1～7輪次釀造環(huán)境中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及演替規(guī)律，共獲得1 049 629 條高質(zhì)量序列。應(yīng)用稀釋曲線測(cè)序數(shù)據(jù)量可表征樣本中物種的豐富度、均一性或多樣性，并說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理[12]；Shannon指數(shù)曲線可反映樣本微生物多樣性[13]。圖2表明，本研究每個(gè)樣本的序列數(shù)均超過(guò)了22 000，且樣本的稀釋曲線與Shannon指數(shù)曲線均趨于平坦，充分說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，完全可以反映樣本中絕大多數(shù)微生物的多樣性信息。

圖2 各樣品細(xì)菌的稀釋曲線（A）和Shannon指數(shù)曲線（B）Fig.2 Rarefaction curves (A) and Shannon-Wiener curves (B) of bacterial samples

2.1.2α多樣性分析

α多樣性分析可揭示釀造環(huán)境中微生物群落的豐富度和多樣性。計(jì)算Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao指數(shù)和覆蓋率，以描述樣本中的細(xì)菌菌群多樣性[14]。

由表1可知，茅臺(tái)鎮(zhèn)主釀區(qū)1～7輪次釀造環(huán)境樣本在97%水平下共得到OTU數(shù)為1 054，其中第4輪次樣本中的OTU數(shù)最高為493；第7輪次為365，是全年樣本中OTU數(shù)最低的。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表明，4、5、6輪次釀造環(huán)境的細(xì)菌多樣性和豐富度明顯高于其他輪次，該結(jié)果表明這3 個(gè)輪次期間（5月、6月和7月）的環(huán)境氣候條件適宜于細(xì)菌生長(zhǎng)。各個(gè)樣本的覆蓋率都在99.40%以上，說(shuō)明各樣品文庫(kù)的覆蓋率足夠大，絕大部分的微生物種系類(lèi)型都被檢測(cè)到，測(cè)序結(jié)果充分體現(xiàn)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒主釀區(qū)釀造環(huán)境樣本細(xì)菌群落多樣性的真實(shí)情況。

表1 樣本細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Table 1 α-Diversity indices of bacterial community

2.2 細(xì)菌物種與群落結(jié)構(gòu)分析

基于Illumina MiSeq測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)2018年度1～7輪次釀造環(huán)境中細(xì)菌的16S rDNA基因V3-V4區(qū)序列進(jìn)行分析，研究茅臺(tái)鎮(zhèn)主釀區(qū)釀造環(huán)境中細(xì)菌物種和群落結(jié)構(gòu)，圖3為各輪次釀造環(huán)境樣本在門(mén)水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。

圖3 環(huán)境樣品細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)（門(mén)水平）Fig.3 Bacterial community structure in environmental samples at the phylum level

從1～7輪次環(huán)境中依次檢測(cè)出16、16、18、19、18、17 個(gè)和15 個(gè)細(xì)菌門(mén)，共19 個(gè)門(mén)。7 個(gè)輪次共有的細(xì)菌門(mén)為Acidobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Chlamydiae、Chloroflexi、Cyanobacteria、Deinococcus-Thermus、Firmicutes、Fusobacteria、Proteobacteria、Saccharibacteria、Verrucomicrobia、Gemmatimonadetes和Tenericutes，共14 個(gè)，占檢出總菌門(mén)的73.68%，充分說(shuō)明在門(mén)水平上各輪次間微生物菌群結(jié)構(gòu)具有明顯的穩(wěn)定性。這與譚旭[8]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)研究茅臺(tái)地區(qū)赤水河中細(xì)菌菌群多樣性得到的結(jié)果基本一致，其中Chlamydiae和Tenericutes未在赤水河水體中檢出。

由圖3可看出，各輪次的第1優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Proteobacteria（45.34%）、第2優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Firmicutes（25.52%）、第3優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Bacteroidetes（21.76%）、第4優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Actinobacteria（6.93%）。任愛(ài)容等[15]從茅臺(tái)鎮(zhèn)主釀區(qū)大曲樣本中檢測(cè)出21 個(gè)門(mén)，其中4 個(gè)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，分別是Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes；郭敏[16]對(duì)醬香大曲制曲微生態(tài)多樣性進(jìn)行了研究，從曲胚中共檢出細(xì)菌9 個(gè)門(mén)，其優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria。王歡等[17]從醬香白酒機(jī)械化釀造1～7輪次堆積發(fā)酵酒醅中檢出14 個(gè)細(xì)菌門(mén)類(lèi)，結(jié)果顯示，Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes為酒醅樣本中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。上述研究結(jié)果與本研究比較分析，發(fā)現(xiàn)茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境與醬香大曲、堆積發(fā)酵酒醅中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)顯著相關(guān)，說(shuō)明釀造環(huán)境微生物與釀造大曲、酒醅堆積發(fā)酵微生物菌群之間存在非常密切的聯(lián)系（可能存在明顯的微生物遷徙，本課題組正在開(kāi)展相關(guān)研究）。同樣，Wang Haiyan等[18]解析了濃香型和芝麻香型白酒釀造過(guò)程的微生物，發(fā)現(xiàn)Proteobacteria和Firmicutes為這兩種香型白酒釀造的主要微生物菌群。同時(shí)，這2 個(gè)門(mén)同樣是清香型[19]及醬香型[20]白酒發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，表明這2 個(gè)菌門(mén)種群不僅是釀造環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)微生物，也是中國(guó)白酒發(fā)酵過(guò)程中的重要微生物。

上述結(jié)果表明，茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造環(huán)境的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)在7 個(gè)輪次的相對(duì)含量及結(jié)構(gòu)多樣性特征相似性較高。Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria均是各釀造輪次釀造環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，表明茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒釀造環(huán)境中的主要細(xì)菌菌門(mén)在1～7 個(gè)輪次之間具有較好的相對(duì)穩(wěn)定性，這是茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境微生態(tài)結(jié)構(gòu)的釀造特征。

從1～7輪次釀造環(huán)境樣品中依次檢出203、154、187、202、186、219 個(gè)和165 個(gè)細(xì)菌屬，共檢測(cè)出396 個(gè)不同的細(xì)菌屬。釀造環(huán)境中相對(duì)豐度≥1.00%的細(xì)菌屬在1～7輪次的分布數(shù)量（比例）依次為22（79.34%）、20（75.76%）、24（81.35%）、23（80.05%）、21（71.74%）、24（76.92%）、16（83.43%），這些屬為各輪次釀造環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，也表征了各釀造輪次環(huán)境細(xì)菌結(jié)構(gòu)的特征。

由圖4可知，Sphingobacterium（12.30%）、Enterobacter（8.69%）、Pantoea（7.02%）、Acinetobacter（5.16%）、unclassified_f_Enterobacteriaceae（5.35%）、Pseudomonas（3.22%）、Escherichia-Shigella（1.85%）和Staphylococcus（1.96%）為7 個(gè)輪次釀造環(huán)境的共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。而Chryseobacterium（3.30%）、Flavobacterium（1.44%）、Oceanobacillus（4.40%）、Kroppenstedtia（3.01%）、Weissella（2.72%）、Bacillus（2.00%）是1～7輪次釀造環(huán)境中至少在5 個(gè)輪次中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。Sphingobacterium廣泛存在于沙漠、堆肥、各類(lèi)土壤、植物等自然界中，最適生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃，可分泌大量活性酶[21-22]。對(duì)比任愛(ài)容等[15]的研究可發(fā)現(xiàn)該菌屬在醬香大曲中的相對(duì)含量遠(yuǎn)小于釀造環(huán)境，這主要是因?yàn)橹魄^(guò)程中高溫大曲的培養(yǎng)溫度在60 ℃以上，遠(yuǎn)超其最適生長(zhǎng)溫度致使含量降低。張亞麗[9]利用羅氏454測(cè)序技術(shù)對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)空氣中不可培養(yǎng)微生物群落進(jìn)行分析，得出Staphylococcus為夏季空氣樣本的優(yōu)勢(shì)菌屬，Acinetobacter則為春季、秋季和冬季的優(yōu)勢(shì)菌屬的結(jié)論。任愛(ài)容等[23]對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)釀造環(huán)境及大曲中細(xì)菌進(jìn)行可培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)Pseudomonas只存在于釀造環(huán)境中，其在釀造環(huán)境和大曲中都分離到了Enterobacter，而且在釀造環(huán)境中的相對(duì)含量大于大曲；戴奕杰等[24]在大曲和糟醅中也檢測(cè)到了Enterobacter；郭敏[16]基于高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)醬香大曲中Oceanobacillus、Kroppenstedtia是其主要菌屬。由此可見(jiàn)，釀造環(huán)境中的微生物可能通過(guò)大曲制曲、貯存富集網(wǎng)絡(luò)、堆積發(fā)酵遷徙進(jìn)入到釀造過(guò)程，為白酒釀造提供微生物來(lái)源。Bacillus和Weissella是白酒發(fā)酵過(guò)程中的主要功能細(xì)菌菌群，在多種香型白酒發(fā)酵過(guò)程中均有報(bào)道[25-26]。其中作為大曲重要核心細(xì)菌屬的Bacillus為關(guān)鍵的產(chǎn)酸和產(chǎn)香菌，可代謝4-甲基吡嗪[27]、乙偶姻[28]等白酒關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。Weissella為高、中、低溫大曲和小曲中的主要細(xì)菌之一，可代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸類(lèi)，是發(fā)酵的啟動(dòng)劑[3]。王雪山[29]研究了清香型白酒發(fā)酵環(huán)境中微生物種群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)清香型白酒釀造環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬主要是Bacillus、Weissella等。由此可見(jiàn)，醬香型白酒與清香型白酒釀造環(huán)境優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬差異較大，這可能也是導(dǎo)致兩種不同香型白酒酒體風(fēng)格差異的重要原因。

圖4 環(huán)境樣品細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)（屬水平）Fig.4 Bacterial community structure in environmental samples at the genus level

通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)7 個(gè)輪次釀造環(huán)境的共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬總含量占比為45.55%，說(shuō)明各輪次釀造環(huán)境微生物物種在屬水平上具有相對(duì)穩(wěn)定性，同時(shí)也表明了釀造環(huán)境微生態(tài)的差異性更大。由表2可知，7 個(gè)輪次釀造環(huán)境中的特有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為1～5 個(gè)屬類(lèi)，1輪次釀造環(huán)境中的特有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬類(lèi)最多，為5 類(lèi)，分別是Serratia、Lactobacillus、Thermoactinomyces、Macrococcus、Planomicrobium，而4輪次僅有Corynebacterium；Corynebacterium可利用環(huán)境中的碳源發(fā)酵產(chǎn)生賴(lài)氨酸，而賴(lài)氨酸具有防臭保鮮的作用，可能對(duì)于改善酒質(zhì)以及酒的風(fēng)味能夠發(fā)揮一定的作用[30]。Serratia在茅臺(tái)鎮(zhèn)空氣中檢測(cè)到，且為秋季樣本的優(yōu)勢(shì)菌屬[9]。Lactobacillus、Thermoactinomyces是白酒釀造過(guò)程中重要的功能細(xì)菌種群[31]，其中，Lactobacillus可為白酒中風(fēng)味物質(zhì)提供合成前體[30]，而Thermoactinomyces是大曲[32]和酒醅[14]細(xì)菌微生物區(qū)系中的核心功能細(xì)菌微生物類(lèi)群。

表2 1～7輪次釀造環(huán)境樣本中特有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬Table 2 Unique dominant genera in environmental samples from rounds 1–7

上述結(jié)論表明，茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒各釀造輪次期間釀造環(huán)境中的細(xì)菌群落在屬水平上種類(lèi)非常豐富，是醬香白酒復(fù)雜風(fēng)味結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵所在。各輪次之間釀造環(huán)境微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性特征明顯，而且各輪次釀造環(huán)境的細(xì)菌屬結(jié)構(gòu)組成特征差異性大于共性，這也是不同釀造輪次的特征所在。

2.3 釀造環(huán)境細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異性特征

在醬香型白酒實(shí)際生產(chǎn)中7 個(gè)輪次釀酒產(chǎn)量、質(zhì)量及風(fēng)格差異較大，這不僅與1～7輪次的釀造工藝有關(guān)，與不同輪次釀造環(huán)境微生物結(jié)構(gòu)也緊密相關(guān)。解析1～7輪次的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異性，擬揭示茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒釀造過(guò)程各輪次釀造環(huán)境微生物的差異性及其特征，為此本研究利用PLS-DA（圖5）結(jié)合Adonis分析、PERMANOVA分析和ANOSIM分析（表3、4）解析茅臺(tái)鎮(zhèn)各釀造輪次環(huán)境樣本中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的差異性特征。

圖5 環(huán)境樣本細(xì)菌菌群差異性分析Fig.5 Analysis of the difference in the diversity of bacterial community in environmental samples

表3 Adonis和PERMANOVA分析結(jié)果Table 3 Results of Adonis and PERMANOVA

如圖5A所示，茅臺(tái)鎮(zhèn)2018年度醬香白酒7 個(gè)釀造輪次釀造環(huán)境樣本間距離等級(jí)的中位數(shù)相差較大，說(shuō)明各輪次細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)之間的差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且相互之間的差異性各有不同。結(jié)合表3中Adonis和PERMANOVA分析中的P值為0.045、0.007，R2分別為0.160 7、0.181 6，而表4中的ANOSIM分析（P=0.044，R=0.042 1）驗(yàn)證，本次差異性分析可信度高，說(shuō)明茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒各釀造輪次釀造環(huán)境中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)之間存在差異性，且組間細(xì)菌菌群差異大于組內(nèi)差異，成為茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒不同釀造輪次產(chǎn)酒、酒質(zhì)各異的釀造環(huán)境微生物原因。

從圖5B可明顯看出，7 個(gè)輪次釀造環(huán)境樣本細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組間差異性大，組內(nèi)相似度高，進(jìn)一步驗(yàn)證了前述聚類(lèi)分析的結(jié)果。1輪次釀造環(huán)境樣本與其余6 個(gè)輪次樣本的得分點(diǎn)完全分開(kāi)，說(shuō)明1輪次的細(xì)菌菌群與其他輪次之間具有較大差異性。原因可能是1輪次釀造時(shí)正處寒冬季節(jié),最適生長(zhǎng)溫度較低的細(xì)菌菌群能正常生長(zhǎng)繁殖，微生物多樣性上多為耐低溫型菌群結(jié)構(gòu)，由此菌群特征呈現(xiàn)種類(lèi)多，優(yōu)勢(shì)菌群多且相對(duì)豐度較平均的特征[8]，從而導(dǎo)致1輪次釀造環(huán)境中的細(xì)菌菌群種類(lèi)有別于其他輪次。通過(guò)分析還表明茅臺(tái)鎮(zhèn)1～7 個(gè)釀造輪次釀造環(huán)境中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。結(jié)合圖3、4和表2發(fā)現(xiàn)，各釀造輪次環(huán)境樣本在門(mén)水平上均無(wú)顯著性差異，但在屬水平上，1輪次釀造環(huán)境中特有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬較其他輪次多，這可能是1輪次與其余輪次細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異性明顯的原因之一，也是受1輪次季節(jié)溫度、濕度影響的結(jié)果。

PLS-DA度量變量對(duì)模型的重要性（variable importance in the projection，VIP）值[33]（圖5C），VIP值越大，說(shuō)明該菌屬越是關(guān)鍵的差異微生物。茅臺(tái)鎮(zhèn)1～7 個(gè)釀造輪次釀酒環(huán)境樣本中呈現(xiàn)顯著性差異（1.5＞VIP≥1.0）的細(xì)菌菌屬為Kroppenstedtia、Weissella、Cronobacter、Oceanobacillus、Bacillus、Stenotrophomonas等10 個(gè)屬。而VIP≥1.5的細(xì)菌菌屬有Lentibacillus、Enterobacter、unclassified_o_Bacillales、unclassified_f_Enterobacteriaceae、Escherichia-Shigella和Pantoea，表明這6 個(gè)屬在7 個(gè)輪次中具有極顯著差異性。上述差異性顯著的16 個(gè)屬在1輪次釀造環(huán)境中占了50.02%（10 個(gè)屬占18.98%，6 個(gè)屬占30.04%），均高于2～7輪次中任意輪次的相對(duì)含量占比，如在4輪次釀造環(huán)境中占比為42.45%。

綜上所述，茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒釀造過(guò)程各輪次釀造環(huán)境樣本之間細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)具有差異性，且組間差異大于組內(nèi)差異，1輪次與其他輪次的差異特征顯著性最大，其原因主要有：一是由釀造環(huán)境氣候條件引起；二是特有優(yōu)勢(shì)菌屬數(shù)量較其他輪次多；三為關(guān)鍵差異微生物在7 個(gè)輪次間的相對(duì)含量占比各異，且在1輪次釀造環(huán)境中占比最大。

3 結(jié) 論

對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒不同輪次的釀造環(huán)境中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及其特征進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并比較分析了各釀造輪次釀造環(huán)境間的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異性。從1～7 個(gè)生產(chǎn)輪次的釀造環(huán)境中共檢測(cè)出19 個(gè)細(xì)菌門(mén)，396 個(gè)細(xì)菌屬，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria；其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬主要有14 個(gè)，分別是Sphingobacterium、Enterobacter、Pantoea、Acinetobacter、unclassified_f_Enterobacteriaceae、Pseudomonas、Escherichia-Shigella、Staphylococcus、Chryseobacterium、Flavobacterium、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Weissella和Bacillus。同時(shí)，結(jié)合Adonis、PERMANOVA和ANOSIM分析結(jié)果表明，不同輪次間的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異性，且各輪次釀造環(huán)境間的差異大于輪次內(nèi)的差異。通過(guò)細(xì)菌屬的PLS-DA，結(jié)果表明茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒1～7 個(gè)生產(chǎn)輪次期間釀造環(huán)境間的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)在門(mén)水平上無(wú)顯著性差異，但在屬水平上，各輪次釀造環(huán)境中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)具有差異性，且1輪次的釀造環(huán)境中的細(xì)菌菌群與其他輪次之間存在顯著差異性。Kroppenstedtia、Weissella、Cronobacter、Oceanobacillus、Lentibacillus、Enterobacter、unclassified_o_Bacillales、Pantoea、unclassified_f_Enterobacteriaceae和Escherichia-Shigella等16 個(gè)細(xì)菌屬是導(dǎo)致釀造環(huán)境各輪次間差異的主要細(xì)菌種群。前述結(jié)論充分表征了茅臺(tái)鎮(zhèn)7 個(gè)生產(chǎn)輪次的釀造環(huán)境中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及其特征，為充分認(rèn)識(shí)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒釀造環(huán)境中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及釀造機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，為茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造季節(jié)調(diào)控、生產(chǎn)工藝調(diào)控提供了科學(xué)依據(jù)。