碳酸氫根傘在原發(fā)性膽汁性膽管炎發(fā)病機(jī)制中的作用

常英昊， 景 丹， 徐文姣， 周曉蕾， 王孝平， 湯善宏

西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 消化內(nèi)科， 成都 610083

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一種自身免疫性疾病，其主要病理特征為免疫系統(tǒng)特異性識別并殺傷肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，導(dǎo)致肝內(nèi)小膽管漸進(jìn)性消失，引起肝內(nèi)膽汁淤積，致使肝組織反復(fù)再生并導(dǎo)致纖維化與肝硬化。PBC的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，研究[1]顯示PBC中膽管上皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激等有害因素作用下易于發(fā)生凋亡，凋亡細(xì)胞所產(chǎn)生的自身抗原可被其他膽管上皮細(xì)胞攝取并呈遞給免疫系統(tǒng)，從而激活免疫應(yīng)答并對膽管造成免疫損傷。近年來有研究[2-3]提出膽管碳酸氫根(HCO3-)傘的概念，指出膽管上皮細(xì)胞分泌HCO3-并在細(xì)胞表面形成HCO3-薄膜，HCO3-薄膜可阻擋膽汁酸自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，保護(hù)膽管上皮細(xì)胞免受疏水性膽汁酸介導(dǎo)的氧化應(yīng)激與細(xì)胞損傷，從而減少凋亡細(xì)胞與自身抗原的產(chǎn)生。HCO3-傘被破壞可能是PBC發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，了解HCO3-傘的產(chǎn)生機(jī)制與影響因素有助于闡明PBC發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)治療靶點(diǎn)?，F(xiàn)將有關(guān)PBC中膽管HCO3-傘的研究進(jìn)展擇要介紹如下。

1 膽管上皮細(xì)胞分泌HCO3-的生理功能

膽管上皮細(xì)胞所分泌的HCO3-在膽汁酸代謝中具有重要作用，其生理功能包括：(1)維持膽汁流動(dòng)；(2)促進(jìn)膽汁成分的代謝；(3)使膽汁呈堿性以促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；(4)在膽管上皮細(xì)胞表面形成“HCO3-傘”[4-6]。其中形成HCO3-傘并保護(hù)膽管上皮細(xì)胞免受膽汁酸損傷的功能與PBC病理生理直接相關(guān)。膽汁酸在肝細(xì)胞中由膽固醇合成，通過膽汁酸鹽輸出泵跨過肝細(xì)胞頂端膜排入膽管后與磷脂、膽紅素等多種成分混合形成膽汁。膽管上皮細(xì)胞膜外的負(fù)電荷吸引膽汁酸鹽與質(zhì)子結(jié)合形成的膽汁酸，導(dǎo)致膽汁酸鹽通過自由擴(kuò)散穿越胞膜進(jìn)入細(xì)胞，使其發(fā)揮細(xì)胞毒性作用并通過氧化應(yīng)激等途徑造成細(xì)胞損傷。膽汁酸鹽通過與磷脂酰膽堿形成膠束[7-8]，可減少膽汁中具有細(xì)胞毒性的游離膽汁酸含量。盡管如此，膽管上皮細(xì)胞仍暴露在毫摩爾濃度的游離膽汁酸鹽中。為防止疏水性膽汁酸鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，膽管細(xì)胞具有針對膽汁酸鹽的保護(hù)機(jī)制。碳酸氫鹽薄膜(也稱為HCO3-傘)是膽管上皮細(xì)胞的重要保護(hù)機(jī)制，碳酸酐酶催化CO2水合生成HCO3-和H+是膽管上皮細(xì)胞分泌HCO3-的主要來源，之后HCO3-通過陰離子交換蛋白(anion exchanger protein，AE)2分泌到膽汁中，Na+/H+交換蛋白將H+轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，共同調(diào)節(jié)膽汁的pH值。糖萼是膽管上皮細(xì)胞頂端膜上的糖蛋白，可富集HCO3-并在頂端膜附近形成堿性微環(huán)境，從而形成HCO3-傘[9]。HCO3-與膽汁酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)使其脫去質(zhì)子形成膽汁酸鹽，從而防止膽汁酸通過自由擴(kuò)散進(jìn)入膽管上皮細(xì)胞并介導(dǎo)細(xì)胞損傷與凋亡[6]。

2 膽管上皮細(xì)胞中HCO3-分泌的相關(guān)機(jī)制

膽管上皮細(xì)胞中HCO3-的分泌受到多種因素共同調(diào)控[10]。在膽管上皮細(xì)胞中，促胰液素與乙酰膽堿分別作用于基底膜上的促胰液素受體(secretin receptor,SR)與M3毒蕈堿型受體(muscarinic type-3 receptor,M3R)激活HCO3-分泌的信號通路。促胰液素作用于SR，激活跨膜腺苷酸環(huán)化酶(tmAC)產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，cAMP活化囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)器(CFTR)并將Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，由AE2在轉(zhuǎn)運(yùn)Cl-進(jìn)入細(xì)胞的同時(shí)完成HCO3-的分泌[11]；并且CFTR活化后可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ATP通過旁分泌作用于頂端膜上的嘌呤受體P2Y，由P2Y激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道3型肌醇三磷酸受體(InsP3R3)并釋放Ca2+，Ca2+通過鈣激活氯通道TMEM16A將Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞從而促進(jìn)HCO3-的分泌[12]。在完成HCO3-分泌的同時(shí)，促胰液素還可誘導(dǎo)cAMP和微管依賴的囊泡在細(xì)胞內(nèi)遷移并將含有CFTR與AE2的囊泡定位到頂端膜，協(xié)助相關(guān)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與HCO3-的分泌[13]。乙酰膽堿作用于膽管上皮細(xì)胞基底膜外側(cè)的M3R，M3R與G蛋白偶聯(lián)并動(dòng)員磷酸肌醇生成肌醇三磷酸，肌醇三磷酸與1型和2型肌醇三磷酸受體結(jié)合并釋放內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+進(jìn)入胞漿，再通過TMEM16A增強(qiáng)促胰液素誘導(dǎo)的HCO3-分泌[9]。在上述信號通路中，Ca2+與SR等多種物質(zhì)均可活化腺苷酸環(huán)化酶并產(chǎn)生cAMP，但由于細(xì)胞內(nèi)磷酸二酯酶的存在以及cAMP具有選擇性和特異性，不同信號通路所產(chǎn)生的cAMP只能在很小的分布范圍中發(fā)揮各自的生物學(xué)效應(yīng)[14]，并不會(huì)出現(xiàn)相互干擾的情況。

PBC患者存在膽管上皮細(xì)胞pH升高的現(xiàn)象?？紤]到HCO3-是膽管上皮細(xì)胞調(diào)控膽汁酸堿性的主要物質(zhì)，pH升高可能與HCO3-分泌障礙有關(guān)。為了解PBC患者的HCO3-分泌情況，有研究[15]采用同位素示蹤法通過對注射H11CO3-的患者進(jìn)行正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像檢測，結(jié)果顯示在促胰液素刺激的條件下，PBC患者的HCO3-的分泌水平與健康人群相比明顯降低，PBC患者膽管上皮細(xì)胞向膽汁中分泌HCO3-的功能出現(xiàn)異常，當(dāng)PBC患者接受熊去氧膽酸(UDCA)治療后HCO3-的分泌水平較治療前有明顯提升。并且PBC患者中cAMP刺激膽管上皮細(xì)胞分泌的HCO3-水平降低，負(fù)責(zé)Cl-/ HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)的AE2活性也出現(xiàn)下降。因此膽管上皮細(xì)胞的HCO3-分泌功能障礙導(dǎo)致HCO3-在胞內(nèi)積累使得pH升高，進(jìn)一步導(dǎo)致HCO3-傘的破壞，引起膽汁酸介導(dǎo)的細(xì)胞損傷與凋亡[1]。

3 PBC中膽管上皮細(xì)胞分泌HCO3-的影響因素

為進(jìn)一步探究膽管上皮細(xì)胞HCO3-分泌障礙的原因，現(xiàn)有研究從HCO3-分泌機(jī)制著手，探索出多個(gè)可能影響膽管上皮細(xì)胞中HCO3-分泌的因素。

3.1 miR-506/AE2/sAC軸 AE2是膽管上皮細(xì)胞向膽汁中轉(zhuǎn)運(yùn)HCO3-的唯一通道，Brian等[16]發(fā)現(xiàn)AE2 mRNA在PBC患者肝臟中的表達(dá)水平明顯低于在其他原因的肝硬化與膽汁淤積患者肝臟中的水平。PBC患者肝臟中AE2 mRNA水平與其血清GGT水平呈負(fù)相關(guān)，而且在接受UDCA治療的PBC患者中，肝臟AE2 mRNA水平有所升高，介于未接受治療患者和健康人群之間[16]，提示AE2表達(dá)降低可能與膽汁淤積有關(guān)。此外，AE基因在PBC患者其他細(xì)胞中的表達(dá)也出現(xiàn)異常。PBC患者的AE2基因在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)水平比健康人群以及其他原因的膽汁淤積或肝硬化患者更低，同時(shí)外周血淋巴細(xì)胞中AE1的mRNA水平明顯升高，該現(xiàn)象可能是由于AE2表達(dá)下降使得AE1表達(dá)代償性增高所致[1]。由此可見PBC患者AE2表達(dá)下降是導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞HCO3-分泌下降的原因。

為探究AE2表達(dá)下降的原因，有研究[17-18]從PBC患者異常表達(dá)的miRNA中篩選出結(jié)合于mRNA的3′端非翻譯區(qū)并下調(diào)AE2表達(dá)的miR-506。miR-506表達(dá)水平在PBC患者的肝組織中升高，而在其他肝病患者的肝組織與正常肝組織中沒有升高，并且PBC患者膽管上皮細(xì)胞AE2活性降低的現(xiàn)象可以被抗miR-506的寡核苷酸逆轉(zhuǎn)。miR-506在人膽管細(xì)胞系中過度表達(dá)不僅降低AE2表達(dá)并減少HCO3-分泌水平，還使得細(xì)胞對膽汁酸鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更為敏感并出現(xiàn)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞單位過表達(dá)等PBC特征性改變[19]。雖然miR-506與AE2表達(dá)密切相關(guān)，但PBC患者膽管細(xì)胞、肝細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞都存在AE2表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，而上述細(xì)胞中miR-506上調(diào)的現(xiàn)象僅在膽管細(xì)胞中出現(xiàn)[18,20]。此外PBC患者膽管上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下仍存在miR-506上調(diào)的現(xiàn)象，提示miR-506上調(diào)可能與表觀遺傳有關(guān)。除了下調(diào)AE2表達(dá)之外，Meenakshisundaram等[20]發(fā)現(xiàn)miR-506也可作用于InsP3R3的mRNA 3′端非翻譯區(qū)并抑制其表達(dá)，從而下調(diào)HCO3-的分泌。

AE2表達(dá)下調(diào)將導(dǎo)致HCO3-在膽管上皮細(xì)胞內(nèi)積累，可溶性腺苷酸環(huán)化酶(sAC)[21]作為HCO3-感受器，能夠被HCO3-活化并使得細(xì)胞易于發(fā)生凋亡。H69膽管細(xì)胞中AE2的敲除使得sAC表達(dá)增加，并且抑制sAC使得AE2缺陷型H69膽管細(xì)胞對多種膽汁酸鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不再敏感[22]。前文提到tmAC可通過cAMP促進(jìn)HCO3-的分泌，雖然sAC與tmAC同屬腺苷酸環(huán)化酶家族[14]，但是二者存在諸多差異[23]：首先，sAC主要存在于胞漿、線粒體和細(xì)胞核中而tmAC主要在細(xì)胞膜上表達(dá)；其次，sAC的活化主要依賴HCO3-并由Ca2+進(jìn)行微調(diào)，而tmAC則受到激活G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞外信號調(diào)控；第三，sAC與tmAC存在互相拮抗的功能，sAC可促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程并具有削弱細(xì)胞屏障的作用，tmAC則具有抑制凋亡與增強(qiáng)細(xì)胞屏障功能的功能。膽管上皮細(xì)胞中存在sAC與tmAC相互拮抗的平衡狀態(tài)，而HCO3-的積累使sAC活性增加并通過細(xì)胞色素C和蛋白酶caspase 3相關(guān)的凋亡途徑參與膽汁酸鹽誘導(dǎo)的膽管上皮細(xì)胞凋亡。

由此可見，miR-506/AE2/sAC軸通過下調(diào)HCO3-分泌引起HCO3-在細(xì)胞內(nèi)積累與HCO3-傘的破壞，最終導(dǎo)致膽汁酸介導(dǎo)的膽管上皮細(xì)胞損傷與凋亡。Chang等[23]報(bào)道了miR-506/AE2/sAC軸作為PBC重要發(fā)病機(jī)制的假說：miR-506的基因位于X染色體上，膽管細(xì)胞中X染色體連鎖的表觀遺傳改變激活了miR-506表達(dá)，上調(diào)的miR-506從翻譯水平抑制AE2表達(dá)，減少HCO3-的分泌并導(dǎo)致HCO3-傘的破壞，同時(shí)在胞內(nèi)積累的HCO3-可上調(diào)sAC活性并促進(jìn)膽汁酸誘導(dǎo)的膽管上皮細(xì)胞凋亡；除引起自身抗原表達(dá)外，膽管上皮細(xì)胞凋亡意味著膽道屏障破壞，可使得膽汁酸直接作用于肝細(xì)胞并造成損傷，同時(shí)膽汁酸等有毒物質(zhì)導(dǎo)致的急性損傷遷延形成慢性炎癥，持續(xù)促進(jìn)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷與炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步上調(diào)miR-506表達(dá)，這種惡性循環(huán)最終導(dǎo)致膽管細(xì)胞衰老、膽管減少和肝硬化。而女性個(gè)體中由于兩個(gè)X染色體均被激活，導(dǎo)致相關(guān)基因的表達(dá)量明顯增高，造成發(fā)病率出現(xiàn)明顯的性別差異。該假說為PBC以女性患者為主以及膽管上皮細(xì)胞凋亡并產(chǎn)生自身抗體等現(xiàn)象提供了合理解釋，為揭示PBC發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。

3.2 脂多糖(LPS) 既往研究[24-25]通常認(rèn)為LPS在PBC中通過Toll樣受體4被膽管上皮細(xì)胞識別，激活核因子κB(NF-κB)等核轉(zhuǎn)錄因子并促進(jìn)IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α等炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而激活免疫細(xì)胞并導(dǎo)致炎癥。值得注意的是，人NF-κBp65的3′端非翻譯區(qū)含有miR-506的應(yīng)答序列，miR-506可下調(diào)NF-κBp65亞基的表達(dá)水平。在LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥模型中，miR-506過表達(dá)并發(fā)揮改善LPS所介導(dǎo)炎癥損傷的作用[26]。最新研究[27]發(fā)現(xiàn)，LPS在膽管細(xì)胞和膽管癌細(xì)胞中激活NF-κB可導(dǎo)致InsP3R3表達(dá)下降并影響Ca2+的釋放，進(jìn)而可能影響HCO3-分泌。作為PBC潛在的危險(xiǎn)因素，LPS引起的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致miR-506表達(dá)上調(diào)，從而參與下調(diào)HCO3-分泌及膽汁酸介導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡，LPS在PBC中的作用機(jī)制及其影響值得進(jìn)一步研究。

3.3 G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體(TGR)5 膽汁酸鹽通過與膽管上皮細(xì)胞中的多種配體結(jié)合，可發(fā)揮介導(dǎo)Cl-和HCO3-分泌以及促進(jìn)細(xì)胞增殖等生物學(xué)效應(yīng)。其中膽汁酸鹽通過與TGR5結(jié)合實(shí)現(xiàn)激活Cl-和HCO3-分泌的功能。膽汁酸鹽通過作用于TGR5激活G蛋白，進(jìn)一步活化腺苷酸環(huán)化酶，通過cAMP激活CFTR，啟動(dòng)Cl-和HCO3-的分泌過程。另外TGR5在膽管上皮細(xì)胞中還具有通過激活蛋白激酶A促進(jìn)抗凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及激活表皮生長因子受體促進(jìn)細(xì)胞增殖等效應(yīng)[3]。雖然TGR5參與了HCO3-的分泌過程，但尚未發(fā)現(xiàn)TGR5與PBC患者HCO3-分泌功能障礙和疾病進(jìn)展是否有關(guān)。

3.4 堿性磷酸酶 堿性磷酸酶除了作為膽汁淤積與預(yù)后的標(biāo)志物外，還通過介導(dǎo)ATP去磷酸化和調(diào)控嘌呤受體P2活性參與HCO3-的分泌過程。堿性磷酸酶的活性取決于膽管上皮細(xì)胞外pH，pH較高時(shí)催化ATP去磷酸化的活性也較高。由此可見，堿性磷酸酶介導(dǎo)ATP去磷酸化，抑制ATP通過旁分泌激活TMEM16A，從而下調(diào)HCO3-分泌并調(diào)控頂端膜外pH[9]。雖然堿性磷酸酶在HCO3-水平升高條件下對其分泌具有負(fù)性調(diào)控作用，但HCO3-分泌受阻時(shí)堿性磷酸酶的作用仍有待進(jìn)一步研究?？紤]到PBC患者廣泛存在膽汁淤積現(xiàn)象并且堿性磷酸酶的合成與釋放均增加，堿性磷酸酶對于PBC患者膽管上皮細(xì)胞HCO3-分泌的影響值得探究。

3.5 M3R抗體與Na+/H+交換蛋白 作為乙酰膽堿受體，M3R是乙酰膽堿介導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞分泌HCO3-信號通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。多數(shù)PBC患者體內(nèi)存在M3R抗體[28]，推測M3R抗體可能會(huì)影響乙酰膽堿介導(dǎo)的HCO3-分泌，但目前尚不清楚M3R抗體在PBC中的功能。另外，有研究[29]發(fā)現(xiàn)PBC患者膽管上皮細(xì)胞中Na+/H+交換蛋白活性相比健康人與其他肝病患者出現(xiàn)下降，提示調(diào)節(jié)細(xì)胞外HCO3-水平與pH的H+轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)異常，導(dǎo)致該現(xiàn)象出現(xiàn)的原因尚不清楚。目前關(guān)于M3R抗體與Na+/H+交換蛋白的研究較少，二者是否與PBC中HCO3-傘的破壞相關(guān)仍有待研究。

4 HCO3-傘與PBC治療

作為膽管上皮細(xì)胞的重要保護(hù)機(jī)制，維持HCO3-傘的穩(wěn)定并恢復(fù)其抵御膽汁酸損傷的功能對于PBC患者具有治療價(jià)值?，F(xiàn)有的PBC治療藥物除了調(diào)節(jié)膽汁酸代謝并降低游離膽汁酸水平外，還具有調(diào)節(jié)HCO3-分泌與修復(fù)HCO3-傘的作用。

4.1 熊去氧膽酸(UDCA) UDCA除了增加親水性膽汁酸水平、減小膽汁酸鹽的細(xì)胞毒性等作用外，也具有刺激膽管上皮細(xì)胞分泌HCO3-的作用。研究[9]顯示，UDCA可通過一氧化氮相關(guān)信號通路，激活蛋白激酶PKB與磷脂酰肌醇激酶PI3K，促進(jìn)CFTR依賴的ATP分泌過程，從而上調(diào)HCO3-的分泌水平并維持HCO3-傘穩(wěn)定。此外UDCA同系物去甲熊去氧膽酸也具有促進(jìn)HCO3-分泌的作用[30]。作為PBC的一線治療藥物，維持HCO3-傘穩(wěn)定是UDCA的重要作用之一。

4.2 皮質(zhì)醇類藥物 盡管皮質(zhì)醇類藥物已被證實(shí)對PBC缺乏良好的療效，但地塞米松與布地奈德可在膽管細(xì)胞中通過作用于糖皮質(zhì)激素受體，上調(diào)AE2的表達(dá)水平從而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)HCO3-分泌的功能[9]。雖然皮質(zhì)醇類藥物療效不佳，但也有助于維持膽道HCO3-傘的穩(wěn)定。

5 結(jié)語

綜上所述，HCO3-傘是膽管上皮細(xì)胞抵御膽汁酸損傷的重要保護(hù)機(jī)制。在miR-506/AE2/sAC軸等因素的作用下，HCO3-分泌障礙導(dǎo)致失去HCO3-傘保護(hù)的膽管上皮細(xì)胞受到膽汁酸損傷并發(fā)生凋亡的理論為PBC患者中自身抗體的產(chǎn)生提供了合理的解釋。由于HCO3-傘可保護(hù)膽管上皮細(xì)胞免受膽汁酸介導(dǎo)的損傷和凋亡進(jìn)而減少自身抗原的產(chǎn)生，維持HCO3-傘的穩(wěn)定對PBC患者而言可能具有重要的治療價(jià)值。HCO3-傘的破壞在PBC的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，當(dāng)從免疫學(xué)角度難以解釋PBC病理生理的全貌時(shí)，著眼于HCO3-分泌以及相關(guān)的膽汁酸代謝將有助于揭示PBC發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制。

利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：常英昊負(fù)責(zé)收集分析文獻(xiàn)與論文撰寫，同時(shí)參與擬定了寫作思路；景丹、徐文姣參與了收集分析文獻(xiàn)以及論文修改；周曉蕾、王孝平參與了收集分析文獻(xiàn)；湯善宏負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章與最后定稿。