液體活檢技術(shù)在腫瘤診斷領(lǐng)域的應(yīng)用

宋桂鋒，楊?，?/p>

（河北省張家口市萬全區(qū)中醫(yī)院普通內(nèi)科，河北 張家口 076250）

癌癥（cancer）一直是世界人民最關(guān)注的健康議題之一，其高發(fā)病率和高死亡率使得人們談癌色變。據(jù)最新的全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，人類癌癥發(fā)病率約為21.4%，死亡率約為17.7%，男性癌癥的發(fā)病率比女性高出20%，即1/5 的男性和1/6 的女性可能患癌，而1/8 的男性和1/10 的女性將死于癌癥[1]。癌癥已成為全球疾病死亡的主要原因，而基因突變是導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生和發(fā)展的重要因素，幾乎所有腫瘤都有DNA 突變，這些突變的存在使得腫瘤細(xì)胞不同于正常細(xì)胞，因此也成為腫瘤細(xì)胞檢測和追蹤的特異性生物標(biāo)志物?，F(xiàn)階段研究表明，腫瘤中DNA 突變位點(diǎn)和基因種類繁多，且不同腫瘤具有不同的特異性，這也為腫瘤的精確診療提供了可能性[2-4]。如何有效利用這些特異性的生物標(biāo)志物來進(jìn)行精確診療，這就對精準(zhǔn)檢測技術(shù)提出了更高的要求。

近年來，液體活檢技術(shù)在腫瘤診斷領(lǐng)域成為研究熱點(diǎn)，作為體外檢驗(yàn)的一個分支，它可以利用人血液、尿液、淋巴液、唾液、腦脊液、唾液、胸腔積液等多種液體樣本進(jìn)行疾病的分子鑒定與檢測。其僅需取少量體液，即可通過DNA 測序等手段獲得一張更完備的全身癌癥的分子圖譜，這對于精準(zhǔn)醫(yī)療來說是一項(xiàng)突破性的技術(shù)。相較于傳統(tǒng)的組織活檢，液體活檢技術(shù)具有連續(xù)監(jiān)測、多個腫瘤同時監(jiān)測、可重復(fù)性、非侵入性等優(yōu)勢，有助于指導(dǎo)腫瘤的早期診斷、疾病監(jiān)測、個性化治療、精準(zhǔn)靶向用藥、準(zhǔn)確預(yù)后、預(yù)測復(fù)發(fā)等[5-7]。研究認(rèn)為，使用體液中的生物標(biāo)記物進(jìn)行腫瘤分析將開始改變癌癥的診斷，液體活檢成為標(biāo)準(zhǔn)的臨床工具將具有相當(dāng)大的臨床意義[8]。體液中含有癌癥來源的成分，可作為研究對象，實(shí)現(xiàn)腫瘤的分子鑒定。基于此，本文就液體活檢技術(shù)在腫瘤診斷領(lǐng)域中的研究進(jìn)展作一綜述，進(jìn)一步闡明并歸納其在腫瘤早期診斷及預(yù)后判斷中的作用，并對該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢進(jìn)行展望，以期為相關(guān)科學(xué)研究和臨床診療提供思路。

1 液體活檢對象

1.1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）是指從腫瘤原發(fā)灶和（或）轉(zhuǎn)移灶脫落，游離在外周血液循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細(xì)胞。Récamier于1829 年首次報道了腫瘤細(xì)胞從腫瘤組織脫落的這一現(xiàn)象，而后有學(xué)者提出這些脫落的腫瘤細(xì)胞可以穿過正常組織，進(jìn)入到循環(huán)系統(tǒng)造成早期轉(zhuǎn)移[9]。隨著檢測技術(shù)的不斷提升，CTCs 的分離和檢測得以實(shí)現(xiàn)，并首次經(jīng)FDA 認(rèn)證應(yīng)用于臨床診斷[10]。CTCs作為完整的腫瘤細(xì)胞，攜帶了包括基因組和蛋白組等大量信息。對CTCs 分離進(jìn)行體外培養(yǎng)，可通過顯微鏡直接觀測其形態(tài)進(jìn)而判斷腫瘤的惡性表型，亦可構(gòu)建永久細(xì)胞株，進(jìn)行各種體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)、熒光原位雜交、單細(xì)胞基因組測序等，可鑒定CTC 表型，檢測基因突變位點(diǎn)。分離獲得的CTCs 還可用于藥物篩選、耐藥性篩查、為腫瘤患者的個性化治療提供依據(jù)等。此外，CTCs 的發(fā)現(xiàn)和分離進(jìn)一步加深了人們對腫瘤起源和轉(zhuǎn)移機(jī)制的認(rèn)識，腫瘤干細(xì)胞、失巢凋亡抵抗、免疫逃逸等領(lǐng)域也得以更深入的研究[11-14]。

1.2 循環(huán)腫瘤DNA 循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是指腫瘤細(xì)胞死亡或破裂后釋放出來的遺傳物質(zhì)，存在于腫瘤患者的循環(huán)系統(tǒng)中。ctDNA的發(fā)現(xiàn)得益于循環(huán)游離DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）的發(fā)現(xiàn)，cfDNA 是指來源于人體正常細(xì)胞的核酸物質(zhì)，游離于人外周循環(huán)系統(tǒng)中。ctDNA是cfDNA 的一部分，僅指來源于腫瘤細(xì)胞的cfDNA，研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤患者循環(huán)系統(tǒng)中往往存在較高水平的ctDNA，且越接近腫瘤組織區(qū)域的ctDNA表達(dá)水平越高，而高水平的ctDNA 常提示患者預(yù)后不良，這些現(xiàn)象表明ctDNA 的發(fā)現(xiàn)對腫瘤診療領(lǐng)域具有極其重大的意義[15]。在腫瘤形成早期，人外周循環(huán)系統(tǒng)中便可檢測到ctDNA 的存在，而CTCs 尚未開始發(fā)生，這也就意味著ctDNA 對于腫瘤的早期檢測和防治至關(guān)重要。ctDNA 作為生物標(biāo)志物，能隨腫瘤基因組的變化而改變，且具有更高的敏感性，動態(tài)變化的時效性，與腫瘤細(xì)胞基因組信息的一致性，這些特性使其被認(rèn)為可能是腫瘤基因組的潛在替代物。因此利用ctDNA 監(jiān)測腫瘤細(xì)胞基因組的實(shí)時變化，在腫瘤診療中具有極大地潛力。

1.3 細(xì)胞外囊泡 細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是指由細(xì)胞釋放的多種具有膜結(jié)構(gòu)囊泡的統(tǒng)稱。根據(jù)其直徑不同，可分為外泌體（直徑30～150 nm）、微粒（直徑100～1000 nm）、凋亡小體（直徑50～5000 nm）和癌小體（直徑為1～10 μm），其中目前研究熱點(diǎn)為外泌體。起初，外泌體被歸類于“細(xì)胞垃圾”（cellular waste），科學(xué)家們認(rèn)為這些囊泡物質(zhì)并沒有特定的作用。直到近年來研究發(fā)現(xiàn)，外泌體攜帶有大量的生物學(xué)信息，包含多種基因型（如mRNAs、microRNAs、LncRNAs、circRNAs）和蛋白因子等，這些信息類物質(zhì)主要來源于母細(xì)胞，并可以調(diào)節(jié)下游細(xì)胞的生物學(xué)功能，激活特定的信號通路，參與免疫應(yīng)答，腫瘤演進(jìn)等[16，17]。隨著外泌體分離和純化技術(shù)的提高，外泌體的提取變得越發(fā)簡便，純度也有明顯的提高，其所含有的大量生物學(xué)信息也逐漸被挖掘出來，對很多人類基礎(chǔ)疾病和癌癥中的重要作用也逐漸顯現(xiàn)[18]。但是要將EVs 的相關(guān)研究成果應(yīng)用于臨床仍需解決一些技術(shù)難題，分離和鑒定EVs 的各個亞群需要更廣泛和普適性的技術(shù)革新，因此目前EVs 的價值主要還停留于實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)研發(fā)階段。

2 液體活檢在腫瘤中應(yīng)用

隨著癌癥監(jiān)測和管理策略的不斷發(fā)展，對癌癥早期診斷、預(yù)后治療和耐藥性預(yù)測等的相關(guān)需求也日益增加。然而，盡管目前現(xiàn)有的分子藥物可用于靶向特定的基因組或蛋白組，但腫瘤的異質(zhì)性仍然是個體基因組分析和診療方案中最大的障礙。針對這一現(xiàn)象，以CTCs 和ctDNA 構(gòu)成的液體活檢診斷的核心，為癌癥治療和監(jiān)管的新途徑鋪平了道路。液體活檢提供了一種無創(chuàng)的樣本收集途徑，在原發(fā)性腫瘤難以活檢的情況下，液體活檢可以作為有效的替代選擇，也可以作為實(shí)體腫瘤組織的補(bǔ)充活檢，其具有檢測疾病分子表征的優(yōu)勢，這對精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和以患者為導(dǎo)向的治療至關(guān)重要。

2.1 CTCs 為追溯黑色素瘤的起源，有研究采用從黑色素瘤患者體液中分離活CTCs 的方式進(jìn)行定量和定性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離細(xì)胞的免疫表型揭示了個體間的異質(zhì)性與臨床結(jié)果相吻合[19]。CTCs 可用于判斷腫瘤患者預(yù)后及復(fù)發(fā)情況，評估腫瘤動力學(xué)，做到有效監(jiān)測指導(dǎo)臨床治療。有明確的證據(jù)表明，CTCs 在早期乳腺癌中具有評估患者預(yù)后作用，但在日常實(shí)踐中仍缺乏臨床實(shí)用性，其局限性在于研究者需要根據(jù)上皮表面標(biāo)志物的表達(dá)來評估CTCs的存在[20]。此外，CTCs 還被用于檢測肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等腫瘤的生物標(biāo)志物[21-24]。現(xiàn)今，CTCs在對某些晚期癌癥的化療療效和預(yù)后預(yù)測中也同樣發(fā)揮著重要作用。在非小細(xì)胞肺癌化療晚期，CTCs的陽性表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，可作為敏感的化療療效監(jiān)測及考核指標(biāo)[25]。在乳腺癌中，CTCs 能夠較早發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移，較好的輔助化療療效的評估。在不同分期的結(jié)腸癌中，CTCs 的表達(dá)與結(jié)腸癌的惡性程度存在相關(guān)性，臨床分期越高，CTCs陽性率越高，患者生存時間越短，其可作為判斷患者預(yù)后的指標(biāo)[26]。

2.2 ctDNA 在腫瘤早期診斷中，液體活檢可以幫助對患者進(jìn)行分類，并將篩查方式集中于高風(fēng)險人群，從而減少副作用。在全身性治療期間，利用CTCs 和ctDNA 分析其對靶向療法的反應(yīng)可能會有效增加臨床實(shí)踐的準(zhǔn)確性。此外，ctDNA 和CTCs 中的基因組還可有效的標(biāo)記相應(yīng)的耐藥性突變基因。McEwen AE 等[27]通過提取中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者腦脊液和外周循環(huán)血液中的ctDNA 進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦脊液中的ctDNA 明顯富集，且腦脊液中ctDNA 的突變與顱內(nèi)過程最相一致。Moon SM 等[28]檢測了肺癌患者血液中CTCs 和ctDNA 常規(guī)腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)情況，以此評估兩者對腫瘤監(jiān)控的敏感性，結(jié)果顯示，無論腫瘤分期或組織病理學(xué)類型如何，CTCs/ctDNA組合的敏感性明顯高于單獨(dú)使用CTC 或ctDNA，這表示聯(lián)合檢測的策略可能在臨床上更有用，可以增強(qiáng)肺癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷。ctDNA 在胃癌的早期診斷當(dāng)中也有著非常明顯的指向性作用，其對于診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性提升有顯著的意義。另有研究指出[29]，在非小細(xì)胞肺癌中，ctDNA 在預(yù)測耐藥方面較臨床指標(biāo)更加超前，是一項(xiàng)靈敏的檢測指標(biāo)。同時，ctDNA 還可用于EGFR 基因突變檢測及EGFR 耐藥突變監(jiān)測?？傊?，ctDNA 的定量檢測為臨床決策提供了便利和準(zhǔn)確性，對肺癌、卵巢癌、食管鱗癌等多種腫瘤具有指導(dǎo)性意義[30-32]。

2.3 EVs 研究指出[33]，外泌體具有無創(chuàng)性腫瘤生物標(biāo)志物的潛力，特異性檢測癌細(xì)胞來源的外泌體十分關(guān)鍵。外泌體中含有多種內(nèi)源性貨物，部分內(nèi)容物相當(dāng)于其親代細(xì)胞并反映親代細(xì)胞的病理生理狀態(tài)，可檢測出與腫瘤相關(guān)的多種生物分子，這使其可能成為腫瘤早期診斷的特異性標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)[34]，胃癌患者外泌體的表達(dá)水平高于健康人群，外泌體的濃度有可能會成為胃癌的診斷指標(biāo)。多項(xiàng)研究證明[35-38]，外泌體中包含的遺傳物質(zhì)：mRNA、microRNA、LncRNA、circRNA 才是腫瘤特異性生物標(biāo)志物的關(guān)鍵因素。目前EVs 的分離和檢測已取得重大進(jìn)展，但于單個平臺上解決EVs 亞群的分離和純化才有可能促進(jìn)EVs 技術(shù)的臨床應(yīng)用。與此同時，通過對腫瘤EVs 進(jìn)行廣泛分析來獲取更多的臨床驗(yàn)證，也是EVs 得以量化其臨床潛力和在疾病進(jìn)展中作用的必要條件。EVs 作為龐大生物學(xué)信息轉(zhuǎn)運(yùn)的載體，在前期實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究中已展現(xiàn)出其在臨床腫瘤診斷和治療中的無限潛能。Melo SA 等[39]指出，胰腺癌患者的血清外泌體中存在過表達(dá)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（glypican 1，GPC1），證明了外泌體蛋白作為胰腺癌早期診斷的可行性。外泌體攜帶的核酸信息物質(zhì)在肝細(xì)胞癌、前列腺癌、胰腺導(dǎo)管癌、膀胱癌的早期臨床診斷中也起著決定性的作用[40-43]。雖然外泌體攜帶的mRNA 相對較少，但也有報道指出，外周循環(huán)血中的程序性死亡受體-配體1（programmedcell death-ligand 1，PD-L1）mRNAs 的表達(dá)與黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌的抗PD-1 抗體治療反應(yīng)密切相關(guān)，這使外泌體mRNAs 成為腫瘤免疫治療的分子標(biāo)志物，可能用于指導(dǎo)腫瘤化療合理用藥[44]。

3 總結(jié)

不同液體活檢生物標(biāo)志物均具有其優(yōu)點(diǎn)和局限性。由于CTCs 和ctDNA 的檢測原理、方法、技術(shù)和后續(xù)分析均存在較大差異，要解決這些問題，使液體活檢更好的應(yīng)用于臨床工作，就必須將生物標(biāo)志物檢測的特異性作為研究重點(diǎn)。其目的并非將一種生物標(biāo)志物作為液體活檢的單一檢測對象，而是在于使用多種循環(huán)腫瘤標(biāo)志物的協(xié)同作用，組成標(biāo)志物的特定組合，來揭示癌癥的特異性，確定癌癥的狀態(tài)、起源和進(jìn)展。但由于生物標(biāo)志物的異質(zhì)性和變異性，該判斷尚無定論。

液體活檢最終可替代標(biāo)準(zhǔn)組織活檢的程度尚不清楚。對于診斷原發(fā)腫瘤或確定難以提取樣品的組織中轉(zhuǎn)移灶的分期，液體活檢可能可提供可靠的選擇。液體活檢還可以幫助避免在侵入性組織活檢后發(fā)生并發(fā)癥，如出血、感染和疼痛等。多年來，研究人員已經(jīng)明確液體活檢的臨床潛力。隨著分離檢測技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化與新型標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，液體活檢將在腫瘤診斷、治療和預(yù)后評估方面擁有廣闊的應(yīng)用前景。為了將其廣泛使用，目前需要進(jìn)行更多的介入性臨床試驗(yàn)，并開發(fā)出一種將適合的循環(huán)腫瘤標(biāo)志物與疾病發(fā)展和轉(zhuǎn)歸組合在一起的算法。未來，相信這些檢測技術(shù)能真正意義上實(shí)現(xiàn)快速、可靠的檢測效果，最終解決更多的臨床問題。