外源性生物素對基于生物素-鏈霉親和素化學發(fā)光技術(shù)干擾的研究進展

劉 棟，仝 慧，陳 斌，張 寧，胡 健，王曉琴

（1.銅川市人民醫(yī)院檢驗科,陜西銅川 727000；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院檢驗科,西安 710061）

生物素-親和素系統(tǒng)（biotin-avidin system，BAS）是利用1 分子親和素可以結(jié)合4 分子生物素的特性而建立的一種放大標記技術(shù)。鏈霉親合素(streptavidin)是與親合素有類似生物學特性的一種蛋白質(zhì)，由于其與固相材料的非特異性結(jié)合遠少于親合素，因此在實際應(yīng)用中多采用生物素-鏈霉親合素系統(tǒng)[1]?；贐AS 的化學發(fā)光技術(shù)（chemiluminescence immunoassay，CLIA）結(jié)合了抗原抗體反應(yīng)的特異度、化學發(fā)光反應(yīng)的靈敏度以及BAS 的級聯(lián)放大作用，具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性，且檢測線性范圍更寬，被廣泛用于腫瘤標志物、感染性標志物、心肌損傷標志物、各種傳染病、激素、藥物和核酸的檢測。目前大約85% 常見的化學發(fā)光分析儀器配備了基于BAS 的檢測方法[2],如羅氏、西門子、雅培、貝克曼、奧森多、希森美康等品牌的多個檢測平臺[3]。隨著生物素的廣泛應(yīng)用，外源性生物素對基于BAS化學發(fā)光的干擾逐漸引起大家的重視，多個國家和組織[4-7]先后對此發(fā)布警示。有多種因素可對干擾產(chǎn)生不同的影響，及時準確的識別干擾并采取恰當?shù)拇胧┯兄跍p少臨床誤診和漏診。本文對這些影響因素進行綜述，為臨床實驗室人員提供借鑒。

1 外源性生物素的來源

生物素（biotin，B）即維生素B7，又稱維生素H，輔酶R，是B 族維生素中一種含硫水溶性維生素。生物素以羧化酶的輔酶形式微量存在于一切活細胞中，參與糖類、脂類和蛋白質(zhì)的代謝。外源性生物素是人體攝入生物素后存在于血液中的游離生物素及其代謝產(chǎn)物。美國人群生物素的日常攝入量為35～70 μg/d[8]，而中國人群推薦的適宜攝入量為5～50 mg/d[9]。人群的生物素攝入量在近30年大幅度提升，這是由于生物素被廣泛應(yīng)用于美容、美發(fā)、美甲、控制體重、孕期營養(yǎng)等保健領(lǐng)域[10]和遺傳性疾病、生物素缺乏癥、多發(fā)性硬化、甲狀腺功能亢進、2 型糖尿病、維生素D 中毒等的臨床治療[11]。從1986年至2000年，美國人群服用含有生物素補充劑的比例從17%上升至33%，劑量通常在100 μg/d 左右，最高可達10 000 μg/d[12]。

2 外源性生物素對基于BAS 化學發(fā)光的干擾機制

基于BAS 的化學發(fā)光通過可被測量的光信號對待測物質(zhì)進行測定?？杀粶y量的光信號由生物素標記物-待測物質(zhì)-發(fā)光物質(zhì)標記物-鏈霉親和素磁微粒復(fù)合物產(chǎn)生，該復(fù)合物的多少與光信號成正比。外源性生物素對基于BAS 的化學發(fā)光干擾的機制是由于外源性生物素和試劑來源的生物素會競爭性的與鏈霉親和素磁微粒(streptavidin-coated microparticles,M)結(jié)合[13]，當外源性生物素達到一定量時，反應(yīng)體系中的生物素總量超過了鏈霉親和素磁微粒的結(jié)合能力，導(dǎo)致發(fā)光物質(zhì)被捕獲減少[14]，光信號減弱，從而引起干擾。

3 生物素干擾的影響因素

外源性生物素對基于BAS 化學發(fā)光的干擾與多種因素相關(guān)，如反應(yīng)模式[15]、檢測項目[16]、檢測平臺[3]、反應(yīng)體系中的相關(guān)要素（包括外源性生物素的量、試劑來源的生物素的量、鏈霉親和素磁微粒的量）[14]等。這些因素任何一種發(fā)生改變都將對檢測結(jié)果產(chǎn)生不同影響。

3.1 外源性生物素干擾與反應(yīng)模式的關(guān)系 基于BAS 化學發(fā)光的反應(yīng)模式主要有夾心法和競爭法兩種，外源性生物素干擾可導(dǎo)致夾心法模式結(jié)果假性降低而競爭法模式假性升高[15]。這是由于待測物水平在夾心法模式下與光信號水平呈正相關(guān)，而在競爭法模式呈負相關(guān)。目前外源性生物素干擾最為常見，也最容易導(dǎo)致嚴重不良后果的情況有兩種：一是在甲狀腺功能檢查組合中，外源性生物素干擾會導(dǎo)致采用夾心法模式的促甲狀腺素（hyroid stimulating hormone，TSH）假性降低，而采用競爭法模式的三碘甲狀原氨酸(triiodothyronine，T3）、甲狀腺素(thyroxine，T4)、游離三碘甲狀原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3）、游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)假性升高，從而完美模擬了Graves病的實驗室表現(xiàn)。從1996年至2016年已有多例患者由于服用生物素后檢測甲狀腺功能而被誤診為Graves 病[17]。二是肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）采用夾心法模式檢測，外源性生物素干擾可導(dǎo)致檢測結(jié)果嚴重偏低，致使急性心肌梗死患者被誤認為陰性而被漏診[18]。

3.2 外源性生物素干擾與反應(yīng)體系中相關(guān)要素的關(guān)系 反應(yīng)體系中的相關(guān)要素包括：外源性生物素的量，試劑來源的生物素的量和鏈霉親和素磁微粒的量。當這些要素不同時，干擾的程度不同。

3.2.1 外源性生物素的量與干擾的關(guān)系：外源性生物素達到一定閾值后可使光信號假性降低，光信號的降低程度與外源性生物素的濃度呈正相關(guān)，TRAMBAS 等稱之為“生物素干擾的劑量依賴性”[19]。他們在羅氏檢測平臺上觀察了包括甲狀腺功能、性激素、心肌標志物、貧血、腫瘤標志物等32 個項目（夾心法模式19 個，競爭法模式13 個）在0～1 000ng/ml 生物素添加后的結(jié)果變化曲線，發(fā)現(xiàn)均存在劑量依賴性。LI[13]在31 個項目中也有相同的發(fā)現(xiàn)（夾心法模式23 個，競爭法模式8 個）。反應(yīng)體系中外源性生物素的量還與樣本加樣量有關(guān)，通過保持試劑組分及其他所有要素不變，僅改變樣本加樣量的實驗顯示[14]，100 ng/ml 的生物素添加樣本在人絨毛膜促性腺激素β 亞基（human chorionic gonadotropin β subunit，β-HCG）測量程序（夾心法模式）中，樣本加樣量為10，15，20 和50μl 時，隨著樣本加樣量的增加，光信號等比例下降；在孕酮（progesterone，Prog）測量程序（競爭法模式）中，樣本加樣量為15，20 和30μl 時也有相同的表現(xiàn)。由此可見，外源性生物素的濃度越高，樣本加樣量越大，干擾程度越大。

3.2.2 試劑來源的生物素的量與干擾的關(guān)系：劉棟[14]的實驗顯示，混合試劑，均加入10 μl 100ng/ml的生物素樣本，夾心法模式在試劑加樣量為70，80，110 和140μl 時，光信號的下降幅度分別為89.36%，86.42%，82.01%和77.42%；競爭法模式在試劑加樣量為70 和140μl 時，光信號下降幅度分別為61.38%和41.51%。這說明反應(yīng)體系中試劑來源的生物素具有抗外源性生物素干擾的作用，試劑加樣量越大，抗外源性生物素干擾的能力越強。反應(yīng)體系中試劑來源的生物素的量還與生物素試劑的濃度有關(guān)，因此有理由相信，試劑來源的生物素濃度越高，其抗外源性生物素干擾能力也會越強，這提示可能通過增加試劑中的生物素成分以增加抗外源性生物素的干擾。

3.2.3 鏈霉親和素磁微粒的量與干擾的關(guān)系：研究顯示[14]，在混合試劑模式下，夾心法模式β-HCG測量程序時，鏈霉親和素磁微粒濃度為0.036 mg/ml時可抵抗不足5 ng/ml的外源性生物素干擾（-50.28%的光信號變化），而濃度為7.2 mg/ml 時可抵抗400 ng/ml 的外源性生物素干擾（-10.44%的光信號變化）；競爭法模式Prog 測量程序時，鏈霉親和素磁微粒濃度為0.036 mg/ml 時可抵抗略小于5 ng/ml 的外源性生物素干擾（-14.35%的光信號變化），而濃度為7.2 mg/ml 時可抵抗約1 000 ng/ml 的外源性生物素干擾（-13.52%的光信號變化）。反應(yīng)體系中鏈霉親和素磁微粒的量還與其加樣量有關(guān)，因此也可以推斷，鏈霉親和素磁微粒的加樣量越大，抗生物素干擾能力也會越強。這提示也可能通過增加鏈霉親和素磁微粒的濃度以提升抗外源性生物素干擾的能力。

3.3 外源性生物素干擾與不同待測項目的關(guān)系 不同項目之間抗生物素干擾的能力不同。PIKETTY等[16]報告了三種檢測平臺不同項目的干擾閾值：羅氏平臺(Cobas，Elecsys，Modular)出現(xiàn)生物素干擾的濃度閾值分別為：TT3 41 nmol/L，TT4 409 nmol/L，F(xiàn)T3 286nmol/L，F(xiàn)T4 82 nmol/L，TSH 102 nmol/L，甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody，TgAb） 327 nmol/L，促甲狀腺素受體抗體(thyrotropin receptor antibody，TRAb）41 nmol/L，雌二醇(estradiol，E2）147 nmol/L，卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)246 nmol/L，黃體生成素(luteinizing hormone，LH)105 nmol/L，泌乳素（prolactin，PRL）164 nmol/L，睪酮（testosterone，TESTO）123 nmol/L，C 肽（C-Peptide，CPS） 246 mnol/L，胰島素（insulin，Ins）246 nmol/L，甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）205 nmol/L，性激素結(jié)合蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）246 nmol/L，維生素D（vitamin D，VD）286 nmol/L，促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone,ACTH）246 nmol/L，生長激素（human growth hormone,HGH）123 nmol/L。奧森多平臺(Vitros)出現(xiàn)干擾的生物素濃度低值分別是：TSH 20.5 nmol/L，E2 20.5 nmol/L，F(xiàn)SH 4.1 nmol/L，LH 20.5 nmol/L，PRL 4.1 nmol/L，TESTO 4.1 nmol/L，PTH 20.5 nmol/L，VD 6.1 nmol/L。西門子平臺(Dimension Vista，Exl)出現(xiàn)干擾的生物素濃度低值分別為：FT4 150 nmol/L，E2 150 nmol/L。相同劑量的生物素在不同項目間干擾程度也不相同。TRAMBAS[19]和評價了添加相同劑量的生物素（0 ～ 1 000ng/ml）后在羅氏平臺上的32 個項目，發(fā)現(xiàn)其受干擾反應(yīng)曲線各不相同，HASLAMS 等[3]也有相似的觀察結(jié)果。也有研究發(fā)現(xiàn)，即使是低濃度生物素(1.5 ng/ml)也會對PRL檢測結(jié)果產(chǎn)生顯著影響[20]。根據(jù)前文所述，這主要是由于不同項目之間，其反應(yīng)模式不同，反應(yīng)體系中各要素的比例關(guān)系不同所致。了解每個項目的反應(yīng)模式和反應(yīng)體系中各要素的信息，對于準確判斷和評估干擾有重要價值。

3.4 外源性生物素干擾與待測物水平的關(guān)系 外源性生物素干擾與待測物水平無關(guān)。LI 等[13]觀察了HCG，β-HCG，TSH，cTnT，N-末端B 型鈉尿肽前體(N-terminal pro B-type natriuretic peptide，NT-Pro-BNP）、總前列腺特異性抗原(total prostate specific antigen，TPSA)、游離前列腺特異性抗原(free prostate specific antigen，F(xiàn)PSA)等7 個項目各兩個濃度水平，分別添加了31.25～1 000ng/ml 的生物素后，發(fā)現(xiàn)在同一個項目中,相同劑量的生物素對不同待測物水平所導(dǎo)致的干擾程度相同。結(jié)合3.2 所述內(nèi)容，提示干擾程度由反應(yīng)體系中樣本來源和試劑來源的生物素的量與鏈霉親和素磁微粒的量之間的比例關(guān)系決定，而待測物水平與這一比例關(guān)系無關(guān)。

3.5 外源性生物素干擾與檢測平臺的關(guān)系 不同的檢測平臺中，對生物素干擾的敏感度不同，受干擾項目的種類和閾值也不相同。PIKETTY 等[16]和LUONG 等[21]分別報道了目前全球范圍內(nèi)的7 個檢測平臺的抗生物素干擾能力，發(fā)現(xiàn)羅氏檢測平臺的所有項目均易受到樣本來源的生物素干擾，而西門子和索靈平臺抗生物素干擾的能力最強。HASLAM[3]在分別添加30，60 和500 ng/ml 的生物素后，羅氏平臺不受影響的項目比例分別為100%，91%和23%，貝克曼不受影響的項目比例分別為91%，91%和86%，西門子不受影響的項目比例分別為100%，96%和91%。這種情況說明，不同的檢測平臺設(shè)計，反應(yīng)程序設(shè)計和試劑組分設(shè)計，也有助于改善抗生物素干擾的能力。事實上，西門子公司在Centaur 平臺中已經(jīng)通過進行生物素試劑-鏈霉親和素磁微粒的預(yù)制以消除生物素的干擾。已知采用預(yù)制模式的項目有FT4,PTH,丙型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體、梅毒螺旋體抗體、乙型肝炎病毒核心抗體、乙型肝炎病毒e 抗原、乙型肝炎病毒e 抗體、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體等項目。羅氏公司于2019年開發(fā)出了一種生物素抗體，能特異性結(jié)合游離生物素，而對標記于抗體表面的生物素不結(jié)合，可作為抗干擾組分添加至反應(yīng)體系中，以減少生物素干擾[22]，采用該技術(shù)的TRAb 將于2020年11月～2021年1月進入市場。

4 展望

基于BAS 化學發(fā)光的檢測項目都存在外源性生物素干擾的風險。在實際應(yīng)用過程中，難點在于準確、快速地評估是否存在干擾以及干擾的程度，并選擇恰當?shù)姆椒ㄟM行預(yù)防和驗證。外源性生物素對基于BAS 化學發(fā)光的干擾受多種因素影響，了解這些因素有助于快速準確判斷有無干擾及干擾的程度，選擇合適的應(yīng)對措施，為臨床提供科學解釋，減少誤診和漏診。同時，針對這些影響因素也可能建立更好的抗生物素干擾的方法。