利用光電比色法測定牛精液中精子密度的方法

李明 馮軍 郝濤波

（1，扎蘭屯職業(yè)學(xué)院 162650；2，內(nèi)蒙古呼倫貝爾市阿榮旗畜牧工作站 162750；3，內(nèi)蒙古呼倫貝爾市阿榮旗那吉鎮(zhèn)綜合行政執(zhí)法局 162750）

目前，人工授精技術(shù)被廣泛應(yīng)用于牛、羊、豬、禽及特種動(dòng)物繁育中，已顯示出其巨大的、無可比擬的優(yōu)越性，并已成為其他家畜繁殖技術(shù)的配套技術(shù)。牛冷凍精液的半永久性保存、世界范圍內(nèi)的精液貿(mào)易和冷凍精液配種技術(shù)的普及，使世界優(yōu)秀種公牛優(yōu)質(zhì)精液的利用突破了受母牛配種時(shí)間、國界、種牛壽命的限制。支撐家畜人工授精這項(xiàng)技術(shù)背后的是一系列跨學(xué)科、跨專業(yè)關(guān)鍵設(shè)備和技術(shù)的推廣和應(yīng)用。精液中精子密度檢查方法的發(fā)展及演變就是一個(gè)很好的例證。

精液中精子密度檢查方法主要有估測法、血細(xì)胞計(jì)數(shù)法和光電比色法。

1 估測法和血細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢查精子密度的方法及弊端

1.1 估測法

估測法是在顯微鏡下檢查精子活力的同時(shí)，依據(jù)視野中精子間的距離，將精子密度粗略劃分為“濃密”“中等”“稀薄”“無”4 個(gè)等級(jí)。這種方法受人為因素影響大，分級(jí)粗略，不能準(zhǔn)確量化與評(píng)價(jià)精子密度。

1.2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)法

血細(xì)胞計(jì)數(shù)法是借用醫(yī)學(xué)上檢查人體血液中紅細(xì)胞數(shù)和白細(xì)胞數(shù)的方法進(jìn)行精子密度檢查。只是把人的血液換成了動(dòng)物精液，把檢查對(duì)象由血細(xì)胞變成精細(xì)胞。動(dòng)物種類不同，精子密度也有較大差異。密度較高的動(dòng)物精液中精子數(shù)相當(dāng)于人體血液中的紅細(xì)胞數(shù)，密度較低動(dòng)物精液中的精子數(shù)相當(dāng)于人體血液中的白細(xì)胞數(shù)。因此，檢查密度高的動(dòng)物的精子密度類似于檢查血液中的紅細(xì)胞數(shù)；檢查密度低的動(dòng)物的精子密度類似于檢查人體血液中的白細(xì)胞數(shù)。

用血細(xì)胞數(shù)法檢查精子密度需要了解計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)室的結(jié)構(gòu)與規(guī)格，用3%鹽水在專用稀釋管中進(jìn)行稀釋、滴入計(jì)數(shù)室、顯微鏡下計(jì)數(shù)及原精液精子密度的換算。從上述描述中不難看出，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢查精子密度，其結(jié)果較為準(zhǔn)確，但方法原始、操作煩瑣、勞動(dòng)強(qiáng)度大。

2 光電比色法檢查精子密度的原理

光電比色儀的研制遵循朗波—比耳（Lawb-Beer）定律，最初被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)，用以測定化學(xué)物質(zhì)的濃度，又稱分光光度計(jì)法[1]。許多化學(xué)溶液是有顏色的，溶液顏色與溶液濃度呈正比，顏色越深，濃度越高。因此，可以通過測定溶液顏色深淺來間接測定溶液的濃度。當(dāng)一束光線照射裝有一定顏色溶液時(shí)，部分光線將被有色溶液吸收，顏色越濃，光吸收比例越大，透光率越小。這種基于比較溶液顏色深淺測定溶液濃度的分析方法稱為比色分析，又稱分光光度法。

動(dòng)物精液同樣具有吸收光的特性，精子密度越高，吸收光越大。因此，利用分析化學(xué)中的光電比色法也可以測定精液中精子密度。

3 光電比色法在測定精子密度的方法

光電比色法測定精子密度是指利用光電比色儀通過測定已知精子密度的精液的透光率，建立透光率和精子密度的回歸方程或標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過測定未知密度精液的透光率，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線或查透光率與精子密度對(duì)照表而獲知被測精液中的精子密度[2]。

3.1 分光光度計(jì)使用方法

打開儀器預(yù)熱20min。用“波長設(shè)置”旋鈕將波長設(shè)置在550nm。取一支比色杯，加入3/4 量的已配制好的精液稀釋液作為空白對(duì)照液，然后進(jìn)行“調(diào)100%”或“調(diào)零”操作。

3.2 采集家畜的精液并取樣

利用假陰道法采取種公牛精液作為被測樣品。

3.3 測定精子密度

用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法準(zhǔn)確測定被測樣品的精子密度。為了計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，將每個(gè)樣本進(jìn)行兩次檢查計(jì)數(shù)，且相對(duì)誤差不得超過10%，若誤差超過此標(biāo)準(zhǔn)，需要進(jìn)行第3 次重復(fù)計(jì)數(shù)，取2 個(gè)數(shù)值相近的結(jié)果作為最終結(jié)果。

3.4 稀釋被檢精液

對(duì)已知精子密度的原精液用0.9%氯化鈉溶液作1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100 的稀釋。稀釋后各濃度的精子密度可換算得知。

3.5 用光電比色法檢查不同密度梯度的精液的透光率

經(jīng)過儀器預(yù)熱、選定波長、空白液“調(diào)零”等操作后，測定出不同密度梯度精液的透光率，記錄測定結(jié)果。

3.6 建立透光率和精子密度的線性模型，繪制反映透光率和精子密度間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在標(biāo)準(zhǔn)坐標(biāo)紙上以透光率為橫坐標(biāo)，以精子密度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)透光率與精子密度的變化規(guī)律，對(duì)照坐標(biāo)圖中形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線的每個(gè)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的透光率與精子密度的數(shù)值，形成透光率與精子密度對(duì)照表[3]。

值得一提的是，在不同型號(hào)的光電比色儀顯示器上有兩組讀數(shù)，除了顯示透光率外還標(biāo)有光密度，兩組數(shù)據(jù)可通過數(shù)學(xué)運(yùn)算進(jìn)行換算，在生產(chǎn)實(shí)踐中，測定結(jié)果可選擇不同的名稱（透光率或光密度）去表示。即形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線或?qū)φ毡矸从车囊部墒枪饷芏扰c精子密度間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。另外，在建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，透光率（或光密度）與精子密度也可對(duì)調(diào)坐標(biāo)，其變化規(guī)律和對(duì)應(yīng)的數(shù)值關(guān)系是一致的。

3.7 透光率（或光密度）與精子密度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖或?qū)φ毡淼膽?yīng)用及精液中精子密度的測定

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線或?qū)φ毡砗?，?duì)生產(chǎn)實(shí)踐中未知精子密度的精液只需用光電比色儀測定出其透光率（或光密度），即可根據(jù)透光率（或光密度）與精子密度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖或?qū)φ毡?，推算出或查出不同透光率（或光密度）下的精子密度。根?jù)經(jīng)驗(yàn)，在測定精液樣品時(shí)，將牛的原精液先稀釋80～100 倍，再測其透光值效果較好。

比色分析具有簡單、快速、靈敏度高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于微量組分的測定，通常測定含量在10-1～10-4mg 轅L 的痕量組分。在用比色法檢查精子密度時(shí)，若在建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)能選擇20個(gè)以上的稀釋濃度，利用Eviews 或Excil 軟件操作系統(tǒng)進(jìn)行處理，可得到線性回歸方程，將測得的透光率（或光密度）值代入回歸方程，即可準(zhǔn)確計(jì)算出被測精液中精子的密度。如能用計(jì)算機(jī)進(jìn)行程序化計(jì)算并連接打印系統(tǒng)，其結(jié)果的計(jì)算、顯示和存貯將更為準(zhǔn)確、便捷、清晰。