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    冰片增強(qiáng)依達(dá)拉奉對腦缺血再灌注損傷大鼠抗氧化作用研究

    2021-12-02 13:18:16王文生王月賈紅娥郭冬梅
    吉林中醫(yī)藥 2021年11期
    關(guān)鍵詞:冰片達(dá)拉腦缺血

    王文生·王月,陳 悅,賈紅娥,郭冬梅

    (1.烏魯木齊市中醫(yī)院南門醫(yī)院心腦病科,烏魯木齊 830000;2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院老年病科,烏魯木齊 830001)

    缺血性腦卒中(ischemia stroke,IS)是臨床常見的腦血管系統(tǒng)疾病[1]。目前常以溶栓聯(lián)合神經(jīng)保護(hù)藥物治療,但溶栓可能會導(dǎo)致失語、半身不遂[2]。依達(dá)拉奉(edaravone)是一種氧自由基清除劑,在缺血性腦卒中治療中應(yīng)用廣泛[3]。部分患者使用依達(dá)拉奉后仍存在神經(jīng)功能損傷[4]。中醫(yī)理論中腦缺血病機(jī)為“血行緩慢致瘀,瘀邪化熱致毒,毒邪傾體以致腦神逆亂”。因此,缺血性腦卒中早期治療應(yīng)“芳香開竅,祛瘀散熱”“祛除邪毒”[5]。且中西醫(yī)聯(lián)合是提高缺血性腦卒中患者治愈率的有效途徑。冰片(borneol)為龍腦香科植物龍腦,多用于中風(fēng)、痰熱、神昏竅閉等證,具有“引藥上行”“芳香走竄”的功效,常作為輔藥以促進(jìn)藥物吸收[6]。因此,冰片聯(lián)合依達(dá)拉奉治療能夠提高其抗氧化效果。本研究通過構(gòu)建腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型,探討冰片聯(lián)合依達(dá)拉奉對I/R 的影響,為冰片配伍依達(dá)拉奉用于治療缺血性腦卒中提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗試劑 冰片(艾片,borneol,左旋龍腦,含量≥86.0%,湖北俊輝藥業(yè)有限公司);依達(dá)拉奉注射液(必存,江蘇先聲東元制藥有限公司,批號:80190401);L3200 大鼠線栓(200~240 g,廣州佳靈生物技術(shù)公司);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,北京索萊寶公司)。MDA(malondialdehyde,丙二醛)試劑盒、SOD(superoxide dismutase,超氧歧化酶)試劑盒與GSH(glutathione,谷胱甘肽)試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術(shù)公司);Anti-ZO-1(閉鎖小帶蛋白1)、Anti-Occludin(咬合蛋白)、Anti-Claudin-5(閉合蛋白5)、Anti-β-actin(β-肌動蛋白)抗體(北京博奧森生物技術(shù)公司)。

    1.2 動物分組與給藥 60 只SD 大鼠,由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,清潔級,雄性,7~8 周齡,體質(zhì)量230~250 g,標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,腦缺血再灌注組,腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉組,腦缺血再灌注加冰片組,腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉加冰片組,每組12 只。腦缺血再灌注模型構(gòu)建前3 天與構(gòu)建后2 h,腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉組與腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉加冰片組尾靜脈給藥4 mL·kg-1依達(dá)拉奉,腦缺血再灌注加冰片組與腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉加冰片組灌胃給藥15 mL·kg-1冰片溶劑。

    1.3 I/R 模型構(gòu)建與神經(jīng)功能評估 麻醉大鼠,自頸部開口,分離出頸外動脈與頸內(nèi)動脈,將線栓插入頸總動脈,前進(jìn)至頸內(nèi)動脈約16~18 mm,固定線栓,縫合傷口。線栓插入2 h 后,取出線栓并結(jié)扎頸總動脈。假手術(shù)組僅麻醉后游離出頸總動脈。拔出線栓24 h 后,對各組大鼠神經(jīng)功能評估。評分標(biāo)準(zhǔn):0 分,行為正常;1 分,缺血對側(cè)前肢無法伸展;2 分,缺血對側(cè)前肢無法伸展,僅能向一側(cè)轉(zhuǎn)圈;3 分,向一側(cè)轉(zhuǎn)圈時側(cè)推易跌倒;4 分,癱瘓。

    1.4 腦梗死評估 取大鼠分離出全腦組織并冷凍成塊,切成5 片約2 mm 厚切片,浸沒于2 % TTC 溶劑中,避光孵育30 min,37 ℃。4% 多聚甲醛固定,按順序排列后拍照分析。

    1.5 腦水腫評估 取大鼠全腦組織,電子秤稱重,記為濕重。干燥去濕,6 h 后稱重,記為干重。腦水腫程度=[(濕重-干重)/濕重]×100 %。

    1.6 血腦屏障完整性評估 取大鼠,皮下注射4 mL/kg伊文思藍(lán)溶液。2 h 后處死,取缺血側(cè)腦組織,加入2 mL 甲酰胺勻漿,離心(12 000 r·min-1,20 min),取上清液。在620 nm 波長下檢測各個樣品孔OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算出各組樣品蛋白含量。

    1.7 氧化因子、炎性細(xì)胞因子檢測 取大鼠缺血側(cè)組織,加入PBS混合勻漿。12 000 r·min-1離心后取上清液,用于氧化因子或炎性細(xì)胞因子的檢測。具體檢測流程根據(jù)試劑盒說明書步驟開展。

    1.8 血腦屏障相關(guān)蛋白檢測 取大鼠缺血側(cè)基底層組織,加入裂解液勻漿,離心取上清液,加入上樣緩沖液,沸水浴變性。開展Western blot,并濕法轉(zhuǎn)移凝膠上蛋白至PVDF 膜上,脫脂奶粉封閉。使用一抗稀釋液浸沒PVDF 條帶孵育過夜,再以二抗稀釋液孵育。顯影儀下顯影獲得蛋白條帶,以β-actin 作為內(nèi)參,計算目的蛋白相對表達(dá)量。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析。實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,各組數(shù)據(jù)之間采用單因素方差分析(One way Anova),各組數(shù)據(jù)兩兩比較采用Tukey檢驗。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 見表1。

    表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較(,n =12) 分

    表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較(,n =12) 分

    注:與假手術(shù)組比較,# P <0.05;與腦缺血再灌注組比較,△P <0.05

    2.2 各組大鼠腦梗死體積占比比較 假手術(shù)組染色顯示為紅色,即無任何梗死區(qū)域;腦缺血再灌注組中缺血側(cè)組織染色幾乎全部為白色。見表2,圖1。

    表2 各組大鼠腦梗死體積占比比較(,n =12)

    表2 各組大鼠腦梗死體積占比比較(,n =12)

    注:與腦缺血再灌注組比較,# P <0.05,## P <0.01

    圖1 各組大鼠腦梗死區(qū)域染色

    2.3 各組大鼠腦水腫程度比較 見表3。

    表3 各組大鼠腦水腫程度比較(,n =12)

    表3 各組大鼠腦水腫程度比較(,n =12)

    注:與假手術(shù)組比較,## P <0.01;與腦缺血再灌注組比較,△P <0.05,△△P <0.01

    2.4 各組大鼠腦中氧化因子與抗氧化因子水平比較 見表4。

    表4 各組大鼠腦中氧化因子與抗氧化因子水平比較(,n =12)

    表4 各組大鼠腦中氧化因子與抗氧化因子水平比較(,n =12)

    注:與假手術(shù)組比較,## P <0.01;與腦缺血再灌注組比較,△P <0.05,△△P <0.01

    2.5 各組大鼠腦中炎性細(xì)胞因子水平比較 見表5。

    表5 各組大鼠腦中炎性細(xì)胞因子水平比較(,n =12)

    表5 各組大鼠腦中炎性細(xì)胞因子水平比較(,n =12)

    注:與假手術(shù)組比較,## P <0.01;與腦缺血再灌注組比較,△P <0.05,△△P <0.01

    2.6 各組大鼠腦組織中緊密連接蛋白表達(dá)與量化統(tǒng)計比較 見圖3。與假手術(shù)組相比,腦缺血再灌注組中ZO-1、Occludin 與Claudin-5 表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。與腦缺血再灌注組相比,腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉組與腦缺血再灌注加冰片組ZO-1、Occludin 與Claudin-5 表達(dá)增加(P<0.05)。腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉加冰片組ZO-1、Occludin與Claudin-5表達(dá)水平增加更明顯(P<0.01)。

    圖3 各組大鼠腦組織中緊密連接蛋白表達(dá)與量化統(tǒng)計比較

    3 討論

    目前,靜脈溶栓與神經(jīng)保護(hù)藥物聯(lián)合使用是缺血性腦卒中主要治療方式[7],可幫助患者血流再通,但部分患者也會出現(xiàn)再灌注損傷[8]。本研究通過線栓法構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注模型。結(jié)果顯示,腦缺血再灌注造成大鼠神經(jīng)功能異常,腦組織中出現(xiàn)梗死區(qū)域。與此同時,構(gòu)建模型的各組大鼠出現(xiàn)不同程度的水腫,以腦缺血再灌注組最為明顯。此外,腦缺血再灌注導(dǎo)致大鼠腦組織中氧化因子、炎性細(xì)胞因子水平增加,抗氧化因子水平降低。以上結(jié)果提示本研究中腦缺血再灌注模型構(gòu)建成功。

    中醫(yī)認(rèn)為,缺血性腦卒中屬于“血瘀證”,其特點為阻血滯氣、傷神損絡(luò),治療原則為活血化瘀,若清竅阻滯,則氣血失于上行,水津失于輸布,痰瘀邪毒蘊結(jié)?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,大腦具有高能耗的特性,對缺血缺氧更敏感[9]。腦缺血再灌注會介導(dǎo)細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過氧化物[10]。如MDA 屬于氧化應(yīng)激最終產(chǎn)物,會造成蛋白質(zhì)、核酸等大分子的交聯(lián)聚合,產(chǎn)生細(xì)胞毒性,與中醫(yī)理論中的邪毒一致。SOD 與GSH 是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基兩種主要活性成分,組織內(nèi)MDA、GSH 水平與SOD 活性可反映氧自由基損傷程度[11]。在氧化因子的攻擊下,血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞會出現(xiàn)不同程度損傷,細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度破壞,以緊密連接中ZO-1 蛋白、跨膜蛋白中Occludin 蛋白、Claudin 蛋白表達(dá)降低為特征[12]。在內(nèi)皮細(xì)胞損傷情況下,微血管與腦實質(zhì)器官會出現(xiàn)損傷,血腦屏障的開放程度增加,外周水分子進(jìn)入造成腦水腫[13]。中樞炎性細(xì)胞因子在應(yīng)激條件下的過度釋放進(jìn)一步加大血腦屏障開放程度,造成神經(jīng)元壞死,出現(xiàn)局部的梗死區(qū)域[14]。生理條件下,體內(nèi)會通過抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)清除多余的活性氧,避免MDA過量產(chǎn)生。但腦缺血再灌注過程中,機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)功能無法完全抵御氧化應(yīng)激的過度激活,因此需要外源性藥物輔助治療。

    依達(dá)拉奉是一種氧自由基清除劑,研究顯示依達(dá)拉奉基于Nrf2/HO-1 信號通路,誘導(dǎo)Akt 的激活,發(fā)揮抗氧化抗炎作用[15]。本研究中,依達(dá)拉奉降低了氧化因子MDA 水平,增加了抗氧化因子SOD 與GSH水平,降低了炎性細(xì)胞因子水平。然而,在大鼠腦組織梗死體積、腦缺血和神經(jīng)功能的宏觀指標(biāo)中,依達(dá)拉奉無法完全逆轉(zhuǎn)腦缺血再灌注造成的損傷。因此,腦缺血再灌注治療需要聯(lián)合給藥促進(jìn)依達(dá)拉奉發(fā)揮抗氧化功能。

    中醫(yī)常用配伍藥物為冰片,具有“獨行則勢弱,佐使則有功”的特性?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),冰片不僅能穿過血腦屏障,而且能改變血腦屏障通透性,促進(jìn)其他藥物透過血腦屏障。本研究中,冰片介導(dǎo)了腦組織中炎性細(xì)胞因子部分降低,對氧化應(yīng)激因子具有一定抑制作用,但作用不明顯。在依達(dá)拉奉配伍冰片的應(yīng)用中,腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激因子、炎性細(xì)胞因子水平明顯降低,抗氧化應(yīng)激因子明顯提高。在大鼠宏觀指標(biāo)中,與腦缺血再灌注組相比明顯改善。

    綜上所述,冰片具有“通諸竅、散郁火”功能,用于腦缺血治療具有部分療效。冰片增強(qiáng)了依達(dá)拉奉抗氧化作用,提高了神經(jīng)保護(hù)作用。這種配伍方式符合“相須相使”的配伍原則,值得在溶栓后抗腦缺血再灌注損傷治療中應(yīng)用。

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