固相萃取-高效液相色譜法快速測(cè)定煙草用爆珠中4種蘇丹紅

王曉嬌，王東翔，王連棟，鄭秀瑾，張苗苗，嚴(yán)云麗

（1.青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司，山東青島 266101； 2.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司青島卷煙廠，山東青島 266101；3.濟(jì)南市第二產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)院，濟(jì)南 271100）

爆珠添加是一種卷煙賦香的創(chuàng)新技術(shù)，卷煙濾嘴中植入一?；蛘叨嗔Ｒ啄笃频南阄赌z囊，實(shí)現(xiàn)在卷煙吸食過(guò)程中人為可控的特色香味釋放，以達(dá)到增加煙氣濕度、提高濾棒截留香氣的效果。由于其加入所帶來(lái)的特殊感官體驗(yàn)，近年來(lái)爆珠添加成為衡量卷煙品質(zhì)的一種標(biāo)志，獲得了越來(lái)越多卷煙品牌的青睞［1-2］，其安全性也受到社會(huì)的關(guān)注。爆珠主要由外壁（天然膠）和內(nèi)芯組成。內(nèi)芯中除了添加增加香型的香精外，還會(huì)添加色素來(lái)增加彩色樣式。天然著色劑大多無(wú)毒副作用，但其穩(wěn)定性較差，易褪色，價(jià)格高等不足限制了應(yīng)用范圍［3-4］。工業(yè)染料具有價(jià)格便宜，著色強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但是工業(yè)染料因具有致癌性而被明令禁止添加進(jìn)食品及食品相關(guān)產(chǎn)品。

蘇丹紅是一種紅色染料，主要包含蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ四種物質(zhì)，屬于偶氮類(lèi)化合物［5］，具有致突變性和致癌性［6］，我國(guó)禁止其在食品及入口接觸材料中添加［7-8］。蘇丹紅成本低，顏色鮮艷且不易褪色，有不法生產(chǎn)者將蘇丹紅添加到食品及入口接觸材料中，維持產(chǎn)品鮮艷顏色。檢測(cè)出蘇丹紅的報(bào)道時(shí)有發(fā)生［9］，選用高效、快速檢測(cè)蘇丹紅含量的方法是非常必要的。蘇丹紅含量的常用檢測(cè)方法有分光光度法（UV）［10］，薄層法（TLC-UV）［11-12］等，高效液相色譜（HPLC）作為一種重要的檢測(cè)手段被廣泛用于蘇丹紅含量的檢測(cè)。我國(guó)已經(jīng)出臺(tái)了食品中蘇丹紅含量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)［13］，但該標(biāo)準(zhǔn)前處理復(fù)雜，檢測(cè)大量樣品時(shí)需要耗費(fèi)較多時(shí)間［14］。筆者采用HPLC法同時(shí)檢測(cè)爆珠樣品中4種蘇丹紅化合物，采用SPE蘇丹紅專(zhuān)用柱，可批量處理樣品，選用簡(jiǎn)單流動(dòng)相等度洗脫，在15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)4種蘇丹紅的完全分離。該方法克服了常用方法前處理復(fù)雜、分析時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了煙草用爆珠中蘇丹紅的快速檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-SH1000型，配有MWD 2.1L型紫外檢測(cè)器、P 6.1L型高壓輸液泵、AS 6.1L型自動(dòng)進(jìn)樣器，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司。

分析天平：Mettler Toledo AL-104型，感量為0.1 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

水浴鍋：SC-30型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

氮吹儀：ND400型，12孔位，杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司。

渦旋混勻器：XW-80A型，上海馳唐電子有限公司。

超純水機(jī)：UPT-Ⅱ-20L型，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

乙腈：色譜純，德國(guó)默克公司。

SPE前處理柱：SBEQ-CA4954型，6 mL，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

有機(jī)濾膜：0.45 μm，天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，電阻率大于18.2 MΩ·cm。

煙用爆珠均為市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu)。

蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為99.6%、99.6%、94.8%、99.6%，德國(guó)Dr Ehrenstorfer有限公司。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Athena C18-WP柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，德國(guó)CNW公司）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：乙腈-純水（體積比為95∶5）；洗脫方式：等度洗脫；流量：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：500 nm。

1.3 樣品前處理

稱(chēng)取約0.15 g左右爆珠樣品置于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL 70～80℃水，在恒溫水浴鍋中加熱30 min，使爆珠壁材完全溶解。冷卻后上樣至活化過(guò)的SPE蘇丹紅專(zhuān)用柱中，以5 mL正己烷淋洗，最后用5 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液于管中，40℃氮吹至近干。加入1 mL乙腈復(fù)溶，渦旋30 s，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

4種蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取蘇丹紅Ⅰ，蘇丹紅Ⅱ，蘇丹紅Ⅲ，蘇丹紅Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品 4、7、5、7 mg，置于4只10 mL容量瓶中，加入適量乙腈溶解，完全溶解后繼續(xù)加入乙腈定容至標(biāo)線，搖勻，置于4℃冰箱中保存。

4種蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取上述4種蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2 mL，置于同一只10 mL容量瓶中，加入乙腈定容至標(biāo)線，搖勻，置于4℃冰箱中保存。其中，蘇丹紅Ⅰ質(zhì)量濃度為8 mg／L，蘇丹紅Ⅱ質(zhì)量濃度為15 mg／L，蘇丹紅Ⅲ質(zhì)量濃度為9 mg／L，蘇丹紅Ⅳ質(zhì)量濃度為15 mg／L。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取4種蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5、2 mL 至7只10 mL容量瓶中，加入乙腈定容至標(biāo)線。4種蘇丹紅系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度見(jiàn)表1。

表1 4種蘇丹紅系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度

1.5 定性依據(jù)及定量方法

樣品測(cè)定時(shí)，通過(guò)樣品色譜峰的保留時(shí)間和標(biāo)品色譜峰的保留時(shí)間比對(duì)，保留時(shí)間一致（變化范圍在±1%之內(nèi)）的情況下可判斷樣品中確實(shí)存在蘇丹紅化合物。采用外標(biāo)法峰面積定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱選擇

對(duì)比中性氧化鋁和SPE蘇丹紅專(zhuān)用柱凈化效果，兩者都有較好的回收率，回收率為89%～92%。國(guó)標(biāo)GB／T 19681-2005 《食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法 高效液相色譜法》中采用中性氧化鋁固相萃取柱對(duì)樣品凈化，但是中性氧化鋁固相萃取柱需要手工填裝，填裝效果會(huì)因操作人員不同產(chǎn)生差異，且購(gòu)買(mǎi)的不同批次氧化鋁的活度也會(huì)有差距，對(duì)重復(fù)性結(jié)果產(chǎn)生影響。故選用SPE蘇丹紅專(zhuān)用柱進(jìn)行凈化。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 波長(zhǎng)選擇

通過(guò)液相色譜儀附DAD檢測(cè)器進(jìn)行170～600 nm全波長(zhǎng)掃描，在500 nm處4種蘇丹紅物質(zhì)均有較強(qiáng)吸收且無(wú)明顯雜質(zhì)干擾，所以選擇500 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行定量檢測(cè)。在此波長(zhǎng)下，各組分的吸光度已達(dá)到其最大吸收波長(zhǎng)吸光度的90%以上，可以滿足靈敏度的要求。

2.2.2 流動(dòng)相選擇

分別以乙腈-水（體積比為95∶5）和甲醇-水（體積比為95∶5）作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乙腈-水的洗脫能力更強(qiáng)，且峰形尖銳對(duì)稱(chēng)，因此選用乙腈-水溶液做為流動(dòng)相。

綜合以上因素，在1.2儀器工作條件下，測(cè)得4種蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。

圖1 4種蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2.3 線性方程和檢出限

取1.4中配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各10 μL，在1.2儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定（n=3），以待測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以3倍信噪比所對(duì)應(yīng)的被測(cè)物的質(zhì)量濃度作為方法檢出限（LOD）。4種蘇丹紅的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 4種蘇丹紅的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)

由表2可得，4種蘇丹紅物質(zhì)在各自的線性范圍內(nèi)與色譜峰峰面積均成良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

將本方法的檢出限與其它方法檢出限以及國(guó)標(biāo)法檢出限進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可以看出，本方法檢出限為0.03～0.04 mg／L，可實(shí)現(xiàn)蘇丹紅的痕量檢測(cè)。

表3 本法檢出限與其它方法檢出限的比較

2.5 加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)量0.15 g爆珠樣品（4種蘇丹紅均未檢出）18份，分別加入低、中、高濃度的蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3方法進(jìn)行樣品前處理，在1.2儀器工作條件下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，4種蘇丹紅加標(biāo)回收率為87.18%～95.28%，6次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.15%～7.38%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度和精密度較好，可用于蘇丹紅的定量檢測(cè)。

表4 樣品中加標(biāo)回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品測(cè)定

選擇不同廠家生產(chǎn)的8份紅色煙用爆珠產(chǎn)品，按照1.3對(duì)樣品進(jìn)行處理，在1.2儀器工作條件下對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，樣品及樣品加標(biāo)色譜圖分別見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 爆珠樣品液相色譜圖

圖3 爆珠樣品加標(biāo)譜圖

從圖2、圖3中可以看出，爆珠基質(zhì)中提取的物質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物干擾較小，這也體現(xiàn)了本方法的適用性。本次購(gòu)買(mǎi)的爆珠樣品中均不含有蘇丹紅成分，符合標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)語(yǔ)

建立了一種高效液相色譜同時(shí)分離4種蘇丹紅的檢驗(yàn)方法。該方法簡(jiǎn)單，精密度高，分析時(shí)間短。在同一波長(zhǎng)下，采用等度洗脫的方式，可在15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確分離。該方法測(cè)定蘇丹紅的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.03～0.04 mg／L，準(zhǔn)確度高，可用于煙草用爆珠中蘇丹紅含量的監(jiān)測(cè)。