真菌綠原酸的生物合成途徑解析及調(diào)控策略

駱艷娥，田嘉欣，葉健明，蹇麗娟，史 嬋，任 潤(rùn)

(西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710069)

綠原酸(chlorogenic acid，CGA)屬于苯丙素類化合物，具有多種重要的治療作用。近年來，中外對(duì)綠原酸在植物中的合成路徑與調(diào)控的研究較為全面，然而綠原酸在真菌尤其是食用菌中的研究很少?，F(xiàn)綜合分析綠原酸的生物合成途徑及其影響因素的研究進(jìn)展，為食用菌中綠原酸的合成及其提質(zhì)增效提供研究思路與方法。

1 綠原酸的功效

綠原酸分子中的兒茶酚可作為自由基的結(jié)合位點(diǎn)[1]。綠原酸含有5個(gè)羥基和1個(gè)羧基，其中羥基充當(dāng)抗氧化性能的正極，羥基數(shù)量越多，綠原酸的抗氧化能力越強(qiáng)。綠原酸也可通過調(diào)控抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路來發(fā)揮抗氧化功能，還可上調(diào)動(dòng)物體內(nèi)抗氧化酶活性來阻止氧化反應(yīng)的發(fā)生，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)[2-4]。綠原酸的抗炎特性可能與其兒茶酚基團(tuán)有關(guān)[5]。綠原酸可抑制TLR3或TLR4及核因子κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)等信號(hào)通路，通過清除細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)，顯著抑制氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)白介素-8 (interleukin-8，IL-8)等炎癥因子的表達(dá)，從而起到抗炎作用[6]。

綠原酸能抑制金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌、乳酸鏈球菌、糞鏈球菌等革蘭陽性菌和大腸桿菌、傷寒沙門菌、金黃色假單胞菌等革蘭陰性菌的生長(zhǎng)。綠原酸能夠破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、增加膜通透性，使細(xì)胞膜去極化，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)和遺傳物質(zhì)外泄，有效地殺死細(xì)菌[7-8]。綠原酸還能降低細(xì)菌細(xì)胞壁的硬度，減少細(xì)菌的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散[9-10]。綠原酸是潛在的廣譜抗病毒藥物，既可抑制病毒遺傳物質(zhì)的復(fù)制[11]，亦可通過基因調(diào)控下調(diào)表面抗原的產(chǎn)生或受體因子的增加[12-13]，還可抑制病毒基因整合酶的活性。總的來說，對(duì)不同的病毒，綠原酸作用機(jī)制不同，且不易產(chǎn)生耐藥性。

綠原酸在脂質(zhì)和葡萄糖代謝調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，可以降低胰島素抵抗、脂肪積累和體重，同時(shí)抑制PPARγ阻止肝臟脂肪變性[14]。綠原酸通過增強(qiáng)突觸素I的表達(dá)，跨越血-腦脊髓液屏障，對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用，促進(jìn)血清素的釋放，發(fā)揮抗抑郁作用[15]。綠原酸可通過增多巨噬細(xì)胞來抑制腫瘤生長(zhǎng)，還可誘導(dǎo)腫瘤分化或通過影響細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。

鑒于多種重要的生物學(xué)功能[16]，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、保肝、抗糖尿病、降血脂、降血壓、神經(jīng)保護(hù)[17-19]、保護(hù)心臟、抗肥胖、改善腸道微生物失調(diào)[20]、腸屏障保護(hù)[21]、提高免疫力等，綠原酸現(xiàn)已成為一種重要的飲食多酚。

2 綠原酸的生物合成途徑及關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)

細(xì)胞工程技術(shù)可有效提高真菌中綠原酸含量。要想有的放矢地調(diào)控綠原酸的合成，首先要搞清楚其生物合成途徑。綜合分析現(xiàn)有文獻(xiàn)，繪制綠原酸的生物合成路徑(圖1)，其中，苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)、4-香豆酰輔酶A連接酶(4-coumaroyl CoA ligase，4CL)、莽草酸/奎寧酸羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶(hydroxycinnamoyl transferase，HCT)和羥基化肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(p-coumarate-3-hydroxylase，C3H)是綠原酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶[22-23]，誘導(dǎo)其表達(dá)將有助于提高食用菌中綠原酸的濃度。

圖1 綠原酸的生物合成途徑[35-37]Fig.1 Biosynthetic pathways of chlorogenic acid[35-37]

2.1 PAL

真菌可通過草酸途徑合成苯丙氨酸，該代謝途徑的第一步涉及苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL，EC4.3.1.24)，將氨從L-苯丙氨酸解離并產(chǎn)生反式肉桂酸，是關(guān)鍵限速酶[24-26]。絲狀真菌中PAL由1e4基因編碼[27]，負(fù)責(zé)苯丙氨酸向反式肉桂酸的轉(zhuǎn)化，是從初級(jí)代謝進(jìn)入苯丙烷類次級(jí)代謝的通道[28]。該酶屬于芳香族氨基酸裂解酶家族，是苯丙烷途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，與大多生物活性代謝物有關(guān)，如類黃酮、花色素苷[29]。

從X射線晶體學(xué)角度看，紅色酵母R.toruloidesPAL具有同四聚體三維結(jié)構(gòu)[31]。該同四聚體蛋白每個(gè)亞基含有716個(gè)殘基，分子質(zhì)量為76.88 ku；每個(gè)亞基的海馬狀形狀與其他兩個(gè)亞基互鎖，從而使相鄰的亞基相互作用最大化，形成四聚體[30]。PAL包含輔因子亞甲基咪唑啉酮(methylene imidazolinone，MIO)，是將其保守的Ala-Ser-Gly序列中的殘基進(jìn)行環(huán)化和脫水而形成的，為親電基團(tuán)[32]。

PAL是少數(shù)不包含輔因子吡醛5-磷酸的氨基酸轉(zhuǎn)化酶之一，具有不尋常的修復(fù)基團(tuán)——脫氫丙氨酸。多種來源的PAL制劑米氏常數(shù)(Km)相同，但該酶對(duì)底物結(jié)合具有負(fù)協(xié)同作用[33]。大多數(shù)PAL不需要金屬離子參與催化過程，多種化合物可抑制PAL的活性[34]，如L-2-氨基氧-3-苯基丙酸(AOPP)、R-(1-氨基-2-苯基乙基)膦酸(APEP)、(2-氨基-2，3-二氫-1H-茚-2-)膦酸(AIP)、酚酸、重金屬離子等[30]。

2.2 C4H

肉桂酸4-羥基化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H，ECl.14.13.11)是苯丙烷類代謝途徑中的第二個(gè)酶，即苯丙氨酸代謝途徑中繼 PAL后的第2個(gè)關(guān)鍵酶。C4H屬于細(xì)胞色素P450單加氧酶 CYP73 家族；P450單加氧酶是一大類位于膜上的血紅素蛋白。C4H底物中相對(duì)惰性的碳?xì)滏I也能在溫和條件下被氧化[38]。C4H在氧和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的存在下，該酶以NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶作為電子供體，催化反式肉桂酸苯環(huán)的4位羥基化，生成對(duì)羥基香豆酸(圖2)，進(jìn)入苯丙酸類、黃酮類、木質(zhì)素等化合物的合成途徑[39]。

圖2 C4H催化反應(yīng)機(jī)理[42]Fig.2 Catalytic mechanism of C4H[42]

作為P450蛋白家族成員，C4H包含兩個(gè)核心結(jié)構(gòu)域，即螺旋N端疏水結(jié)構(gòu)域(富含脯氨酸的區(qū)域)和C端半胱氨酸-血紅素鐵結(jié)合結(jié)構(gòu)域；其中螺旋N端疏水結(jié)構(gòu)域是蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的錨點(diǎn)[40]。

C4H酶對(duì)PAL的產(chǎn)物肉桂酸有專一性，C4H酶與PAL酶通常是以協(xié)同方式表達(dá)。在同種類植物提取物中，測(cè)定得到C4H酶活性比PAL低很多，說明C4H有限速的功能[41]。因此，深入研究C4H對(duì)提高苯丙烷途徑的次級(jí)代謝速率和次級(jí)代謝產(chǎn)物量非常重要。

2.3 4CL

4-香豆酰輔酶A連接酶(4-coumaroyl CoA ligase，4CL，EC6.2.1.12)是苯丙烷類代謝途徑轉(zhuǎn)向其他物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶之一，能催化肉桂酸及其羥基或甲氧基衍生物生成相應(yīng)的輔酶A酯，如圖3所示。該酶屬于腺苷酸形成酶家族，具有兩個(gè)保守的肽基序。該酶在綠原酸、類黃酮等苯丙烷類化合物的生物合成中很有價(jià)值。

圖3 4CL催化反應(yīng)機(jī)理[43]Fig.3 Catalytic mechanism of 4CL[43]

2.4 HCT

?；巧纱紊x產(chǎn)物的重要步驟[44]。莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(shikimic acid/quinic acid hydroxycinnamoyl transferase，HCT)是植物?；D(zhuǎn)移酶家族的一個(gè)重要分支，在不同物種間的序列一致性很低，具有HXXXD和 DFGWG兩個(gè)保守序列[45-46]。

1.2.2.1 結(jié)構(gòu)變動(dòng)度(Degree of Structure Variation，DSV)[2, 5]

雖然HCT序列的一致性較低，但HCT蛋白質(zhì)底物結(jié)合位點(diǎn)都位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間。HCT具有底物普適性，以多種?；o酶A(咖啡酰輔酶A、對(duì)香豆酰輔酶A、阿魏酰輔酶A、肉桂酰輔酶A和芥子酰輔酶A等)作為?；w，催化多種底物(莽草酸、奎寧酸、龍膽酸、4-羥基苯乙胺和4-羥基苯乳酸等)形成酯類或酰胺化合物。

在HCT催化作用下，對(duì)羥基香豆酰輔酶A提供?；o奎寧酸/莽草酸，生成對(duì)香豆?？鼘幩?莽草酸即C3H酶作用的底物[47]。HCT還能將C3H催化后的產(chǎn)物咖啡酰莽草酸去掉莽草酸，轉(zhuǎn)變成咖啡酰輔酶A。HCT位于C3H催化的苯丙烷羥基化過程的上游與下游結(jié)合處，HCT的?；揎椩谝欢ǔ潭壬鲜强赡娴?。

2.5 C3H

苯丙烷的生物合成至少需要兩個(gè)羥基化步驟。C4H在肉桂酸芳香環(huán)的4位引入第一個(gè)羥基；第二步羥基化反應(yīng)由對(duì)香豆酸-3-羥基化酶(p-coumarate-3-hydroxylase,C3H)催化，發(fā)生在3位上。C3H屬于細(xì)胞色素P450 (cytochrome，CYP450)中的CYP98亞家族[48]，其催化對(duì)香豆酰莽草酸/奎寧酸C3位置的羥基化反應(yīng)，生成咖啡酰莽草酸/奎寧酸[49]，是酚類天然產(chǎn)物生物合成的必需酶。C3H的催化作用需在有NADPH和O2的條件下進(jìn)行，且催化能力取決于NADPH結(jié)合對(duì)香豆酰莽草酸酯或?qū)ο愣辊？鼘幩狨ブ卸浜衔锏暮铣闪縖50]。

2.6 HQT

羥基肉桂酰輔酶A奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶 (hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT)與HCT同屬于?；D(zhuǎn)移酶家族，HQT也具有參與苯丙氨酸代謝的BAHD?；D(zhuǎn)移酶的特征，也包含HXXXD和DFGWG這兩個(gè)基因序列。通過實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)HQT基因與HCT基因是緊密連鎖的[51]。與HCT的底物普適性不同，HQT有酰基受體的特異性，是催化綠原酸生物合成最后一步的酶，催化咖啡酰輔酶A和奎寧酸進(jìn)行酯交換，生成綠原酸[52]。

3 綠原酸生物合成的調(diào)控

真菌中綠原酸的含量受氣候條件與營養(yǎng)條件等制約，如溫度、光照、濕度、營養(yǎng)素、礦質(zhì)營養(yǎng)、外源植物激素等[53-54]。

3.1 光照

光作為信號(hào)分子，在次生代謝產(chǎn)物的合成中具有重要作用。真菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，形成了極其完整精密的光感受系統(tǒng)，可以感受光的有無、光的方向、強(qiáng)度和光周期的長(zhǎng)度，以便更好地生長(zhǎng)[55]。

光照對(duì)綠原酸合成的影響主要包括光照強(qiáng)度和光的波長(zhǎng)[56]。光對(duì)植物綠原酸的合成有顯著的影響，光照下PAL的活性先上升，促進(jìn)PAL鈍化酶開始合成，PAL活性達(dá)峰值后下降，表現(xiàn)出明顯節(jié)律性[57]。在真菌中存在兩種光調(diào)節(jié)現(xiàn)象，膜的電傳遞功能和細(xì)胞中類胡蘿卜素的積累，在生理上顯然相關(guān)。光照也會(huì)影響某些菌絲體酶，如光照增加了核苷二磷酸激酶的磷酸化程度，激活了cAMP磷酸二酯酶，并改變NAD+激酶分子形式及活性[58]。

總的來說，真菌中光誘導(dǎo)研究仍處于初級(jí)階段。植物中光誘導(dǎo)方式研究較多。例如，Bartley等[59]研究了UV-B輻射下胡蘿卜片中與苯丙烷類生物合成相關(guān)的一些基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)植物可通過UV-B受體感知UV-B光，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HY5，刺激PAL、C4H、4CL等核心通路基因的過表達(dá)，誘導(dǎo)綠原酸大量合成，UV-B處理7 d后輻射處理組的綠原酸含量是對(duì)照組的6倍。Rodríguez-Calzada等[60]發(fā)現(xiàn)UV-B輻射增加PAL的表達(dá)，可顯著提高辣椒葉片中綠原酸的含量；但不誘導(dǎo)線粒體錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和過氧化物酶(POD)等氧化反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)。

光周期也對(duì)綠原酸的合成產(chǎn)生重要影響。在白光光強(qiáng)12 000 lux、16 h光照、8 h黑暗的條件下，可提高杜仲愈傷組織中綠原酸含量[61]。在20 ℃培養(yǎng)溫度下紫錐菊不定根生物量積累和咖啡酸衍生物(咖啡酸、綠原酸和菊苣酸)產(chǎn)量最高，在3 h光照+21 h黑暗培養(yǎng)條件下咖啡酸衍生物積累最多，說明生物量和次生代謝物的積累都受溫度和光周期影響[62]。Shimomura等[63]研究了光周期、光質(zhì)和光強(qiáng)等環(huán)境因子對(duì)生菜和綠原酸(chlorogenic acid，CGA)含量的影響，發(fā)現(xiàn)在高光強(qiáng)處理、日照時(shí)長(zhǎng)的增加、藍(lán)光LED處理均會(huì)使生菜中CGA含量增加；藍(lán)光通過上調(diào)一些與酚類化合物代謝相關(guān)的特定基因來增加生菜中酚類化合物的產(chǎn)量[64]；超長(zhǎng)的日照條件還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的ROS，生菜積累高水平的CGA可保護(hù)生菜植株免受ROS的傷害。利用代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究藍(lán)光和紅光對(duì)草莓代謝和基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)藍(lán)光誘導(dǎo)HCT表達(dá)，對(duì)提高CGA的合成量起著關(guān)鍵作用。藍(lán)光可以調(diào)節(jié)與綠原酸代謝相關(guān)的差異表達(dá)代謝產(chǎn)物(differentially expressed metabolites，DEM)和差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEG)的共表達(dá)，即可以通過藍(lán)光協(xié)同上調(diào)HCT和PAL基因和綠原酸的表達(dá)[65-66]。Lakshmanan等[67]認(rèn)為藍(lán)光下次生代謝物的增加是由隱花色素、WRKY和ZnF基因介導(dǎo)的，其中隱花色素可以增加核內(nèi)ROS，以提高對(duì)壓力條件的韌性。PAL活性與藍(lán)光及日照時(shí)長(zhǎng)均有關(guān)，可見不同的環(huán)境因子組合對(duì)CGA的積累存在交叉效應(yīng)。

這些研究可為真菌的光誘導(dǎo)和光調(diào)控研究提供一些方法的借鑒。隨著研究的深入，將來可通過調(diào)節(jié)真菌的光受體信號(hào)控制其生長(zhǎng)發(fā)育、生理周期、形態(tài)變化，進(jìn)而調(diào)控次級(jí)代謝產(chǎn)物合成。

3.2 溫度

低溫是細(xì)胞最重要的影響因素之一，可改變膜的流動(dòng)性，直接影響對(duì)膜敏感的代謝過程[68]。低溫可能使綠原酸生物合成途徑相關(guān)酶活性及基因表達(dá)升高，利于綠原酸的積累。Joёt等[69]證明環(huán)境溫度通過微妙的轉(zhuǎn)錄調(diào)控直接影響咖啡CGA的生物合成時(shí)期及積累量，如PAL和C4H mRNA的積累在早期表現(xiàn)出溫度依賴性，并與寒冷氣候下苯丙烷合成的延遲有關(guān)。在咖啡種子中CGA生物合成活性最高的階段，PAL和C4H的表達(dá)因低溫上調(diào)。在擬南芥中，溫度對(duì)組織酚類成分的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平[70]，PAL [擬南芥PAL1AT2G37040(At02323251_g1)，PAL2AT3G53260(At02188099_g1)]和其他苯丙烷類的調(diào)控基因也在擬南芥中迅速上調(diào)以適應(yīng)低溫[71]。

溫度和光照之間還存在交互作用。PAL基因是光誘導(dǎo)性的，StPAL啟動(dòng)子在低溫響應(yīng)中的表達(dá)模式僅限于光合組織，PAL mRNA以光依賴性方式響應(yīng)低溫，進(jìn)而增大其表達(dá)量[72]。因此，探究出最佳溫度光照條件后便可找出合適的種植及采摘月份。

3.3 水分

土壤水分與綠原酸次生代謝有關(guān)。真菌胞內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物積累量通常與干旱脅迫程度、發(fā)生時(shí)間長(zhǎng)短等相關(guān)。當(dāng)遇到不利的環(huán)境條件時(shí)，細(xì)胞中存在一些機(jī)制進(jìn)行資源分配，決定有限的資源是用于生長(zhǎng)還是用于防御性代謝物的生產(chǎn)[73]。在適度干旱脅迫和短時(shí)間干旱脅迫下，通過苯丙烷化途徑的次生代謝產(chǎn)生更多的綠原酸和黃酮[74-76]。然而，促進(jìn)次生代謝物的產(chǎn)生雖可改善防御系統(tǒng)，但會(huì)迫使其他功能(如生長(zhǎng)發(fā)育)降低，導(dǎo)致防御機(jī)制下生長(zhǎng)和生產(chǎn)之間的負(fù)相關(guān)[77]。同時(shí)，干旱導(dǎo)致活性氧 (ROS)的過度產(chǎn)生[78]，為了應(yīng)對(duì)氧化脅迫，作物會(huì)啟動(dòng)清除自由基的分子和生化機(jī)制，包括酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)。各種苯丙烷類代謝物被認(rèn)為有助于非酶抗氧化保護(hù)[79]，綠原酸能緩解逆境脅迫引起的膜脂質(zhì)過氧化，減少細(xì)胞膜損傷，從而可以保護(hù)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁[74]?？掠么旱萚80]發(fā)現(xiàn)隨著干旱程度的加深，金銀花中綠原酸含量先迅速升高，而后不斷下降；輕度干旱處理后，綠原酸含量增加了73.36%。楊云富等[81]發(fā)現(xiàn)紅心菊土壤含水量為對(duì)照組的63%時(shí)，綠原酸含量比對(duì)照增加了35.99%。因此，適度干旱有利綠原酸和黃酮物質(zhì)的積累，充足供水和過度干旱均不利于作物中綠原酸含量的提高[82-84]。

真菌沒有特殊的吸水器官和蒸騰器官，但大部分真菌必須從環(huán)境中吸收水分，且要消耗大量的水分保持和外界的聯(lián)系，保持細(xì)胞中水分的平衡和營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)真菌的生長(zhǎng)發(fā)育。含水量的變化直接影響著真菌尤其是黑木耳的生理活動(dòng)，如果菌體細(xì)胞缺乏水分將會(huì)引起菌絲體的萎縮和子實(shí)體的凋萎，使整個(gè)機(jī)體的生理活動(dòng)受到阻礙，甚至停止，因此失去了生存的能力。當(dāng)受到一定程度的脅迫，真菌可能通過次生代謝產(chǎn)生更多的綠原酸和黃酮抑制自身生長(zhǎng)發(fā)育來適應(yīng)外界環(huán)境的變化。也就是說，優(yōu)化真菌培養(yǎng)過程的灌溉策略可獲得高含量的綠原酸。

3.4 營養(yǎng)

營養(yǎng)元素，尤其是碳、氮、氧、硫、磷在綠原酸的合成與積累中起重要作用[85]。施肥時(shí)不僅要適量且應(yīng)注意比例配合，磷肥應(yīng)適量多補(bǔ)充，有機(jī)氮肥應(yīng)適當(dāng)少量[86-89]。施氮量超過240 kg/hm2時(shí)，金銀花中綠原酸含量隨著施氮量的增加而下降[90]。L-苯丙氨酸是合成綠原酸的前體，也是合成蛋白質(zhì)的前體，因此酚類和蛋白質(zhì)之間存在著爭(zhēng)奪共同前體的競(jìng)爭(zhēng)。在高氮環(huán)境下，氮可能通過促進(jìn)L-苯丙氨酸向蛋白質(zhì)的通道而抑制類黃酮和綠原酸的合成。低氮供應(yīng)會(huì)導(dǎo)致氮缺乏，促使L-苯丙氨酸脫氨合成類黃酮和綠原酸，以回收脫氨后的L-苯丙氨酸中的氮[91]。缺乏氮可以促進(jìn)苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性，從而導(dǎo)致酚類化合物的積累[92]。P2O5用量在0～180 kg/hm2的范圍時(shí)，綠原酸隨著施磷量增加而增加，超過180 kg/hm2時(shí)，綠原酸含量反而下降；施鉀量為225 kg/hm2時(shí)，綠原酸含量最高[90]。

微量元素?cái)z入量直接影響金屬元素效應(yīng)元件與結(jié)合蛋白的反應(yīng)效率，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，如Mo是鉬酶的必需元素，鉬酶與基因表達(dá)緊密相關(guān)[93]。B參與細(xì)胞壁的形成，影響植株生殖生長(zhǎng)及碳水化合物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝，進(jìn)而影響作物的產(chǎn)量及品質(zhì)[94]。Zn是多種蛋白質(zhì)的重要組成部分，超過1 200種蛋白質(zhì)含有Zn2+或與Zn2+結(jié)合、參與Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)[95-96]。Fe元素通常直接與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，如Fe-S蛋白、鐵血紅素蛋白是呼吸作用的重要蛋白質(zhì)，可激活基因的轉(zhuǎn)錄，參與電子轉(zhuǎn)移、氧化、還原反應(yīng)[97]。Cu2+形成穩(wěn)定絡(luò)合物的能力很強(qiáng)，它可與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)和其他有機(jī)物質(zhì)形成絡(luò)合物。低濃度的銅可促進(jìn)酶與底物的結(jié)合，使其活性增強(qiáng)；但過量時(shí)，銅與酶結(jié)合發(fā)生沉淀、絡(luò)合等反應(yīng)，使酶類蛋白質(zhì)變性、活性降低，最終導(dǎo)致失活，從而影響呼吸、代謝等一系列活動(dòng)[98-99]。綠原酸含量與硒濃度呈顯著正相關(guān)[100]，0.01～0.05 g/kg硒顯著提高綠原酸含量200%～400%，硒可以作為硒蛋白和一些重要酶的組成部分，如依賴硒的谷胱甘肽過氧化物酶。食用真菌作為一種很好的富硒載體，在富硒產(chǎn)品的開發(fā)上具有廣闊的發(fā)展前景[101-104]。此外，不同種微量元素之間存在協(xié)同或拮抗作用，使用時(shí)應(yīng)注意搭配比例[105]。蔣向輝等[106-107]發(fā)現(xiàn)微量元素 Fe、B、Mo 濃度的改變可引起HCT 和 C3H的表達(dá)發(fā)生變化，最終影響綠原酸的形成和積累。Cu和Se對(duì)菊花有效成分及其含量的影響主要體現(xiàn)在Cu、Zn、Se三元素之間的交互作用上，即Cu、Se配施有利于顯著提高菊花綠原酸的含量，而Cu、Zn和Zn、Se配施則表現(xiàn)出負(fù)效應(yīng)。銅、鋅在土壤中和作物體內(nèi)存在交互作用，鋅的施入提高了PAL等合成代謝中關(guān)鍵酶的活性，從而增加了總黃酮和綠原酸的合成量；而高劑量的銅恰恰降低了酶活性，從而抑制了有效成分的生成[100]。

3.5 生物誘導(dǎo)子調(diào)控

此外，生物誘導(dǎo)子可通過激活植物的防御機(jī)制提高某些次級(jí)代謝產(chǎn)物的含量，具有效率高、成本低和可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)。例如植物激素赤霉素(gibberellin 3，GA3)、水楊酸(salicylic acid，SA)、甲基水楊酸(methyl salicylic acid，MESA)、硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)[108]、黑曲霉誘導(dǎo)子(aspergillusnigerinducer，ANE)[109]、脫落酸(abscisic acid，ABA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)[110]可通過提高PAL的活性來促進(jìn)綠原酸合成，為真菌PAL的活性調(diào)控提供了研究思路。GA3能提高苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性[111]。SA和MESA能刺激提高PAL酶的活性，使蘋果葉片綠原酸、兒茶素等酚類物質(zhì)的含量增加[112]。MeJA可分別提高苯丙烷類途徑基因MsPAL、MsC4H、Ms4CL的表達(dá)量4.04、3.62、1.75倍，對(duì)薄荷毛狀根培養(yǎng)物中CGA的積累有顯著的影響[113]。Pan等[114]利用代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法分析了MeJA對(duì)金銀花綠原酸生物合成的影響，也證明編碼綠原酸生物合成途徑的基因表達(dá)水平發(fā)生了變化，其中LjPAL和LjC3H分別上調(diào)了17倍和37倍。Yu等[115]用外源SA、ABA或GA處理甘薯莖尖72 h后，CGA含量升高，并發(fā)現(xiàn)甘薯CGA生物合成途徑基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在ABA、GA、SA和JA等激素反應(yīng)位點(diǎn)。

越來越多的證據(jù)表明，苯丙烷類化合物的生物合成主要受R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)的調(diào)控。許多MYB轉(zhuǎn)錄因子在不同物種中被鑒定為激活劑和抑制物[116]。外源施用植物激素可能是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑基因表達(dá)來控制CGA生物合成的有效農(nóng)業(yè)技術(shù)措施，轉(zhuǎn)錄因子將成為定向調(diào)控次生代謝物的下一個(gè)突破口。

4 結(jié)論

綠原酸存在諸多優(yōu)點(diǎn)，但其含量低，導(dǎo)致綠原酸的提取成本較高，限制了大規(guī)模制備及應(yīng)用。真菌尤其是食用菌子實(shí)體中的DNA與RNA含量少、纖維素、多糖等雜質(zhì)干擾大，增大了食用菌綠原酸的生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控研究難度?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)綠原酸的合成途徑主要有3種，其中PAL、4CL、HCT、C3H是調(diào)控其合成量的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)；可通過物理、化學(xué)等手段誘導(dǎo)這些酶的編碼基因表達(dá)，如合理范圍內(nèi)光照強(qiáng)度的增加、低溫脅迫、適度干旱脅迫和短時(shí)間干旱脅迫、元素均衡等，以提高真菌中綠原酸的生物合成量。目前對(duì)其調(diào)控機(jī)制的研究不夠全面透徹，研究較多的僅有環(huán)境因子對(duì)PAL的影響，其他基因?qū)Νh(huán)境的響應(yīng)以及對(duì)綠原酸含量的影響研究較少。此外，對(duì)真菌綠原酸及其關(guān)鍵基因表達(dá)的研究也很少。近年來，綠原酸受到越來越多的關(guān)注，功效挖掘及作物提質(zhì)增效的方法也日漸增多，但對(duì)真菌這一種植周期短、產(chǎn)量高、易調(diào)控的大類關(guān)注過少。隨著高分辨基因檢測(cè)技術(shù)及定向合成技術(shù)的升級(jí)換代，不久的將來可對(duì)真菌綠原酸生物合成進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，有效降低綠原酸的生產(chǎn)成本，使綠原酸能夠大規(guī)模用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。