智能手機(jī)+顯微鏡原位觀察食用菌菌絲的操作方法

羅友梅 陳瑞雅 李小勇 張銳杰 李思思 李銳新 賀新生

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

食用菌生產(chǎn)者、研究者普遍使用各種生物顯微鏡對(duì)食用菌菌絲體、霉菌、細(xì)菌等培養(yǎng)物進(jìn)行觀察，傳統(tǒng)的方法都需要用載玻片制片觀察，無(wú)法原位直接觀察試管、培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)物，包括：培養(yǎng)物在培養(yǎng)基中的自然生長(zhǎng)狀態(tài)，如基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、菌絲的自然分枝角度、分生孢子分枝的形態(tài)、分生孢子的著生狀態(tài)、氣生菌絲老化情況、菌絲的鎖狀聯(lián)合、菌核、厚垣孢子等；培養(yǎng)物中的雜菌，如細(xì)菌、霉菌黏菌等的污染狀態(tài)。而使用帶攝像頭的生物攝影顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，可以直接獲得圖像，便于學(xué)術(shù)交流和現(xiàn)場(chǎng)教學(xué)、網(wǎng)絡(luò)直播交流，但其價(jià)格昂貴，使用成本高。

隨著智能手機(jī)的攝像功能的日益完善，有研究者嘗試直接用手機(jī)鏡頭直接對(duì)著顯微鏡的目鏡進(jìn)行拍攝[1,2]，也有報(bào)道運(yùn)用手機(jī)和三腳組合成拍照裝備在顯微鏡下觀察水霧動(dòng)態(tài)視頻的方法[3]。已有手機(jī)與生物顯微鏡連接裝置的實(shí)用新型專利，如黃馨穎等[4]申請(qǐng)的一種顯微鏡用手機(jī)定位拍攝輔助裝置。該裝置結(jié)構(gòu)由目鏡固定架和顯微鏡鏡頭構(gòu)成，其顯微鏡目鏡用固定架鎖緊調(diào)平后使用，解決了顯微鏡拍攝設(shè)備造價(jià)高、定位不準(zhǔn)確、易抖動(dòng)的問(wèn)題。陳曉曦[5]發(fā)明一種智能手機(jī)與顯微鏡頭的可拆式連接座，連接座包括與智能手機(jī)背面緊貼的貼合板，以及從貼合板兩端延伸而出并包覆智能手機(jī)兩側(cè)邊緣的一對(duì)夾合板，兩夾合板分別設(shè)置有用于彈性?shī)A緊智能手機(jī)正面的彈性卡指。沈明學(xué)[6]發(fā)明一種顯微鏡用手機(jī)鏡頭連接器，包括很多個(gè)調(diào)節(jié)座。鄧超[7]提到制作支架用來(lái)固定手機(jī)，可以觀察多臺(tái)顯微鏡下的標(biāo)本圖像，提高觀察效率，方便師生交流。

本文結(jié)合多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，介紹一種用便攜式支架固定手機(jī)，直接在顯微鏡目鏡上照相，原位觀察試管或培養(yǎng)皿中的食用菌菌絲及霉菌、細(xì)菌等的操作方法。

1 器 材

智能手機(jī)1 臺(tái)，手機(jī)支架1 個(gè)，普通生物顯微鏡1 臺(tái)，物鏡放大倍數(shù)2×、4×、10×、20×、40×、100×。試管斜面培養(yǎng)物，培養(yǎng)皿培養(yǎng)物。

2 操作方法

2.1 試管及培養(yǎng)皿的放置

如圖1所示，將已培養(yǎng)好的食用菌試管放置在顯微鏡的載物臺(tái)上，試管斜面垂直于載物臺(tái)，斜面邊緣與物鏡鏡頭中央對(duì)齊，觀察培養(yǎng)基邊緣的氣生菌絲；斜面培養(yǎng)基背面朝上，可以觀察培養(yǎng)基內(nèi)的菌絲。用4×、10×的物鏡直接原位觀察菌絲形態(tài)。在不影響觀察的前提下，可用其他物體將試管固定。

圖1 試管斜面培養(yǎng)物的放置

如圖2所示，培養(yǎng)皿背面朝上，放在載物臺(tái)上，用4×、10×的物鏡可以觀察培養(yǎng)基內(nèi)的菌絲體；將培養(yǎng)皿打開，放在載物臺(tái)上，用4×、10×、20×、40×、100×的物鏡可以觀察菌絲和細(xì)菌的形態(tài)。

圖2 培養(yǎng)皿的放置

2.2 構(gòu)建智能手機(jī)和便攜式支架的組合體

把手機(jī)固定在支架的卡槽上，有利于在后續(xù)的操作中對(duì)設(shè)備進(jìn)行微調(diào)，同時(shí)防止因手的抖動(dòng)造成手機(jī)聚焦困難。首先將支架放于水平桌面上，將智能手機(jī)安裝固定于支架上的裝載手機(jī)位置，使兩者形成一個(gè)組合體。調(diào)節(jié)手機(jī)后置攝像頭與水平面的角度，盡量達(dá)到兩者平行。

2.3 顯微鏡的調(diào)節(jié)

首先調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換器，將物鏡轉(zhuǎn)換成4×物鏡。然后進(jìn)行對(duì)焦，人眼通過(guò)目鏡觀察載物臺(tái)上的培養(yǎng)物，用右手順時(shí)針、逆時(shí)針來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，直到視野中出現(xiàn)清晰的圖像，對(duì)焦完成。對(duì)好焦后即可再次轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，調(diào)至10×物鏡，此時(shí)不再轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋，而是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋來(lái)對(duì)焦（方法同粗準(zhǔn)的調(diào)節(jié)一致），從而將物體放大。若調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)無(wú)果，可輕微來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)來(lái)對(duì)其進(jìn)行對(duì)焦。之后用相同的步驟將物鏡依次換至40×、100×，以進(jìn)一步原位觀察菌絲的形態(tài)。由于隨著放大倍數(shù)的增大，視野中的光線會(huì)變暗，可通過(guò)適當(dāng)調(diào)大光圈、調(diào)整燈源亮度和聚光器位置等方法加以解決。通過(guò)對(duì)粗調(diào)旋鈕、細(xì)調(diào)旋鈕及光圈、聚光器等的調(diào)整，便可在目鏡內(nèi)看見清晰的菌絲圖像。

2.4 組合體與顯微鏡結(jié)合

將組合體移至顯微鏡的正前方，調(diào)節(jié)手機(jī)支架的高度，使手機(jī)的高度高出顯微鏡的目鏡1～2 cm即可。打開手機(jī)的照相功能。開始調(diào)節(jié)手機(jī)攝像頭與水平面的角度使手機(jī)攝像頭與目鏡平行，同時(shí)調(diào)節(jié)手機(jī)攝像頭與目鏡兩者連線的距離，使手機(jī)的屏幕中可以看到一個(gè)完整且大致清晰的圖像，并盡量調(diào)整到可以看見完整圖形的最大值（大致為4 cm）。

2.5 手機(jī)對(duì)焦以及拍攝

雙手緊貼手機(jī)支架的底部，可將其在水平面內(nèi)前后左右移動(dòng)，直到手機(jī)內(nèi)可以大致看見菌絲體的形態(tài)。在確定好組合體和顯微鏡的距離，以及目鏡和攝像頭的距離后，輕點(diǎn)手機(jī)屏幕對(duì)其對(duì)焦，在可以清晰地看見菌絲體結(jié)構(gòu)后，開始照相。也可在調(diào)節(jié)好后，再微調(diào)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，使手機(jī)內(nèi)的圖像更為清晰。

2.6 單根菌絲生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的拍攝

先把培養(yǎng)皿打開，將培養(yǎng)物放在載物臺(tái)上，調(diào)節(jié)顯微鏡粗、細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕，選擇菌落邊緣的單根菌絲放在視野的最邊緣，用透明膠帶固定培養(yǎng)皿在載物臺(tái)上的位置。將手機(jī)和支架組合體放在目鏡上方合適的位置進(jìn)行拍照。針對(duì)不同生長(zhǎng)速度的物種，每間隔1 小時(shí)或數(shù)小時(shí)定時(shí)拍照。最后把采集到的圖片用動(dòng)畫軟件編輯為連續(xù)的視頻。

2.7 菌絲中原生質(zhì)流動(dòng)的拍攝

把培養(yǎng)皿打開，將培養(yǎng)物直接放在載物臺(tái)上。用40×或100×物鏡觀察，選擇單根菌絲進(jìn)行觀察，如菌絲直徑在5～20 μm 的羊肚菌、雙孢蘑菇、毛霉、根霉等的菌絲，可以用手機(jī)拍視頻，觀察菌絲中原生質(zhì)的流動(dòng)方向和流動(dòng)速度。

3 實(shí) 例

用上述方法觀察拍攝到的各種食用菌菌絲及霉菌、細(xì)菌實(shí)例見圖3～5。

圖3 在10×物鏡下原位觀察到的毛霉菌絲和被細(xì)菌污染的羊肚菌菌絲

圖4 在100×物鏡下原位觀察到的羊肚菌菌絲與桿狀細(xì)菌

圖5 在100×物鏡下原位觀察到的羊肚菌菌絲

4 注意事項(xiàng)

由于目前大部分智能手機(jī)的后置攝像頭有2～3 個(gè)或以上，在拍照之前應(yīng)進(jìn)行初試，找出成像最清楚的那一個(gè)再進(jìn)入后續(xù)操作。手機(jī)的后置攝像頭應(yīng)與目鏡靠近但不完全與其接觸，要保持一定距離。在點(diǎn)擊手機(jī)屏幕以及拍照時(shí)應(yīng)輕點(diǎn)，否則可能會(huì)導(dǎo)致支架劇烈晃動(dòng)而難以聚焦，也可以選擇質(zhì)量大的金屬支架予以避免。

原位觀察試管中的菌絲，最好用一個(gè)重物放在載物臺(tái)外側(cè)，擋住試管，以免試管滾落摔破。最好使用15×150（mm）規(guī)格的試管，其放在十字推進(jìn)器上可以左右移動(dòng)，便于用4×、10×物鏡直接觀察。使用18×180（mm）試管，放在十字推進(jìn)器上無(wú)法聚焦，而直接放在載物臺(tái)上觀察，又不便于固定和移動(dòng)，觀察較困難；使用20×200（mm）的試管也很難直接觀察。使用玻璃、聚丙烯材質(zhì)的培養(yǎng)皿直接觀察，效果都很好。

在目鏡中放入目鏡測(cè)微尺，對(duì)培養(yǎng)皿中的單根菌絲進(jìn)行定位、定時(shí)測(cè)量，可以測(cè)定菌絲的生長(zhǎng)速度。

試管、培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基應(yīng)使用透明度高的培養(yǎng)基配方，最好使用質(zhì)量較好的瓊脂粉。培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基厚度一般不要超過(guò)2 mm。