黑木耳乙醇提取工藝優(yōu)化與醇提物體外抗氧化活性分析

周天天 陳喜君 梁繼國 曲嘯婷 趙文文 孔祥輝*

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150000；2.黑龍江省菌物藥工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150000；3.黑龍江眾生生物工程有限公司，哈爾濱 150023；4.吉林省輝南國有林保護中心，吉林 通化 135199；5.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150000；6.黑龍江省黑木耳資源利用工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150000）

黑木耳（Auricularia auricula）營養(yǎng)豐富、食藥兼用。據(jù)《本草綱目》記載，木耳入胃、大腸經(jīng)，可“益氣不饑，輕身強志” “利五臟，排毒氣”[1]。黑木耳富含鐵、鈣和多種氨基酸，是天然補血品[2]，具有抗血小板聚集、抗血栓、提高免疫、減輕動脈硬化、延緩衰老[3]、抗輻射、抗炎、降血糖、抗癌、抗突變、抗菌、清胃滌腸、化解膽結(jié)石和腎結(jié)石、潤滑腸道等廣泛藥理活性[4]。其在大健康產(chǎn)業(yè)中具有良好的市場應(yīng)用前景。

近年來，針對黑木耳的研究主要集中于子實體或菌絲體活性成分提取、保健作用及產(chǎn)品開發(fā)方面，尤其是防治高血脂和冠心病作用等[5-7]。對活性成分的提取研究主要針對木耳水提工藝及其活性成分[8,9]，而對醇提物的相關(guān)研究較少[10,11]。醇提物具有的活血化淤等作用[12,13]，可作為抗血栓保健食品和藥材的篩選來源。研究顯示，黑木耳醇提物具有較強的DPPH 自由基清除活性，且與濃度呈正相關(guān)[14]。但目前仍然存在提取率低、提取條件復(fù)雜及活性成分不明確等問題。因此，開展黑木耳醇提取工藝及其成分研究具有重要意義。

本文從木耳粉碎粒度、乙醇濃度、料液比、超聲功率及超聲時間等方面對黑木耳醇提物的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，通過單因素試驗確定影響提取得率的主要因素，通過正交試驗確定最優(yōu)條件，并對醇提物的脂肪、多酚等活性成分進(jìn)行檢測和抗氧化活性研究，為相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑木耳樣品來源于黑龍江省綠山農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司黑木耳栽培基地，菌種由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所提供。分析純試劑葡萄糖、無水乙醇、乙醚、牛血清蛋白、磷酸、濃硫酸為天津市永大化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；考馬斯亮藍(lán)G-250、重蒸酚來自上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站試劑廠。

1.2 試驗設(shè)備

中草藥粉碎機TAISITE（天津市泰斯特儀器有限公司），電子分析天平JB5374-91（奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司），超聲波發(fā)生器SL-SM300（南京順流儀器有限公司），紫外可見分光光度計UV757CRT（上海儀電分析儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋HWS24 型、離心機TGL20M-Ⅱ、電熱鼓風(fēng)干燥箱BPG-9040A 均為上海一恒科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

（1）黑木耳醇提物的制備流程。將木耳用中藥粉碎機粉碎，過篩成不同粒度，備用。稱取5 g（精確至0.0001 g）木耳粉裝入燒杯，加入一定量乙醇溶液，振蕩搖勻。60 ℃恒溫水浴鍋中加熱，超聲波提取[10]1 h。7 500 r/min 離心20 min，分離出上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后于干燥箱（60 ℃）干燥至恒重。用差值法計算醇提物質(zhì)量，用比值法計算醇提物得率。

（2）黑木耳粉粒度對醇提物得率的影響。稱取5 g 不同粒度木耳粉（60 目、80 目、100 目、120目和140 目），以料液比（W/V）1∶20 加入100 mL 90%乙醇溶液，60 ℃恒溫水浴提取1 h，入超聲波儀，超聲功率480 W 提取20 min，7 500 r/min 離心20 min，其他處理同1.3（1），3 次平行實驗。

（3）乙醇濃度對醇提物得率的影響。稱取5 g 100 目木耳粉，分別加入50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液100 mL，水浴提取、超聲波提取及其他處理同1.3（1）。3 次平行實驗。

（4）料液比對醇提物得率的影響。稱取5 g 100目木耳粉，分別加入90%乙醇溶液，料液比（W/V）分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 和1∶30，水浴提取、超聲波提取及其他處理同1.3（1）。3次平行實驗。

（5）超聲功率對醇提物得率的影響。稱取5 g 100 目木耳粉，按照1∶25 的料液比加入90%乙醇溶液，水浴提取及其他處理同1.3（1）。超聲波提取時間為20 min，超聲功率分別為360 W、720 W、1 080 W、1 440 W 和1 800 W。3 次平行實驗。

（6）超聲時間對醇提物得率的影響。稱取5 g 100 目木耳粉，按照1∶25 的料液比加入90%的乙醇溶液，水浴提取及其他處理同1.3（1）。超聲提取功率1 440 W，超聲時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min 和50 min。3 次平行實驗。

（7）黑木耳醇提物制備的最優(yōu)條件。采用L9（34）正交試驗法對影響黑木耳醇提物得率的主要因素進(jìn)行研究和分析。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定正交試驗因素和水平（表1）。

表1 L9（34）正交試驗的因素和水平

（8）黑木耳醇提物的粗脂肪含量測定。稱取5.00 g 樣品，置于蒸發(fā)皿中，加入20 g 石英砂，以沸水浴蒸干，在100±5 ℃下干燥、研細(xì)。蒸發(fā)皿及附有樣品的玻璃棒用沾有乙醚的脫脂棉擦凈，一并轉(zhuǎn)入具塞錐形瓶中，加乙醚至完全浸沒樣品并多加20～30 mL，浸泡過夜（12 h 以上），用G3 垂融漏斗過濾于已恒重的脂肪燒瓶中，并分次加入乙醚，用力振搖后一并濾入脂肪瓶中，洗滌3 次，水浴回收溶劑，蒸干后95～105 ℃干燥2 h 稱重，計算樣品中脂肪含量[18]。

（9）黑木耳醇提物的多酚含量測定。配制酒石酸亞鐵溶液：稱取1 g 硫酸亞鐵和5 g 酒石酸鉀鈉，用水溶解并定容至1 L（避光低溫保存）。準(zhǔn)確吸取試液1 mL，注入25 mL 容量瓶中，加水4 mL和酒石酸亞鐵溶液5 mL，充分混勻，再加入pH 7.5磷酸鹽緩沖液至刻度，在波長540 nm 處，以試劑空白溶液作對照測吸光度[19]。計算公式為：

式中：L1 為試液總量（mL），L2 為測定時的用液量（mL），M為試樣的質(zhì)量（g），m為試樣干物質(zhì)含量百分?jǐn)?shù)（%），A為吸光度。

（10）抗氧化活性分析。參考林戀竹[23]和Shimadak[24]的方法，用維生素C（VC）作陽性對照，判斷各種濃度的黑木耳醇提物清除DPPH·的能力。試驗方法：A0試管為2 mL 蒸餾水+2 mL 0.2 mmol/L 的DPPH·-無水乙醇溶液；Ai試管為2 mL不同濃度的黑木耳醇提物樣品溶液+2 mL 0.2 mmol/L 的DPPH·-無水乙醇溶液；Aj試管為2 mL不同濃度的黑木耳醇提物樣品溶液+2 mL 無水乙醇溶液。黑木耳醇提物溶液、VC溶液對DPPH·清除率的計算公式如下：

式中：A0為不加黑木耳醇提物溶液的吸光度值；Ai為加入黑木耳醇提物溶液和DPPH·-無水乙醇溶液的吸光度值；Aj為加入黑木耳醇提物溶液和無水乙醇的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑木耳醇提取最優(yōu)條件的確定

（1）黑木耳粉碎粒度對醇提物得率的影響。木耳粉碎粒度是影響黑木耳醇提物得率的一個主要因素，在料液比1∶20、乙醇濃度90%、超聲功率480 W、超聲時間20 min 條件下，隨著木耳粒度的減小，黑木耳醇提物得率呈先增后減的趨勢（圖1-A），在粒度為100目時得率最高，達(dá)4.59%。出現(xiàn)這一趨勢的原因可能是在一定范圍內(nèi)，粒度越小越利于醇溶物質(zhì)充分溶于乙醇中，但當(dāng)達(dá)到一定臨界時，粒度過小可能會破壞一些成分，導(dǎo)致溶于乙醇的物質(zhì)含量減少。因而，確定粒度100 目為最佳。

圖1 黑木耳粉粒度、乙醇濃度、料液比、超聲功率和超聲時間與醇提物得率的關(guān)系

（2）乙醇濃度對醇提物得率的影響。隨著乙醇濃度的增加，黑木耳醇提物得率呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢（圖1-B），當(dāng)乙醇濃度為90%時，醇提物得率最高，為4.38%，其后降低。表明90%濃度范圍內(nèi)，乙醇濃度越高越有利于黑木耳醇溶性成分溶出。

（3）料液比對醇提物得率的影響。隨著乙醇體積的不斷增加，黑木耳醇提物得率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢（圖1-C），當(dāng)料液比為1∶25 時，醇提物得率最大，達(dá)4.71%。表明料液比1∶25 范圍內(nèi)乙醇溶液體積越大越有利于黑木耳醇溶物溶出。

（4）超聲功率對醇提物得率的影響。隨著超聲功率的增大，黑木耳醇提物得率呈現(xiàn)先增加后趨平穩(wěn)的狀態(tài)（圖1-D），當(dāng)超聲功率為1 440 W 時，醇提物得率最大，達(dá)4.36%。表明，超聲功率越大，其振蕩效果越好，可促進(jìn)黑木耳中醇溶物溶出，但當(dāng)達(dá)到一定功率時，醇溶物溶出率不再增加。

（5）超聲時間對醇提物得率的影響。隨著超聲時間的增加，黑木耳醇提物得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢（圖1-E），當(dāng)超聲時間為30 min 時，黑木耳醇提物得率最大，為4.33%。表明一定時間內(nèi)超聲時間的增加有利于黑木耳中的醇溶物溶出，但當(dāng)達(dá)到一定臨界后，可能由于超聲時間延長會破壞醇溶物中的某些成分，導(dǎo)致得率降低。

（6）黑木耳醇提物的正交分析結(jié)果。根據(jù)單因素試驗的結(jié)果確定影響黑木耳醇提物得率的主要因素是乙醇濃度（A）、料液比（B）和超聲時間（C）。采用L9（34）正交試驗法[20]對上述3 個因素進(jìn)行研究和分析，確定黑木耳醇提物的最優(yōu)條件，如表2所示。

由表2中的R 值可知，本試驗所研究的3 個因素對黑木耳醇提物得率影響的主次順序為B（料液比）＞A（乙醇濃度）＞C（超聲時間）。正交試驗直觀結(jié)果表明，最佳方案為A2B3C1，即乙醇濃度為90%，料液比為1∶30，超聲時間為20 min。由極差分析得到的最佳方案為A2B3C2，即乙醇濃度為90%，料液比為1∶30，超聲時間為30 min。

表2 L9（34）正交試驗的結(jié)果

由于直觀分析與極差分析得出最佳方案不一致，故再進(jìn)行驗證試驗，將兩者的結(jié)果做比較，前者得率為4.87%，后者得率為5.13%，最后確定最佳方案為A2B3C2，即乙醇濃度90%，料液比1∶30，超聲時間30 min，此條件下醇提物得率為5.13%。

2.2 黑木耳醇提物的理化指標(biāo)

經(jīng)分析測定，最佳條件下獲得的黑木耳醇提物的粗脂肪含量為33.17%、多酚含量為5.13%。

2.3 黑木耳醇提物抗氧化活性分析

由圖2可知，隨濃度增加，黑木耳醇提物清除DPPH 自由基能力上升，濃度0.6 mg/mL 時，DPPH 自由基清除率達(dá)50%以上，濃度0.8 mg/mL時，DPPH 自由基清除率為55.01%。表明黑木耳醇提物對DPPH 自由基具有較強清除能力，清除能力比維生素C 73.50% 略弱。

圖2 黑木耳醇提物和維生素C 對DPPH·的清除率

3 小 結(jié)

通過單因素試驗和正交試驗，最終確定黑木耳醇提物的最優(yōu)提取條件為乙醇濃度90%、料液比1∶30、超聲時間30 min，在此條件下得到的黑木耳醇提物得率最高，達(dá)到5.13%。

最優(yōu)條件提取的黑木耳醇提物經(jīng)理化檢測分析，確定其含有粗脂肪33.17%、多酚5.13%。體外抗氧化活性分析結(jié)果表明，黑木耳醇提物具有較強抗氧化活性，濃度0.8 mg/mL 時，對DPPH 自由基清除能力達(dá)到55%以上。