實時熒光定量PCR技術(shù)在生物飼料中的應(yīng)用

康凌宇， 倪 忠， 武俊明， 陳華友*

（1.江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212000；2.江蘇中興藥業(yè)有限公司，江蘇鎮(zhèn)江 212000）

隨著我國畜牧飼料行業(yè)的發(fā)展，生物飼料成為研究熱點(diǎn)之一。生物飼料是通過基因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)的新型飼料產(chǎn)品 （蔡輝益等，2014），在提高動物的生產(chǎn)性能、飼料的適口性和消化率，降低抗生素使用，降低發(fā)病率和提高成活率方面展現(xiàn)出巨大的潛力。發(fā)酵菌種是生物飼料的重要組成部分，特色功能菌株的篩選、菌株的組合效果是生物飼料產(chǎn)業(yè)化的研究方向。近年來，實時熒光定量PCR技術(shù)因其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品和食品安全檢測、醫(yī)學(xué)診斷等研究實踐領(lǐng)域，但在生物飼料的檢測中應(yīng)用較少，與傳統(tǒng)的基于微生物培養(yǎng)的檢測方法相比，實時熒光定量PCR技術(shù)更加省時省力。因此，本文對實時熒光定量PCR的原理、技術(shù)分類和在生物飼料中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，并總結(jié)了實時熒光定量PCR在生物飼料實驗中的注意事項。

1 實時熒光定量PCR的原理

實時熒光定量PCR（qPCR）是以常規(guī)PCR為基礎(chǔ)的一種新型核酸定量技術(shù)。其原理是在反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)過程中擴(kuò)增產(chǎn)物不斷積累，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加，通過熒光信號變化實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)進(jìn)程，將結(jié)果繪制成熒光擴(kuò)增曲線圖，從而定量定性分析起始模板。PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，熒光信號達(dá)到閾值，且熒光信號遠(yuǎn)高于背景信號，這種情況下產(chǎn)生的循環(huán)數(shù)稱為Ct值，通過Ct值對起始模板進(jìn)行定量分析（Kozera等，2013）。在此反應(yīng)階段，反應(yīng)組分不受限制，Ct值重復(fù)性高，是比在終端測定累計PCR產(chǎn)物量更為可靠的測量起始拷貝數(shù)的方法（Giulietti等，2001）。

2 實時熒光定量PCR技術(shù)檢測方法和定量方法分類

2.1 檢測方法 根據(jù)實時熒光定量PCR所用的熒光模式不同，其方法可分為DNA染料法和熒光探針法。SYBR GreenⅠ是應(yīng)用最廣泛的一種熒光染料，僅能與DNA雙鏈結(jié)合，只有結(jié)合到DNA雙鏈上的SYBR染料才能夠發(fā)射熒光信號，沒有結(jié)合的不發(fā)射熒光，從而保證了熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。由于SYBR GreenⅠ可以和任何dsDNA的小溝結(jié)合，因此需要通過熔融曲線分析來檢查擴(kuò)增片段的特異性 （Lin等，2014）。EvaGreen是替代 SYBR Green的第三代dsDNA結(jié)合染料，相比于非飽和的SYBR Green染料，EvaGreen染料穩(wěn)定性和靈敏度更強(qiáng)，對PCR反應(yīng)的抑制性更小，在飽和情況下產(chǎn)生的熒光信號更強(qiáng)（Mao 等，2007）。

TaqMan探針是使用最廣泛的熒光探針，當(dāng)探針完整時，熒光報告基團(tuán)發(fā)射的熒光被淬滅基團(tuán)吸收；在PCR延伸階段，Taq酶的5"端外切酶活性把探針降解，使得報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，報告基團(tuán)發(fā)出熒光信號；其可以利用多種熒光報告基團(tuán)同時進(jìn)行多重實時熒光定量PCR分析，特異性較強(qiáng)（Swayne 等，2011）。

2.2 定量方法

2.2.1 絕對定量 絕對定量是使用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量分析的一種方法。絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)品一般是指含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒、cDNA以及PCR產(chǎn)物等，將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋并檢測每個稀釋度的Ct值，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，測得的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Dhanasekaran等，2010），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線推算未知樣品的初始量。

2.2.2 相對定量 相對定量是在一定樣本中，靶序列相對于另一參照樣本的量的變化，也就是比較經(jīng)過處理的樣本和未經(jīng)處理的樣本之間的相對基因表達(dá)差異。相對定量又包括比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對定量和比較Ct值的相對定量。前者能準(zhǔn)確地量化初始材料的載量，檢測的結(jié)果是目的基因與參照基因的比值，只要參照基因恒定，比值的變化也就反映了目的基因的變化（Livak等，2001）。后者是同時擴(kuò)增待測靶基因片段和一個內(nèi)源性管家基因片段，通過數(shù)學(xué)公式計算相對量；這種方法的前提是靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率基本一致，所以在應(yīng)用過程中效率的偏移會對實際拷貝數(shù)估計產(chǎn)生一定影響（Wang等，2019）。

3 實時熒光定量PCR技術(shù)在生物飼料中的應(yīng)用

3.1 有害菌檢測 飼料在生產(chǎn)、儲藏、運(yùn)輸、銷售等一系列過程中存在受到微生物污染的可能性，檢測飼料中的致病菌至關(guān)重要。由沙門菌引起的食源性疾病居我國細(xì)菌性食源性疾病的首位，其既能引起多種動物感染，也常引起人類食物中毒等群體暴發(fā)性事件。阮靖華等 （2018）以沙門菌invA基因作為構(gòu)建質(zhì)粒的靶基因進(jìn)行絕對定量，該法對基因組DNA的檢測靈敏度達(dá)17 copies/μL，飼料樣品的檢出率與國標(biāo)法一致。楊美榮等（2015）也驗證了以DNA為基礎(chǔ)的沙門菌檢測方法的特異性，熒光定量PCR對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果均為陰性，可用于飼料中沙門菌的檢測。Yu等（2009）通過qPCR檢測生物飼料發(fā)酵過程中多種致病菌的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加益生菌發(fā)酵的固態(tài)飼料可以降低金黃色葡萄球菌、產(chǎn)毒大腸桿菌等致病菌的水平，且在整個發(fā)酵過程中都沒有檢測到沙門菌。此外，霉菌污染也是影響生物飼料適口性的重要因素，有研究表明，乳酸菌對產(chǎn)毒素霉菌的生長有抑制作用 （Dogi等，2015）。Nateghi等（2016）利用相對定量分析參與黃曲霉毒素生物合成調(diào)控的aflR基因，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌對aflR基因的表達(dá)有抑制作用，證明了乳酸菌可以抑制寄生曲霉的生長并降低黃曲霉素的產(chǎn)量。已有研究應(yīng)用qPCR對黃曲霉毒素水平與其決定基因表達(dá)量的相關(guān)性進(jìn)行檢測（Iheanacho等，2014），以期從基因水平預(yù)測飼料中黃曲霉毒素產(chǎn)量的潛在風(fēng)險。微生物檢測的傳統(tǒng)方法需要選擇性培養(yǎng)基、生物學(xué)特性及生化測定，其過程費(fèi)力耗時，實時熒光定量PCR技術(shù)重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確，為快速鑒別診斷飼料中致病菌提供了有效的方法。

3.2 發(fā)酵飼料益生菌定量 由于發(fā)酵飼料成分比較復(fù)雜，在我國尚沒有一個完善的發(fā)酵飼料品質(zhì)評定體系。當(dāng)前人們普遍認(rèn)為益生菌活菌含量是評定發(fā)酵飼料品質(zhì)的一項重要指標(biāo)。傳統(tǒng)檢測發(fā)酵飼料益生菌含量的標(biāo)準(zhǔn)方法是平板計數(shù)法。由于部分乳酸菌也可以在有氧情況下生長，因此在涉及乳酸菌的發(fā)酵過程中，平板法會大大高估總需氧菌的數(shù)量，基于平板計數(shù)的微生物定量所提供的飼料質(zhì)量信息是有限的 （Passoth等，2010），這些限制可以通過使用基于核酸序列比較與培養(yǎng)無關(guān)的分子技術(shù)來克服。Fibi等（2016）將qPCR分析方法用于鑒定肉雞飼料中動物雙歧桿菌，并通過抑制消減雜交技術(shù)獲得其特異性序列，設(shè)計引物并構(gòu)建相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，其最低檢測濃度為 2×101cfu/g。李婷婷（2019）通過 SYBR Green 染料動態(tài)檢測了秸稈飼料發(fā)酵過程中發(fā)酵微生物的變化，該方法方便了雙歧桿菌等厭氧細(xì)菌的檢測。魏愛彬（2012）通過qPCR技術(shù)研究單一菌種及復(fù)合菌種發(fā)酵全價飼料過程中的菌群變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同試驗組菌群變化趨勢存在差異，干酪乳桿菌、植物乳桿菌單一菌種發(fā)酵組在發(fā)酵3 d時達(dá)到最大值，后續(xù)發(fā)酵過程中菌量變化不明顯，發(fā)酵10 d時活菌數(shù)均達(dá)到8.00 lg cfu/g以上；而復(fù)合菌種發(fā)酵組中干酪乳桿菌在發(fā)酵4 d達(dá)到峰值后持續(xù)下降，發(fā)酵10 d時為6.58 lg cfu/g，植物乳桿菌發(fā)酵2 d時活菌數(shù)最高，達(dá)9.31 lg cfu/g，之后無顯著變化。種間競爭可能是導(dǎo)致飼料中微生物多樣性下降的一個因素，能夠適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境的微生物得以生存并形成優(yōu)勢（Yang等，2016）。同時在利用Ct值檢測飼料中微生物時，應(yīng)考慮處于VBNC狀態(tài)下的細(xì)胞和死菌DNA對檢測結(jié)果的影響。胡會龍等（2019）用EMA來消除死菌DNA擴(kuò)增對結(jié)果造成的誤差，將優(yōu)化后的EMA處理條件用于發(fā)酵飼料中乳酸菌的檢測，以乳酸菌16S rRNA為目標(biāo)基因構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測結(jié)果與平板計數(shù)具有較高的符合度。qPCR可以同時對多個樣品進(jìn)行檢測，縮短了檢測時間，在生產(chǎn)中應(yīng)用可以極大地減少工作量，提高檢測效率。目前只有少數(shù)研究報道利用qPCR技術(shù)監(jiān)測發(fā)酵飼料發(fā)酵過程中微生物群的動態(tài)變化，因此，需要進(jìn)一步研究qPCR技術(shù)定量檢測發(fā)酵飼料接種益生菌的穩(wěn)定性，結(jié)合pH與乳酸含量變化，為益生菌在生物飼料中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

3.3 飼喂效果檢測 隨著生物飼料研究的逐漸深入，生物飼料對提高飼料利用率、改善畜禽腸道健康、提高畜產(chǎn)品品質(zhì)等方面的作用需要進(jìn)一步明確（蔡輝益，2019）。研究發(fā)現(xiàn)，酵母發(fā)酵飼料具有提高飼料消化率、動物生長性能和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等生物學(xué)作用（Carlson等，2003）；張棋煒等（2017）通過qPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)酵母發(fā)酵飼料能夠顯著提高瘤胃細(xì)菌總數(shù)并促進(jìn)除牛鏈球菌以外的5種瘤胃功能細(xì)菌的生長繁殖。王夢芝等（2010）用熒光定量PCR技術(shù)研究了不同蛋白質(zhì)飼料對嗜淀粉瘤胃桿菌生長的影響，結(jié)果表明豆粕蛋白飼料更利于嗜淀粉瘤胃桿菌的生長，其密度及數(shù)量在細(xì)菌總數(shù)中的比例最高。幼畜體內(nèi)細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)的建立可能會影響其成年后腸道細(xì)菌的組成，從而影響消化效率，且幼畜初期的腸道微生物環(huán)境受母體消化菌群支配，優(yōu)化母體的腸道菌群是增加幼畜腸道有益微生物的數(shù)量及活性的一種策略，F(xiàn)aubladier等（2013）利用qPCR檢測小馬駒體內(nèi)纖維素降解菌的菌量變化，研究了產(chǎn)仔前后母馬補(bǔ)充發(fā)酵飼料產(chǎn)品的影響。孫艷等（2017）利用相對定量檢測白斑綜合癥病毒 （WSSV）刺激后，蝦血淋巴中酚氧化酶原（proPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）的基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)飼料中添加堅強(qiáng)芽孢桿菌活菌與溶藻弧菌可提高凡納濱對蝦抗WSSV感染的能力。因此，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測宿主腸道微生物和相關(guān)免疫基因表達(dá)量，可以有效檢測生物飼料的飼喂效用。傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的細(xì)菌學(xué)檢測方法昂貴又冗長，好多菌體外也不容易同步培養(yǎng)，且會低估腸道菌群的多樣性，以DNA為基礎(chǔ)的實時熒光定量PCR技術(shù)為腸道微生物的研究提供了便利。

3.4 轉(zhuǎn)基因成分檢測 識別飼料基質(zhì)中的作物是針對轉(zhuǎn)基因生物篩選的重要一步，大豆、玉米、油菜、大米、棉花、甜菜、土豆等是重要的轉(zhuǎn)基因材料來源。已有研究（Campos等，2018；Mbongolo等，2011）通過SYBR Green染料和TaqMan探針對動物飼料中的植物物種進(jìn)行特異性檢測，將此法與針對轉(zhuǎn)基因元素的qPCR方法相結(jié)合，可以有效確定飼料中的轉(zhuǎn)基因成分。花椰菜花葉病毒35S啟動子（p35S）和胭脂堿合成酶終止子（tNOS）是迄今為止在商業(yè)轉(zhuǎn)基因作物中最具代表性的通用重組元件。Barbau等（2010）采用SYBR Green熒光定量PCR技術(shù)檢測p35S和tNOS核心元件，這種方法特異性好、靈敏度高，并適用于檢測含有p35S或tNOS元素的低含量轉(zhuǎn)基因材料。有些生物飼料中使用的轉(zhuǎn)基因微生物攜帶抗生素耐藥性（AMR）基因，由于基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制可能導(dǎo)致病原體和腸道菌群通過攝入含有AMR基因的轉(zhuǎn)基因微生物或相關(guān)重組DNA而獲得AMR基因，因此通過qPCR檢測AMR基因的存在，以防止生物飼料中此類轉(zhuǎn)基因微生物DNA的意外污染（Fraiture等，2020）。生物飼料中轉(zhuǎn)基因成分的使用一直是公眾關(guān)注的焦點(diǎn)，qPCR技術(shù)可以對生物飼料中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行鑒定，并評估其對公眾健康和環(huán)境的潛在風(fēng)險。

4 實時熒光定量PCR在生物飼料中應(yīng)用的注意事項

4.1 DNA提取 有效提取高質(zhì)量DNA的方法是應(yīng)用qPCR技術(shù)研究生物飼料的前提。DNA提取方法的選擇對qPCR檢測微生物數(shù)量有顯著影響，DNA提取效率在細(xì)菌、真菌和原生動物群落之間存在差異，會導(dǎo)致這些種群被高估或低估，使用不同DNA提取方法獲得的qPCR結(jié)果不一定具有可比性（Henderson等，2013）。由于生物飼料組分復(fù)雜，傳統(tǒng)的提取純培養(yǎng)微生物DNA的方法并不能完全適用，并且可能遺漏劣勢微生物群體；發(fā)酵產(chǎn)物中所含的蛋白質(zhì)和脂肪，會對其DNA提取效率產(chǎn)生一定影響，進(jìn)而影響實驗結(jié)果，如雙歧桿菌、乳酸菌等革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)通常需要特殊處理才能分解；在檢測含有芽孢桿菌的樣品時，由于從芽孢中直接提取DNA較為困難，可能需要額外的萌發(fā)步驟，因此選擇合適的提取方法尤為重要。沈麗等（2012）采用磁珠法，加入裂解緩沖液和蛋白酶K，提取植物源性飼料中的核酸，并通過qPCR鑒定動物源性成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磁珠核酸提取法的實驗效果優(yōu)于商品化核酸提取試劑盒。蛋白酶K處理法對酶的質(zhì)量有很大的依賴性，應(yīng)該避免蛋白酶K的長期儲存對細(xì)胞裂解造成的影響。馬俊孝等（2009）通過間接法提取青貯飼料中微生物總DNA，將樣品用PBS緩沖液洗滌后收集菌體沉淀，通過溶菌酶、CTAB等試劑裂解細(xì)胞，并用異丙醇沉淀DNA，提取的DNA可直接用于下游分子實驗。溶菌酶可以高效分解革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，與EDTA聯(lián)合使用時，對細(xì)菌細(xì)胞的破壞作用尤為顯著（Abdulamir等，2010）。溶菌酶、RNase以及商業(yè)試劑盒中額外的蛋白質(zhì)沉淀步驟，可以有效去除生物飼料中的PCR抑制物，提高DNA純度，避免qPCR擴(kuò)增反應(yīng)失敗和假陰性結(jié)果。直接對生物飼料中微生物總DNA進(jìn)行分析，避免了預(yù)增菌、純化培養(yǎng)等步驟，在一定程度上克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)法的弊端，且可以用來探究樣品中微生物的多樣性和動態(tài)變化情況。

4.2 靶序列選擇 菌種對于生物飼料來說至關(guān)重要，是生物飼料的核心。生產(chǎn)過程中，常出現(xiàn)菌株來源不明、不純和菌種退化等現(xiàn)象，因此我們首先要保證菌種的安全性，確保菌種及其產(chǎn)物對動物、人體及環(huán)境無害。實時熒光定量PCR技術(shù)通過測定目標(biāo)基因數(shù)量來定量微生物種群，因此靶序列的選擇尤為重要。以乳桿菌屬為例，16S rRNA序列同源性分析已作為細(xì)菌分類鑒定的有力佐證，但是乳桿菌屬分類復(fù)雜，16S rRNA基因序列同源性高，無法建立特異性高的引物和探針；如副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌親緣關(guān)系較近，以groL、tuf和16S rRNA為目標(biāo)基因設(shè)計的特異性引物會進(jìn)行交叉擴(kuò)增（Achilleos等，2013）。此外，由于16S rRNA基因可以在多個拷貝中存在，且在不同物種中16S rRNA基因拷貝存在差異，因此qPCR法計數(shù)的細(xì)菌群體中16S rRNA的拷貝數(shù)大多高于常規(guī)培養(yǎng)定量的數(shù)量（cfu）（Chaloemnon 等，2016）， 這導(dǎo)致樣本中目標(biāo)菌數(shù)量被高估，定量結(jié)果存在一定誤差。研究表明 ，gyrB、recA、rpoD、hsp60 等 基 因 序 列 較 16S rRNA序列，可以更好地區(qū)分相似種，因此更適合用作引物設(shè)計的靶基因（楊小紅等，2014）。陳臣等（2013）利用SMM系統(tǒng)篩選植物乳桿菌特異性序列，選擇CAAX家族蛋白酶基因設(shè)計特異性引物進(jìn)行qPCR檢測，該引物對其他近源菌株均無相應(yīng)擴(kuò)增。同時有研究應(yīng)用抑制消減雜交（SSH）鑒定基因組DNA片段，進(jìn)行特異性引物的開發(fā)（Sattler等，2014）。除此之外，有些生物飼料涉及高溫處理會導(dǎo)致DNA片段化，當(dāng)擴(kuò)增200 bp以上的目標(biāo)序列時，很難獲得可靠的結(jié)果，因此在DNA嚴(yán)重降解的飼料樣品中，物種鑒定必須依賴于短DNA靶基因的擴(kuò)增。隨著許多物種全基因組測序的完成，可以通過生物信息學(xué)技術(shù)建立新的方法，從全基因組水平比較篩選出種內(nèi)保守的物種特異性DNA序列作為靶基因，提高實驗的準(zhǔn)確性。

4.3 死菌和活菌的區(qū)分 生物飼料中活的益生菌才能在動物胃腸道中發(fā)揮其益生作用，由于實時熒光定量PCR不能區(qū)別活菌與死菌，因此有效的前處理步驟至關(guān)重要。EMA是一種核酸交聯(lián)試劑，能夠選擇性地穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，在強(qiáng)光照射下與基因組DNA共價交聯(lián)，使DNA形成沉淀，從而降低了DNA模板的可擴(kuò)增性。盡管EMA可以有效減少來自死細(xì)胞的PCR信號，但它可以部分進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞，誘導(dǎo)其基因組DNA的降解（Nam等，2011）。研究表明，可以用PMA替代EMA處理活細(xì)胞，PMA比EMA的電荷更多，使得PMA更難穿透完整的細(xì)胞膜，對活細(xì)胞的選擇性更高且細(xì)胞毒性低，可以彌補(bǔ)EMA的不足，得到較好的檢測效果（Yán～ez等，2011）。 將EMA或PMA與qPCR技術(shù)相結(jié)合，排除樣本中死菌信號對實驗結(jié)果的干擾，一定程度上克服了qPCR的不足之處，有利于生物飼料發(fā)酵微生物菌群變化的研究。

4.4 其他 實時熒光定量PCR在生物飼料的應(yīng)用中，面臨的一個常見問題是存在不可預(yù)測的擴(kuò)增產(chǎn)物，如引物二聚體，在特異性靶基因較少的樣品中最為明顯，好的引物可以擴(kuò)增單一的產(chǎn)物，其區(qū)別在于產(chǎn)生單一的熔解曲線峰，而不是產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，這對實時熒光定量PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要意義（Martín 等，2008）。 實時熒光定量PCR技術(shù)除了受樣品DNA產(chǎn)量的影響外，還與樣本中存在的細(xì)胞總數(shù)有關(guān)，例如在檢測生物飼料中的動物蛋白源時，其結(jié)果可能根據(jù)組織類型的不同而變化。生物飼料是不同物種材料組成的混合物，檢測時必須考慮交叉反應(yīng)性以及所分析的樣本類型，不同的樣本類型具有不同的化學(xué)和結(jié)構(gòu)組成，可以通過不同的機(jī)制抑制PCR反應(yīng)，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線在應(yīng)用于不同的基質(zhì)時是不準(zhǔn)確的（Cocolin等，2011）。此外，發(fā)酵飼料中的微生物可能分布不均勻，如沙門氏菌被認(rèn)為是傳播不均勻的，即在飼料材料中聚集分布，通常情況下只有一小部分樣品被檢測出沙門氏菌陽性（Schelin等，2014），因此取樣需要有代表性，要以合理的精度測量飼料中的微生物含量。

5 展望

生物飼料發(fā)酵過程中的菌群變化是影響飼料品質(zhì)的重要因素之一，在以往生物飼料的研究中，多利用PCR-DGGE技術(shù)檢測生物飼料發(fā)酵過程中微生物多樣性的變化，分析群落中的優(yōu)勢種類（許愛清等，2010）。但生物發(fā)酵飼料的品質(zhì)不僅取決于發(fā)酵微生物的存在，而主要取決于其數(shù)量，特別是發(fā)酵微生物初期，應(yīng)以更可控、可預(yù)測的方式給產(chǎn)品提供特定的物質(zhì)。實時熒光定量PCR具有定量、特異、靈敏快速、自動化程度高等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、腸道菌群、釀造等領(lǐng)域的菌群變化檢測分析，將其用于生物飼料發(fā)酵菌群變化的探究應(yīng)得到重視，為生物飼料提供重要的檢測工具。

然而實時熒光定量PCR也存在不足之處，使用單一靶基因進(jìn)行qPCR檢測的一個普遍限制是可能產(chǎn)生潛在的假陽性或陰性，因此建議使用多重?zé)晒舛縋CR，把多個遺傳標(biāo)記作為靶基因，使?jié)撛诘募訇栃曰蚣訇幮越Y(jié)果最小化 （Yong等，2013）。在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中，定量標(biāo)準(zhǔn)物可以是cDNA、質(zhì)粒DNA等，各個實驗室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品各不相同；此外，由于PCR檢測中的波動，不同PCR檢測的Ct值無法直接比較。在相對定量中，其前提是假設(shè)內(nèi)源控制物表達(dá)水平不受外界實驗條件影響，選擇合適的內(nèi)源控制物也是實驗結(jié)果可靠與否的關(guān)鍵。發(fā)酵菌株的規(guī)范化仍是生物飼料的研究核心，同一菌種的不同菌株其功能特性各異，需要進(jìn)一步的研究來確定靶基因和qPCR檢測方法，使其測定結(jié)果特異、定量準(zhǔn)確。除了需要設(shè)計專門針對目標(biāo)物種或菌株的引物外，qPCR還受DNA質(zhì)量和產(chǎn)量的影響，基質(zhì)中背景DNA的存在可能導(dǎo)致Ct值過高；微生物水平較低時，雖然富集步驟可以提高PCR檢測效率，但會增加微生物的數(shù)量，造成計數(shù)的不準(zhǔn)確（Ehrs等，2011）。為了比較不同的研究，飼料DNA提取和PCR擴(kuò)增方法應(yīng)該進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化。若克服這些不足之處，實時熒光定量PCR技術(shù)在生物飼料領(lǐng)域?qū)懈訌V闊的應(yīng)用前景。