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    SETDB1在炎癥性腸病患者腸黏膜組織中的表達及臨床意義

    2021-12-02 21:29:49王慧玲趙靜李剛
    分子診斷與治療雜志 2021年8期
    關(guān)鍵詞:屏障活動度引物

    王慧玲 趙靜 李剛

    炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD),主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)及潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC),是一種消化道的非特異性炎性病變,該病好發(fā)于15~30 歲的青壯年,病情遷延反復(fù)、難以治愈,致殘率高[1-2],嚴重影響了患者的生活質(zhì)量,給患者家庭乃至社會帶來極大的經(jīng)濟負擔(dān),已成為當(dāng)今國際消化學(xué)界的研究熱點和難點之一[3]。本研究前期研究顯示:腸黏膜屏障功能障礙可能是IBD 發(fā)病機制中的重要因素之一[4-5]。最近有研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶1(SET domain bifurcated1,SETDBl)的缺失與腸道上皮細胞分化,屏障破壞,炎癥和死亡有關(guān),SETDB1 的缺失會導(dǎo)致內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒沉默,DNA 損傷和腸上皮細胞死亡[6]。另有動物實驗證明,腸道干細胞中SETDB1 的丟失解除了對內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的抑制作用,不可逆轉(zhuǎn)地破壞了上皮屏障的穩(wěn)態(tài),SETDB1 降低的小鼠可引起自發(fā)性終末回腸炎和結(jié)腸炎[7]。上述研究共同表明:SETDB1 可能在腸道上皮穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。但SETDB1 在IBD 患者中的具體表達及其與IBD 患者疾病活動度的關(guān)系,目前尚未見報道。本研究通過檢測SETDBl 的mRNA 及蛋白在IBD 患者腸黏膜組織中的表達情況,分析其與IBD患者疾病活動度的相關(guān)性,為IBD 的診療及IBD發(fā)病機制的研究提供新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 IBD 患者標本的收集

    收集河南省人民醫(yī)院2016年9月至2020年9月期間收治的門診及住院病例,分UC 組、CD 組和對照組(各50 例),并收集患者的相關(guān)炎癥指標。從IBD 病變活動部位取材,以健康體檢者的腸鏡活檢組織或單純結(jié)腸腺瘤患者肉眼和組織學(xué)表現(xiàn)均正常的結(jié)腸區(qū)域標本為對照,非炎癥部位腸黏膜(對照和IBD 患者)和炎癥部位腸黏膜(IBD 患者)各取4 塊組織;分別用于RNA,蛋白質(zhì)提取及石蠟包塊。本研究參與的患者均知情同意并簽署知情同意書,本實驗已通過院倫理委員會的審批。CD 和UC 的診斷參考之前的標準。CD 和UC疾病活動度分別以CD 活動指數(shù)CDAI 評分及UC活動指數(shù)Mayo 評分作為參考[8]。納入標準:①炎性腸病的診斷標準參考《炎性腸病診斷與治療的共識意見(2012年廣州)》中的標準[9];②經(jīng)腸道鏡檢查、病理學(xué)活檢證實;排除標準:①惡性腫瘤;②腸道梗阻、穿孔;③嚴重出血、凝血功能障礙;④自身免疫性疾病;⑤其他腸道疾病。

    1.2 主要試劑及儀器

    RNA 提取試劑盒(DP440,天根生化,北京);SETDB1 抗體(CST,美國),qRT-PCR 儀(ABI7500,美國)。 SETDB1 及內(nèi)參引物均由上海生工生物公司合成;SETDB1上游引物:5′-TCCTGTGAAGCCTGAAGGAC-3′,下游引物:5′-TTAGTTGATGGCAGGCACAC-3′;內(nèi) 參GAPDH 上游引物:5′-AAAATCAAGTGGGGCGATGC-3′,下游引物:5′-GATGACCCTTTTGGCTCCCC-3′。

    1.3 Q-PCR 檢測

    按照試劑盒說明書提取總的RNA,并檢測其濃度和純度,RNA 純度A260/A280在1.8~2.1 之間視為合格。逆轉(zhuǎn)錄條件:50℃,30 min;94℃,2 min;循環(huán)次數(shù)1;RT-PCR 反應(yīng):94℃,15 s;60℃,30 s;68℃,3 min;循環(huán)次數(shù)40。每個樣本重復(fù)3 個副孔。采用2-ΔΔCt法 計算SETDBI 的相對表達量。DAB 顯色;蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水;二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。Image-Pro Plus 6 軟件分析每張照片中腸上皮細胞SETDBl 的平均光密度值,取5 張照片的平均值作為該病例腸上皮細胞中SETDB1 的平均光密度值。

    1.4 Western Blotting

    提取組織總蛋白和蛋白濃度的測定。按照BCA 蛋白測定試劑盒說明進行濃度檢測,分裝后保存于-80℃冰箱備用。按照所測蛋白濃度,計算含20 μg 蛋白的體積即為上樣量,100℃加熱3~5 min 后,煮完后即可上樣;80 V 等壓電泳30 min 后轉(zhuǎn)為120 V 繼續(xù)電泳1~2 h 至溴酚蘭到達分離膠的底部;電泳結(jié)束后,小心取出膠放入電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡20 min;TBST 洗3 次×5 min;加入二抗(1∶1 000 緩沖封閉液稀釋),搖床上室溫振蕩孵育1.5 h;TBST 洗3 次×5 min;化學(xué)發(fā)光、顯影。結(jié)果分析:膠片用EPSON 掃描儀掃描,F(xiàn)luorchemTM 8900 圖像分析軟件定量分析靶蛋白及內(nèi)參照GAPDH 條帶的含量,求其比值進行統(tǒng)計分析。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

    SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析;計量資料以()表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗;用非參數(shù)相關(guān)的Spearman 秩相關(guān)系數(shù)(r)評估兩個變量之間的相關(guān)性;P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 SETDB1 的mRNA 及蛋白的表達結(jié)果

    SETDB1的mRNA 在CD 及UC 患者腸黏膜組織標本中的相對表達量分別為:(2.54±1.33)、(2.88±1.25),均低于正常對照組(3.74±1.88),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);SETDB1 的蛋白在CD 及UC 患者腸黏膜組織標本中的相對表達量分別為:(0.37±0.03)、(0.37±0.05),均低于正常對照組(0.69±0.08),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

    2.2 SETDB1 的免疫組化表達結(jié)果

    SETDBI 在CD 及UC 患者腸黏膜組織標本中的相對表達量的IOD 評分分別為:(18±5.1)×103、(37.7±12.5)×103,均明顯低于正常對照組(85.8±11.2)×103,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

    2.3 SETDB1 的表達與IBD 患者疾病活動度的相關(guān)性分析

    CD 及UC 患者腸黏膜組織中SETDB1 的表達與其疾病活動度評估指標CDAI 及Mayo 評分具有一定的相關(guān)性。見圖3。

    3 討論

    IBD 是一種腸道慢性炎癥性疾病,其發(fā)病機制尚不清楚。多數(shù)研究認為,其發(fā)病原因與腸道自身免疫系統(tǒng)、感染因素、環(huán)境因素、遺傳因素等均有一定的相關(guān)性[10-11]。其中,免疫失衡及腸道黏膜屏障功能障礙是IBD 發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。因此,維持機體的免疫平衡[12]及腸道黏膜的屏障功能完整[13]是IBD 治療的關(guān)鍵所在。流行病學(xué)研究顯示:IBD 的發(fā)病率在西方國家逐漸趨于穩(wěn)定,但是在發(fā)展中國家仍呈逐年增高的趨勢[14],已成為消化專業(yè)研究的熱點和難點之一[15]。因此,進一步闡明研究IBD 發(fā)病相關(guān)機制,是一項十分重要且亟待解決的任務(wù),具有重要的臨床價值及意義。

    SETDB1,也稱為ESET 或KMT1E,是一種含有SET 結(jié)構(gòu)域的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT),屬于Suvar3-9 家族,可以通過三甲基化H3K9 調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程。SETDBl 蛋白早期發(fā)現(xiàn)是Huntington 病治療的靶點[16]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),SETDBl 蛋白的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在著十分密切的關(guān)系。胰腺導(dǎo)管腺癌中,SETDB1 通過調(diào)節(jié)p53 的表達來抑制細胞凋亡[17];SETDB1 可通過驅(qū)動結(jié)直腸癌細胞從G0/G1 期進入S 期從而促進癌細胞的增殖[18];在非小細胞癌中,超氧化物歧化酶1(SOD1)通過miR-409-3p/SOD1/SETDB1 表觀遺傳調(diào)控前饋環(huán)促進癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[19]。SETDB1 在IBD 發(fā)病中的作用目前研究較少,僅有個別研究顯示:小鼠腸道上皮細胞SETDB1 的缺失與腸道上皮細胞分化,屏障破壞,炎癥和死亡有關(guān),SETDB1 在維持腸上皮屏障穩(wěn)態(tài)中可能發(fā)揮著重要作用[6]。

    本研究提示SETDB1 可能在IBD 的發(fā)病中扮演著重要角色,為IBD 發(fā)病機制的相關(guān)研究提供了新的方向和靶點。但SETDB1 在IBD 發(fā)病中的具體作用機制尚需進一步的研究。中山大學(xué)附屬郭建平教授團隊研究發(fā)現(xiàn)SETDB1 介導(dǎo)的AKT 的甲基化與PI3K 介導(dǎo)的AKT 的磷酸化相互作用,SETDB1 與PI3K協(xié)同調(diào)控AKT的活化[20]。mTORC1 是PI3K/AKT 信號通路下游的主要靶基因,且mTOR 抑制劑他克莫司在UC 誘導(dǎo)緩解和維持治療方面均具有顯著的治療效果[21]。上述研究提示,SETDB1 可能通過PI3K/AKT-mTOR 通路在IBD 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,但具體作用機制仍需進一步探究。

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