細(xì)菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的研究進(jìn)展*

于雪蕎 沈瀚 曹小利

細(xì)菌通過(guò)分泌通路實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)跨胞漿膜轉(zhuǎn)運(yùn)的系統(tǒng)，稱為分泌系統(tǒng)[1]。細(xì)菌的分泌系統(tǒng)是蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一個(gè)組成部分，分泌系統(tǒng)的蛋白質(zhì)或類蛋白毒力因子與細(xì)菌存活、繁殖等密切相關(guān)[1]。目前發(fā)現(xiàn)的分泌系統(tǒng)有Ⅰ～Ⅶ型分泌系統(tǒng)（見表1）。其中，Ⅰ型分泌系統(tǒng)是將細(xì)菌的分泌性蛋白由不同蛋白亞單位組成跨膜通道直接從胞漿送至胞外，只進(jìn)行一步分泌，大腸埃希菌溶血素分泌系統(tǒng)屬于此型[2]；Ⅱ型分泌系統(tǒng)主要分泌某些細(xì)菌外毒素和水解酶，先將前效應(yīng)蛋白透過(guò)內(nèi)膜送至周漿間隙，經(jīng)過(guò)加工后再穿過(guò)外膜分泌到細(xì)胞外，Ⅳ型分泌系統(tǒng)是在此基礎(chǔ)上進(jìn)化而來(lái)[3]；Ⅲ型分泌系統(tǒng)與Ⅰ型分泌系統(tǒng)相似，但Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分泌機(jī)制要比Ⅰ型分泌系統(tǒng)復(fù)雜很多；Ⅳ型分泌系統(tǒng)和其余幾種分泌系統(tǒng)大不相同，廣泛存在于革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌中，還在無(wú)細(xì)胞壁細(xì)菌和一些古細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，且Ⅳ型分泌系統(tǒng)可分泌的物質(zhì)范圍很廣，包括單個(gè)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物和DNA，其有致病島編碼的針形結(jié)構(gòu)，類似菌毛[4]；Ⅴ型分泌系統(tǒng)是最簡(jiǎn)單且不需要ATP的分泌系統(tǒng)，由IcmF和DotU組成[5]；Ⅶ型分泌系統(tǒng)主要存在于大部分放線菌和革蘭陽(yáng)性菌中[6]。本文主要介紹的是Ⅳ型分泌系統(tǒng)。

1 Ⅳ型分泌系統(tǒng)的作用及分布 Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS）是一種在革蘭陰性菌和陽(yáng)性菌中均廣泛存在的多功能、多組分的跨膜通道結(jié)構(gòu)。該系統(tǒng)既能通過(guò)蛋白質(zhì)又能通過(guò)DNA，因此能夠介導(dǎo)細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移、DNA釋放和攝取以及效應(yīng)蛋白分泌等功能[12]。其中，T4SS所介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移是基因水平轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，多數(shù)接合型質(zhì)粒和整合性接合元件都依靠它們自身編碼的T4SS進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，進(jìn)而散播它們所攜帶的生物學(xué)性狀，如耐藥性和致病性等。目前已知T4SS在大腸埃希菌、傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、軍團(tuán)菌、奈瑟菌、霍亂弧菌等革蘭陰性桿菌中的作用已被證實(shí)，不僅參與細(xì)菌的黏附過(guò)程，而且在細(xì)菌的免疫逃逸、表面運(yùn)動(dòng)、微克隆形成、轉(zhuǎn)化和抗菌轉(zhuǎn)換、介導(dǎo)與真核細(xì)胞的信號(hào)聯(lián)系、凋亡和補(bǔ)體抑制等方面起作用[7，13，14]。

2 Ⅳ型分泌系統(tǒng)的分類 首先，T4SS是以質(zhì)粒F、質(zhì)粒RP4和質(zhì)粒R64為基礎(chǔ)，故而分為F、P、I三類[15]。再者，根據(jù)其功能，T4SS可分為三類，第一類為接合，是指通過(guò)細(xì)胞間的接觸將DNA在一些G-和G+或者一些古細(xì)菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌毒力因子的結(jié)合及抗生素抗性的轉(zhuǎn)移；第二類為DNA的攝取、轉(zhuǎn)化和釋放功能，如幽門螺旋桿菌的ComB系統(tǒng)以及淋球菌的GGI遺傳島，不同的是前者作用為DNA的攝取，而后者作用為DNA的釋放；第三類為蛋白質(zhì)復(fù)合物等大分子的轉(zhuǎn)移功能，這一類主要存在于致病菌，在細(xì)菌毒力中有舉足輕重的作用[16]。其次，根據(jù)同源性，T4SS分為兩類：IVA和IVB，IVA是T4AA中典型的VirB/D4系統(tǒng)，IVB主要是嗜肺軍團(tuán)菌的Icm/Dot。

3 Ⅳ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu) T4SS的典型結(jié)構(gòu)是VirB/D4系統(tǒng)，按蛋白所在的位置分為三部分：內(nèi)膜內(nèi)，內(nèi)外膜之間即肽聚糖和外周質(zhì)間隙中，以及外膜外。VirB/D4系統(tǒng)中起作用的是VirB操縱子和VirD4操縱子。VirD包括VirD1～VirD5五種，其中，VirD1和VirD2主要作用于T-DNA,對(duì)DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)移和復(fù)制；VirD3和VirD5針對(duì)于非必須處理的蛋白，通過(guò)VirD4使其轉(zhuǎn)化為連接蛋白CP；VirD4是同源多聚體整體膜復(fù)合物，主要作用是跨膜轉(zhuǎn)移底物，VirD4和VirB具有協(xié)同作用[4，17]。VirB直接介導(dǎo)組裝菌毛[17]，有VirB1～VirB11十一種，主要作用是產(chǎn)生成熟促進(jìn)因子（Maturation-Promoting Factor，MPF）,與VirD4發(fā)揮協(xié)同作用；其中，VirB1還可以與亞菌毛單位發(fā)生相互作用，從而促進(jìn)菌毛形成；VirB2、VirB5和VirB7的主要功能是實(shí)行T菌毛的組裝，介導(dǎo)外界物質(zhì)交換，VirB2是主要菌毛成分，在物質(zhì)交換中發(fā)揮主要作用，VirB5是次要菌毛成分，主要功能是“收集”需要交換的物質(zhì)[18]；VirB4和VirB11是VirB/D4系統(tǒng)能量的主要合成成分；VirB6主要起翻譯功能，相關(guān)研究表明VirB6對(duì)VirB5和VirB3的穩(wěn)定起調(diào)節(jié)作用[19]；VirB10是T4SS跨膜結(jié)構(gòu)的支架，與VirB7、VirB8和VirB9形成復(fù)合通道，連接內(nèi)膜內(nèi)環(huán)境與外膜外環(huán)境，是該T4SS的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；其中，VirB7和VirB9形成以二硫鍵鏈接的異二聚體，與VirB6相互作用，形成內(nèi)膜和外膜之間的通道；VirB10則是與CP蛋白的N段末端相互作用而發(fā)揮功能；相關(guān)報(bào)道提出，VirB8、VirB9和VirB10會(huì)在細(xì)胞周圍形成病灶[20]，因此對(duì)VirB蛋白的致病機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。有研究表示，VirB10僅存在于G-細(xì)菌內(nèi)，在G+細(xì)菌和古細(xì)菌中尚未發(fā)現(xiàn)[21]；VirB1和VirB11共同作用產(chǎn)生的蛋白MPF形成通道，在G-菌中借助菌毛附著于靶細(xì)胞表面[22]，而在G+菌中是以表面黏附素附著于靶細(xì)胞表面[23]。

4 Ⅳ型分泌系統(tǒng)的影響 T4SS介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)水平轉(zhuǎn)移，是細(xì)菌譜系之間橫向聯(lián)系所必須的，不僅有助于細(xì)菌進(jìn)化，也有利于耐藥和毒力基因在細(xì)菌之間播散，導(dǎo)致耐藥菌的快速發(fā)展，甚至引起院內(nèi)感染暴發(fā)流行[20]；此外，細(xì)菌能夠利用T4SS分泌大分子蛋白質(zhì)效應(yīng)物或蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物促進(jìn)它們?cè)谡婧怂拗鲀?nèi)的繁殖和存活，為細(xì)菌生存提供有利環(huán)境，為發(fā)生感染提供條件；T4SS也會(huì)編碼/合成一些酶，如松弛酶和引發(fā)酶，引起DNA和蛋白質(zhì)的吸收、融入及對(duì)外釋放，導(dǎo)致感染的持續(xù)發(fā)展[4]；此外，T4SS也是多種細(xì)菌的重要毒力因子，導(dǎo)致的典型感染包括百日咳桿菌引起的百日咳，布魯菌引起的布魯菌病，嗜肺軍團(tuán)菌引起的軍團(tuán)菌肺炎，貝氏柯克斯體引起的Q熱，幽門螺旋桿菌引起的消化性潰瘍和胃癌[10，15-22]。

5 Ⅳ型分泌系統(tǒng)在細(xì)菌中的應(yīng)用 總而言之，T4SS是一個(gè)蛋白質(zhì)和DNA轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，具體可分為接合、DNA的攝取釋放、效應(yīng)器的轉(zhuǎn)移以及其它特殊功能，對(duì)細(xì)菌的毒力、耐藥性、環(huán)境適應(yīng)性等起舉足輕重的作用。然而，在不同的細(xì)菌中，T4SS也會(huì)有所不同（見表2）。

5.1 布魯菌：T4SS是布魯菌重要的毒力因子之一，對(duì)布魯菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存、繁殖起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，該菌的T4SS由12個(gè)VirB蛋白組成，其中，VirB1、VirB7和VirB12起增強(qiáng)作用[28]；VirB2和VirB5是T4SS的最外層蛋白，負(fù)責(zé)降解肽聚糖，穿透宿主細(xì)胞壁，使其進(jìn)入到宿主細(xì)胞內(nèi)；VirB6是內(nèi)膜蛋白，主要起組裝和穩(wěn)定作用；VirB8、VirB9和VirB10相互聯(lián)系，是T4SS的主要功能蛋白；而VirB12是一種免疫原性蛋白[12，28]。此外，大約有25%缺失VirB基因的菌株毒力變?nèi)?，可見其?duì)細(xì)菌的致病性也有所影響[29]。

5.2 幽門螺旋桿菌：在幽門螺旋桿菌中，T4SS由Cag致病島編碼，至少由17個(gè)蛋白組成，結(jié)構(gòu)機(jī)制與VirB系統(tǒng)相似[30]。在Cag致病島中，CagA起核心作用，CagI、CagL和CagY對(duì)CagA起輔助呈遞作用，將所需傳遞的底物等跨宿主細(xì)胞膜傳遞給CagA，由其來(lái)完成注射過(guò)程；CagA也是幽門螺旋桿菌的細(xì)胞毒素相關(guān)基因，其CagA蛋白PAI是經(jīng)典的毒力因子之一[26]。此外，在該菌中還有一種ComB型T4SS系統(tǒng)，主要是特異性吸收DNA并將其跨外膜運(yùn)輸，將其呈遞給ComEC系統(tǒng)，從而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。這種機(jī)制可以使細(xì)菌快速獲得耐藥性并適應(yīng)所處環(huán)境，對(duì)細(xì)菌的生存起重要作用[31]。

5.3 淋病奈瑟菌：在淋病奈瑟菌中，T4SS是GGI遺傳毒力島，存在于大多數(shù)淋病奈瑟菌中，主要功能是DNA轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，大多數(shù)G-細(xì)菌對(duì)DNA的吸收依靠的是Ⅳ型菌毛（Tfp）。研究表示，當(dāng)供體和受體一起培養(yǎng)時(shí)，供體細(xì)菌會(huì)發(fā)生自溶為受體細(xì)菌提供DNA，自溶的程度可能與AtlA的存在有關(guān)[32]；Tra-F是DNA釋放系統(tǒng)，ComP可增強(qiáng)ComP和PilT的表達(dá)，從而增強(qiáng)Tfp對(duì)DNA的吸收以提高DNA的轉(zhuǎn)化率[27]。

5.4 嗜肺軍團(tuán)菌：嗜肺軍團(tuán)菌是G-胞內(nèi)致病菌，T4SS的毒力島基因座是Dot/Icm系統(tǒng)，至少由DotC、DotD、DotF、DotG和DotH五種蛋白組成，其中DotF和DotG是內(nèi)膜蛋白，DotC、DotD和DotH為外膜蛋白，DotF蛋白依靠DotC和DotD蛋白依附在內(nèi)膜上，以構(gòu)成完整的T4SS，并分泌效應(yīng)分子從而引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[33]。

5.5 鮑曼不動(dòng)桿菌：CsuA/BABCDE基因簇是鮑曼不動(dòng)桿菌的T4SS，主要調(diào)控菌毛的合成組裝，其中，CsuE編碼菌毛亞單位,CsuC組裝菌毛，CsuC表達(dá)分子伴侶引導(dǎo)合成系統(tǒng)，伴侶蛋白具有結(jié)合和穩(wěn)定菌毛亞單位和防止菌毛亞單位水解的功能，而引導(dǎo)蛋白則可以在細(xì)菌外膜形成孔道，與伴侶蛋白共同作用組裝和分泌菌毛，這是鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成的重要環(huán)節(jié)[34]。

5.6 巴爾通體：巴爾通體是一種G-桿狀苛氧寄生菌，不僅會(huì)引發(fā)奧羅亞熱，還會(huì)引發(fā)秘魯疣，其主要致病機(jī)制是通過(guò)T4SS基因編碼Trw，特異性黏附人紅細(xì)胞，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞內(nèi)菌血癥，中后期導(dǎo)致人紅細(xì)胞溶解，發(fā)展為非常嚴(yán)重的溶血性貧血[35]。

5.7 流感嗜血桿菌：該菌中的GI亞型ICEHin1056是一種新型的T4SS，無(wú)菌毛，但是基因島EHin1056發(fā)生突變的菌株Rd11會(huì)有纖長(zhǎng)的菌毛，表明T4SS對(duì)菌毛形成有重要影響[35]。

5.8 革蘭陽(yáng)性菌：有研究表明，G+細(xì)菌中的T4SS有完全不同的共軛轉(zhuǎn)移模式，例如在G+放線菌中，T4SS將整合性移動(dòng)元件和質(zhì)粒的復(fù)合物作為DNA轉(zhuǎn)移的中間產(chǎn)物由供體轉(zhuǎn)移給受體[23]。

6 小結(jié) T4SS是目前研究發(fā)展最快的分泌系統(tǒng)之一，除了傳遞DNA外，與其他分泌系統(tǒng)最大的區(qū)別就是通過(guò)直接接觸的方式運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)及核糖核蛋白復(fù)合物等大分子物質(zhì)；同時(shí)，它還擁有具備ATP功能的一套完整體系，不僅傳遞抗性基因引發(fā)細(xì)菌的耐藥性，還會(huì)傳遞毒力因子，與細(xì)菌的致病性大有關(guān)聯(lián)。因此，對(duì)于T4SS的深入研究，不僅為針對(duì)多重耐藥菌感染的靶向藥物開發(fā)提供理論依據(jù)，同時(shí)，還為通過(guò)T4SS降低細(xì)菌毒力、增強(qiáng)細(xì)菌自溶等途徑，從根源切斷細(xì)菌的播散和流行提供思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突