循環(huán)腫瘤細(xì)胞在胰腺癌診療中的應(yīng)用

程浩，仇毓東

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一種預(yù)后極差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示：PC的死亡病例數(shù)與新發(fā)病例數(shù)相當(dāng)［1］。2021年最新數(shù)據(jù)顯示，其5年生存率僅為10%［2，3］。但一組來自日本的研究數(shù)據(jù)顯示，小于2 cm的Ia期PC預(yù)后良好，5年生存率可達(dá)到68.7%，原位癌的5年生存率更是高達(dá)85.8%［4］。因此，提高早期診斷率對于改善PC不良預(yù)后至關(guān)重要［5］。另一方面，即使接受了根治性切除，許多PC患者仍然死于術(shù)后早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，可能的原因是術(shù)前評估沒有辦法確定是否已經(jīng)存在微轉(zhuǎn)移病灶［6］。當(dāng)前，PC的術(shù)前可切除性主要根據(jù)影像學(xué)，迫切需要研發(fā)真正的生物學(xué)指標(biāo)［7］。近年來，以化療為主的系統(tǒng)治療、輔助治療以及新輔助治療水平的進(jìn)步在改善PC預(yù)后中發(fā)揮了重要的作用［8-10］。但目前仍缺乏合適的生物標(biāo)志物來評估療效，指導(dǎo)方案的優(yōu)化。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）作為從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入血循環(huán)的少量腫瘤細(xì)胞，在包括PC在內(nèi)的多種腫瘤的早期診斷、預(yù)后評估、療效監(jiān)測等方面受到了廣泛的關(guān)注［11］。本文擬對CTCs在PC精準(zhǔn)診療中的作用及意義，做一個系統(tǒng)綜述和評價。

1 CTCs與PC的早期診斷

PC起病隱匿，早期診斷十分困難［12］。影像學(xué)和血清標(biāo)志物是臨床上最常用的診斷工具［13］。當(dāng)前，PC的早期診斷尚缺乏有效的生物標(biāo)志物。血清CA19-9有較高的敏感性，但其在多種非PC的疾病中均會有升高（如胃腸道腫瘤、合并黃疸的膽道疾病等）。約10%的患者因Lewis抗原陰性而不表達(dá)CA19-9，因此單獨(dú)依靠CA19-9對于PC早期診斷價值有限［14-16］。

近年來，CTCs在PC早期診斷中的價值日益受到重視。Rhim等［17］在PC癌前病變（導(dǎo)管內(nèi)上皮內(nèi)瘤變，PanIn）的小鼠外周血中已經(jīng)可以檢測到單個突變細(xì)胞。隨后的臨床驗證性研究中發(fā)現(xiàn)［18］，33%胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀腫瘤（intraductal papillary mucinous neoplasms，IPMN）和黏液性囊腺瘤（mucinous cystic neoplasm，MCN）患者的外周血中可檢測到CTCs，73%胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者的外周血中可檢測到CTCs。而正常對照組健康受試者的外周血中均未檢測到CTCs。Liu等［19］對95例PDAC患者和48例健康患者的外周血進(jìn)行CTCs檢測，結(jié)果顯示PDAC患者的CTCs總數(shù)和亞型的數(shù)目均顯著增加，CTCs亞型在PC早期診斷中的潛在價值。Ankeny等［20］對72例確診為PDAC患者的外周血進(jìn)行CTCs檢測，其中54例檢測到了CTCs（敏感性為75.0%，特異性為96.4%）。Sefrioui等［21］發(fā)現(xiàn)CTCs診斷胰腺良惡性疾病的敏感性和特異性分別為67%和80%，而當(dāng)CTCs聯(lián)合CA19-9時，敏感性和特異性可提高到78%和91%，表明CTCs聯(lián)合其它標(biāo)志物可用于PC的早期診斷。Wei等［22］也發(fā)現(xiàn)Vimentin陽性的CTCs聯(lián)合CA19-9可提供良好的PC診斷效能，受試者曲線下面積可達(dá)到0.968。而筆者所在中心的研究也得出了類似的結(jié)果［23］。盡管缺乏更大樣本的前瞻性研究，但現(xiàn)有的結(jié)果已經(jīng)證實(shí)了CTCs作為新型診斷標(biāo)志物應(yīng)用于臨床的可行性。

2 CTCs與PC的療效監(jiān)測

當(dāng)前，新輔助化療和輔助化療在PC的綜合治療中發(fā)揮著重要的作用。隨著CTCs富集及檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，于PC患者化療前后檢測CTCs，可以從細(xì)胞水平進(jìn)行實(shí)時評價，動態(tài)地監(jiān)測腫瘤的進(jìn)展和藥物的療效［24］。在一項PDAC的PDX小鼠隨機(jī)接受安慰劑或磷脂酰肌醇-3-激酶抑制劑BKM120治療的臨床前研究中，BKM120組治療后CTCs計數(shù)下降明顯且與腫瘤生長抑制相關(guān)，而安慰劑組則無明顯變化。表明CTCs可作為一種較為理想的監(jiān)測治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物［25］。一項前瞻性的臨床研究納入了37例接受吉西他濱聯(lián)合白蛋白紫杉醇化療的晚期PDAC患者，在治療前、后兩個月以及疾病進(jìn)展時富集外周血CTCs，并檢測其基因表達(dá)結(jié)果顯示治療后SMAD4的表達(dá)上調(diào)提示更好的治療效果以及更長的無進(jìn)展生存期［26］。Wei等［22］檢測了患者采用改良的FOLFIRINOX方案或者吉西他濱聯(lián)合白蛋白紫杉醇化療前后的外周血CTCs，結(jié)果顯示腫瘤縮小或穩(wěn)定的患者CTCs計數(shù)下降或保持不變，而腫瘤進(jìn)展患者的CTCs計數(shù)并沒有下降，提示CTCs可監(jiān)測化療療效。Ren等［27］比較了41例Ⅲ、Ⅳ期PDAC患者經(jīng)5-FU化療前后外周血CTCs的差異，結(jié)果顯示治療后CTCs的檢出率和數(shù)目均明顯下降，并可以檢測到凋亡的CTCs，提示凋亡的CTCs可預(yù)示PC的化療療效。對于PC新輔助和轉(zhuǎn)化治療中，常規(guī)的影像學(xué)檢查只能對原發(fā)病灶進(jìn)行評估，而不能反映全身腫瘤負(fù)荷的變化，然而通過動態(tài)監(jiān)測CTCs，有望對化療療效進(jìn)行監(jiān)測，從而確定最佳手術(shù)時間［28］。

3 CTCs與PC的預(yù)后評估

CTCs是從原發(fā)腫瘤組織進(jìn)入血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，少數(shù)的CTCs可以導(dǎo)致微轉(zhuǎn)移，極少數(shù)的CTCs最終可以形成轉(zhuǎn)移病灶，因此CTCs可作為PC預(yù)后評估和復(fù)發(fā)監(jiān)測的潛在生物標(biāo)志物［29］。Court等［30］采用微流控納米技術(shù)檢測CTCs，并研究其在預(yù)后評估中的價值，結(jié)果顯示24.5%的可切除PC患者術(shù)中發(fā)現(xiàn)了隱匿性轉(zhuǎn)移灶。術(shù)前CTCs可有效診斷隱匿性轉(zhuǎn)移灶患者，且與術(shù)后無復(fù)發(fā)生存率相關(guān)。Song等［31］在一項前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，對于可切除PDAC術(shù)前外周血中CTCs計數(shù)少于1個的患者總生存期（overall survival，OS）可達(dá)到35.5個月，而1個以上CTCs的患者只有16個月，提示CTCs計數(shù)可作為可切除PDAC的生存預(yù)后指標(biāo)。最新的一項薈萃分析納入了19項研究和1320例患者，結(jié)果顯示CTCs陽性PC患者的OS和無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）均明顯縮短，以檢測方法、治療方法和TNM分期進(jìn)行的亞組分析可得出同樣的結(jié)果［32］。循環(huán)腫瘤微栓子（circulating tumor microemoli，CTM）是CTCs的聚集體，與CTCs相比有著不同的表型和分子特征，表現(xiàn)出了更高的轉(zhuǎn)移潛能。因此，同樣可成為一種新的預(yù)后標(biāo)志物［33］。一項納入63例PDAC患者的前瞻性研究中，81%患者的外周血中檢測到CTM。預(yù)后分析顯示治療前CTM數(shù)量是PDAC患者PFS和OS的獨(dú)立預(yù)測因子［34］。Wu等［35］同樣發(fā)現(xiàn)對于可切除PDAC，術(shù)前外周血中存在CTM提示預(yù)后不良，建議對此類患者進(jìn)行術(shù)前評估時應(yīng)全面考慮。

除計數(shù)之外，CTCs的表型和分子生物特征同樣可作為預(yù)測生存的標(biāo)志物。在表型方面，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是一種表型改變，表現(xiàn)為上皮特征的喪失和侵襲性間質(zhì)屬性的獲得，與腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散有關(guān)［36］。EMT是一個動態(tài)的過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤組織脫落并進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)［37］。因此，EMT現(xiàn)象使得PC的CTCs主要分為上皮表型和間質(zhì)表型兩種亞型。有研究顯示，這兩種亞型的CTCs具備不同的分子生物學(xué)特征，與臨床預(yù)后的關(guān)系也不盡相同［38］。Poruk［39］等收集50例PDAC患者術(shù)前的外周和門靜脈血樣，先通過ISET系統(tǒng)富集CTCs，再通過免疫熒光法區(qū)分出cytokeratin陽性（上皮表型）和vimentin陽性（間質(zhì)表型）的CTCs，結(jié)果顯示39例患者CTCs cytokeratin陽性。其中26例同時表達(dá)vimentin，cytokeratin陽性的CTCs提示患者生存期較短，是生存預(yù)后的重要獨(dú)立預(yù)測因子，vimentin和cytokeratin均為陽性的CTCs與術(shù)后較短的復(fù)發(fā)時間有關(guān)。因此，在運(yùn)用CTCs評價預(yù)后時，應(yīng)考慮CTCs的EMT現(xiàn)象，既不能僅分析上皮表型的CTCs，還應(yīng)考慮間質(zhì)表型的CTCs。而在分子生物特征方面，Amantini［40］等富集了20例局部晚期或轉(zhuǎn)移性PC患者化療前后的CTCs并采用數(shù)字PCR技術(shù)對CTCs進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，結(jié)果顯示以ALCAM、POU5F1B和SMO mRNAs高表達(dá)為特征的患者PFS和OS更短。Sergeant［41］等從10名手術(shù)PDAC患者中富集CTCs，RNA雙線性擴(kuò)增后進(jìn)行全基因組芯片分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTCs中表達(dá)率最高的是參與腫瘤細(xì)胞遷移的p38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）信號通路，而與細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)基因的高表達(dá)與OS和無病生存期（disease-free survival，DFS）相關(guān)。Poruk［42］等首先通過免疫熒光法鑒定表達(dá)cytokeratin、CD133、CD44和ALDH等不同表型的CTCs結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALDH陽性、三重陽性（cytokeratin、CD133和CD44）和雙重陽性（cytokeratin和CD133）是腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測因子，并與DFS降低相關(guān)。

肝臟是PC最常見的轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)的部位，而肝轉(zhuǎn)移也是導(dǎo)致PC預(yù)后較差的重要原因之一［43］。門靜脈直接回流胰腺的靜脈血至肝臟，理論上CTCs在門靜脈血中更易被檢出，可作為預(yù)測PC患者肝轉(zhuǎn)移和術(shù)后生存的潛在標(biāo)志物［44］。White［45］等在一項前瞻性的臨床研究中，對于可切除PDAC患者于術(shù)前收集外周血以及腫瘤切除前后分別收集門靜脈血進(jìn)行CTCs檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)門靜脈血中的CTCs與患者術(shù)后的OS明顯相關(guān)，門靜脈血中未檢測到CTCs的患者術(shù)后18個月的總生存率可達(dá)到100%。Tao［46］等同樣發(fā)現(xiàn)基于流式細(xì)胞術(shù)檢測的門靜脈血CTCs可預(yù)測PC或壺腹部周圍癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移。隨著超聲內(nèi)鏡技術(shù)的進(jìn)步，門靜脈血CTCs的檢測進(jìn)一步得到了推廣應(yīng)用。2015年的一項單中心的隊列研究中，超聲內(nèi)鏡技術(shù)已被證實(shí)應(yīng)用于門靜脈血的采集以進(jìn)行CTCs檢測是安全可行的，患者并無相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生［47］。最新的一項研究表明，經(jīng)超聲內(nèi)鏡獲得門靜脈血檢測的CTCs是胰膽管癌患者PFS和OS的顯著預(yù)測因子（cut-off值為185 CTCs/7.5 mL）［48］。而門靜脈血中CTCs的高數(shù)量和高活性則被證實(shí)與門靜脈血的免疫環(huán)境有關(guān)。Arnoletti［49］等發(fā)現(xiàn)，與外周血相比，PDAC手術(shù)前后的門靜脈血中CTCs均具有更高水平的KRASmut mRNA表達(dá)，且在腫瘤切除后并無明顯變化，同時門靜脈血中的免疫抑制細(xì)胞亞群（M-MDSC）數(shù)量也高于外周血。而CTCs數(shù)量也與K-RASmut mRNA表達(dá)和M-MDSC水平呈正相關(guān)，提示門靜脈血中免疫抑制環(huán)境可能促進(jìn)CTCs的存活。該團(tuán)隊進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，門靜脈血中分離的CTCs經(jīng)體外培養(yǎng)7天后，PDAC患者的CTCs招募了多種免疫細(xì)胞類型以形成橢圓形簇，并可促進(jìn)CTCs的存活、生長。表明CTCs在門靜脈循環(huán)中的存活可能是由于它們與多細(xì)胞類型簇中的免疫細(xì)胞相互作用，同時多細(xì)胞類型簇可能代表局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移進(jìn)展的載體［50］。

CTCs作為“液體活檢”的重要組成部分，近年來受到越來越多的關(guān)注和重視，其對PC的早期診斷、療效監(jiān)測及預(yù)后評估都有著顯著的臨床價值。隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步，將來有望利用循環(huán)血實(shí)時檢測CTCs來替代腫瘤組織活檢。且微量組織基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的進(jìn)步也使對CTCs的認(rèn)識也從簡單的數(shù)量鑒定提高到對分子特征的研究。但目前CTCs在臨床上的推廣應(yīng)用仍需對富集、檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)性和功能性分析的可靠性進(jìn)行更加深入和細(xì)致的探究，同時需要大樣本的前瞻性研究進(jìn)行驗證。