食品中志賀菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

韋麗琴

（天峨縣疾病預(yù)防控制中心，廣西 河池，547300）

志賀菌?。⊿higellosis），也稱桿菌性痢疾，是一種主要由志賀菌（Shigella spp.）引起的急性直腸-結(jié)腸炎，臨床癥狀表現(xiàn)為水樣泄，粘液膿血便，里急后重，部分患者有劇烈頭痛、嗜睡、意識(shí)模糊、驚厥等神經(jīng)癥狀。近年來，隨著生活方式與飲食結(jié)構(gòu)的不斷改變，我國(guó)感染志賀菌幾率逐漸增加，據(jù)調(diào)查，全世界每年有1.6 億左右人感染志賀菌，有110 萬人左右因志賀菌死亡，其中以兒童最為常見[1]。在我國(guó)，志賀菌感染患病率為百萬分之六十五[2-3]。食品中志賀菌主要是經(jīng)過食用被志賀菌污染的食物而感染疾病，以全身中毒癥狀、大腸化膿性炎癥以及潰瘍等為主要臨床特征，其主要經(jīng)過消化道途徑傳播，侵襲腸上皮細(xì)胞，進(jìn)而引起發(fā)熱、腹瀉、腹脹等癥狀，對(duì)患者身體健康與生命安全造成嚴(yán)重影響。目前最常用的志賀菌增菌液培養(yǎng)志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株研究中，發(fā)現(xiàn)部分志賀菌生長(zhǎng)量顯著低于大腸桿菌等，且延遲期也較為落后。同時(shí)在普通校驗(yàn)培養(yǎng)基中部分痢疾志賀菌與鮑氏志賀菌生長(zhǎng)不良，造成雜菌較多，因此極易引發(fā)誤檢與漏檢[4]。故針對(duì)食品中志賀菌采取高效、準(zhǔn)確性高的檢測(cè)方法，對(duì)疾病的防控具有重要意義。現(xiàn)將食品中志賀菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展做一綜述。

1.食品中志賀菌檢測(cè)方法

近年來，隨著生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)不斷發(fā)展，食品中志賀菌檢測(cè)與鑒定技術(shù)也在逐漸完善，其中包括常規(guī)生化檢測(cè)、快速生物檢測(cè)儀器法、免疫學(xué)檢測(cè)以及分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.1 常規(guī)檢測(cè)技術(shù)

食物中志賀菌檢測(cè)方式以國(guó)標(biāo)法（GB 4789.5-2014）為主要檢測(cè)方式，檢驗(yàn)程序：增菌、選擇性增菌、選擇性平板分離培養(yǎng)，革蘭氏染色、鏡檢，生化試驗(yàn)與血清學(xué)分離鑒定。此種檢測(cè)方式主要為微生物培養(yǎng)法，操作方式較為繁瑣，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，且靈敏度、特異度較低[5]；同時(shí)一次檢測(cè)完成樣品項(xiàng)數(shù)較少，無法應(yīng)對(duì)市場(chǎng)迅速、準(zhǔn)確檢驗(yàn)方式的需求，但這種檢測(cè)方式具有直觀、穩(wěn)定性佳、假陽(yáng)性率低等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)標(biāo)法實(shí)施常規(guī)生化鑒定方式對(duì)食物中志賀菌進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過程需4～5d。相關(guān)報(bào)道顯示，經(jīng)過對(duì)SS、Mac、HE 以及MT 培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果得出，SS 培養(yǎng)基對(duì)食物中志賀菌檢出率比較高，為降低漏檢、誤診等發(fā)生率，可同時(shí)使用Mac 培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)，以提升檢測(cè)準(zhǔn)確性與檢出率。

1.2 快速生物檢測(cè)儀器法

微生物自動(dòng)化檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)便、便捷、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，是微生物檢測(cè)發(fā)展方向之一。國(guó)內(nèi)外已有多種全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)問世[6]。例如Autoseptor 系統(tǒng)、Sensititre 系統(tǒng)、vitek一Ams 系統(tǒng)、Vitek 系統(tǒng)以及Midd 系統(tǒng)。其中法國(guó)生物梅里埃公司的Vitek-Ams 系統(tǒng)是眾多全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)里唯一被美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）定為的標(biāo)準(zhǔn)方式，此系統(tǒng)是以每種細(xì)菌的微量生化反應(yīng)為基礎(chǔ)，儀器定時(shí)自動(dòng)檢測(cè)微量培養(yǎng)基的發(fā)酵情況，計(jì)算機(jī)依據(jù)接收的發(fā)酵資料實(shí)施換算，并與數(shù)據(jù)庫(kù)所得檢驗(yàn)結(jié)果實(shí)施對(duì)比[7]。

1.3 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

隨著免疫學(xué)逐漸完善，以最初凝聚試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)以及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等免疫學(xué)檢驗(yàn)方式，到先進(jìn)酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡等方式，為迅速檢驗(yàn)志賀菌提供了新的檢測(cè)技術(shù)。

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）主要是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)以及酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種的敏感性較高試驗(yàn)技術(shù)。相關(guān)研究顯示，ELISA 具有較高的敏感性以及特異性，所有可溶性的抗體抗原反應(yīng)系統(tǒng)均可檢測(cè)，最小檢測(cè)值可達(dá)至微克水平[8]。該檢測(cè)方式與放射免疫方式對(duì)比，ELISA 的標(biāo)記試劑較為穩(wěn)定，同時(shí)無放射性損傷[9]。

1.3.2 免疫印跡

免疫印跡又可稱之為蛋白質(zhì)印跡，其是一種利用特異性抗體鑒定抗原方式，使用免疫印跡方式檢測(cè)無需采取特殊設(shè)備，且操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)準(zhǔn)確性較高。相關(guān)研究顯示，使用IPaC 蛋白單克隆抗體免疫印跡方法檢測(cè)大便樣品中的大腸埃希菌與志賀菌，結(jié)果顯示，其與PCR 方式檢測(cè)IPaC 蛋白基因結(jié)果相一致[10]。

1.4 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)建立的眾多檢驗(yàn)技術(shù)，以其迅速、準(zhǔn)確以及高特異性等優(yōu)點(diǎn)成為生物技術(shù)革命的新產(chǎn)物，已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)中。隨著微生物學(xué)、分子生物學(xué)以及生物化學(xué)等迅猛發(fā)展，對(duì)病原微生物鑒定已不再局限于對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理特性等實(shí)施檢驗(yàn)，以此從分子生物學(xué)水平上對(duì)生物大分子進(jìn)行研究，尤其是在核酸結(jié)構(gòu)與其組成部分。在此基礎(chǔ)上建立多種檢驗(yàn)技術(shù)。其中包括聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)、基因芯片等，逐漸應(yīng)用于食源性病原菌的迅速檢驗(yàn)中。

1.4.1 常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

常規(guī)PCR 主要采取瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下檢查結(jié)果，其結(jié)果主要經(jīng)過目測(cè)有無擴(kuò)增條帶實(shí)施判斷，因此存在一定的主觀性。常規(guī)PCR 需明確待擴(kuò)增目的片段的序列，依據(jù)此序列設(shè)計(jì)一對(duì)應(yīng)引物。相關(guān)報(bào)道顯示，將志賀菌ipaH 基因序列作為靶目標(biāo)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物（5’GTTCCTTGACCGC-CTTTCCGATAC-3’與5’GCCGGTCAGCCACCCTA-3’），擴(kuò)增產(chǎn)物為700bp，其對(duì)臨床上疑似菌痢的糞便標(biāo)本實(shí)施檢測(cè)，并以PCR 為金標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)法敏感性、特異性分別為72%與100%[11]。

1.4.2 RT-PCR

RT-PCR 技術(shù)主要是在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，選用熒光信號(hào)對(duì)PCR 整個(gè)進(jìn)程實(shí)時(shí)檢測(cè)，隨后經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析未知模板[12]。熊輝[13]研究顯示，對(duì)2700 份肛拭子樣本使用雙色RT-PCR 法檢測(cè)志賀菌，結(jié)果顯示，雙色RT-PCR 檢出率0.11%高于培養(yǎng)法0.00%。盡管RT-PCR 檢測(cè)成本較高于熒光探針保持時(shí)間較短，但在線式采取檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱改變，可有效避免常規(guī)PCR 受多因素干擾影響。

1.4.3 質(zhì)粒圖譜分析

質(zhì)粒圖譜主要是經(jīng)過分析細(xì)菌中所攜帶的質(zhì)粒分子量，以及其在電泳道上形成圖譜特點(diǎn)鑒定細(xì)菌的技術(shù)。因同源性菌株所攜帶的質(zhì)粒相似，故常采取檢測(cè)質(zhì)粒圖譜的方式分析細(xì)菌來源及其某些遺傳性狀。質(zhì)粒圖譜分析方式是一種簡(jiǎn)便、迅速以及可靠的檢測(cè)方式，故使用此種方式對(duì)志賀菌實(shí)施分子流行病學(xué)研究，有利于追蹤傳染源與掌握流行株的耐藥情況，以此為臨床治療、菌痢的檢測(cè)提供有效的理論依據(jù)[14]。

1.4.4 核糖體分型

核糖體16S rRNA 分型也是制定志賀菌亞型的分子生物學(xué)方式，其主要是借助限制性內(nèi)切酶將核糖體16S rRNA 核酸序列裂解為若干片段，使用電泳方式對(duì)片段進(jìn)行分離，同時(shí)將不同來源菌株進(jìn)行結(jié)果對(duì)比，對(duì)不同菌株間變異特點(diǎn)進(jìn)行分析，以此為流行病學(xué)提供有效的理論依據(jù)。但核糖體分型在檢測(cè)志賀菌中效果并不佳，此種方式分型效力與質(zhì)粒圖譜不同，多種不同來源的志賀菌使用質(zhì)粒圖譜可分為若干型別，但使用核糖分型卻無法顯示出[15]。

1.4.5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）

PFGE 是目前實(shí)施志賀菌流行病學(xué)分析最常用方式之一，其主要是借助限制性內(nèi)切酶識(shí)別核酸序列上的特異位點(diǎn)，其將整個(gè)細(xì)菌染色體組裂解分為若干片段，經(jīng)過脈沖場(chǎng)電泳分離成像，通過不同圖型間對(duì)比，以此對(duì)同一菌種亞型的不同菌株來源及其特點(diǎn)進(jìn)行分析。雷高鵬[16]研究顯示，對(duì)30 株宋內(nèi)志賀菌實(shí)施PFGE 分型分析，結(jié)果顯示，2007-2017 年四川省腹瀉病例宋內(nèi)志賀菌分離株P(guān)FGE 優(yōu)勢(shì)帶型明顯，且部分帶型存在聚集。病原菌基因片段位置與大小表現(xiàn)存在多態(tài)性，對(duì)志賀菌分離株之間的同源性、傳染源追溯、疫情預(yù)測(cè)、防治措施提供有效的理論依據(jù)。

1.4.6 基因探針雜交與基因蕊片

基因探針是使用人工合成的方式從微生物中制備相應(yīng)的DNA 片段，進(jìn)行純化后標(biāo)記上同位素、熒光物質(zhì)以及生物等，進(jìn)而制成特異性DNA 探針，經(jīng)過對(duì)待測(cè)樣本、標(biāo)志性DNA 探針之間能否形成雜交分子進(jìn)行檢測(cè)，以此對(duì)樣品中是否存在目標(biāo)微生物進(jìn)行評(píng)估。但極易引起假陽(yáng)性，不利于應(yīng)急處理的迅速檢測(cè)。而基因芯片主要是使用原位合成或顯微打印方式，將數(shù)以萬計(jì)的DNA 探針固化在支持物表面，以此產(chǎn)生二維DNA 探針陣列，與標(biāo)志的物品實(shí)施雜交，經(jīng)過檢測(cè)雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品迅速、并行以及高效檢測(cè)或醫(yī)學(xué)診斷?；蛐酒夹g(shù)具有一定的敏感性高、特異性強(qiáng)以及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，其在腸道致病菌檢測(cè)中具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

2.小結(jié)

目前針對(duì)食品中志賀菌的檢測(cè)方式，主要包括常規(guī)生化檢測(cè)、快速生物檢測(cè)儀器法、免疫檢測(cè)法、分子生物學(xué)方式等，上述的檢測(cè)方式均有其各自優(yōu)缺點(diǎn)，其中ELISA 在檢測(cè)食品中志賀菌中具有操作簡(jiǎn)便、迅速以及準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，并已在臨床中廣泛應(yīng)用。因此在檢驗(yàn)食品中志賀菌中，應(yīng)充分掌握各種檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用范圍、局限性等，同時(shí)結(jié)合實(shí)際情況，不斷完善、改進(jìn)食品中志賀菌檢測(cè)方式。同時(shí)還需建立、健全食品法律法規(guī)，以增強(qiáng)食品安全監(jiān)控，以提升檢測(cè)技術(shù)，促使食品快速檢測(cè)技術(shù)達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。